PLOS ONE: Mycoplasma hyorhinis Aktiverar NLRP3 Inflammasome och främjar migration och invasion för magcancer Cells

Abstrakt

Bakgrund

Mycoplasma hyorhinis
( M.hyorhinis , M.hy
) är förknippad med utveckling av mag- och prostatacancer. NLRP3 inflammasome, ett proteinkomplex styra mognad viktiga proinflammatoriska cytokiner interleukin (IL) -1β och IL-18, är också involverad i tumörbildning och metastas av olika cancerformer.

Metodik /viktigaste resultaten

för att klargöra huruvida M.hy
främjas tumörutveckling via inflammasome aktivering, analyserade vi monocyter för IL-1β och IL-18 produktion på M.hy
utmaning. När de utsätts för M.hy
, humana monocyter uppvisade snabb och robust IL-1β och IL-18 sekretion. Vi identifierade också att lipid-associerat membranprotein (LAMP) från M.hy
var ansvarig för IL-1β induktion. Tillämpa konkurrerande hämmare, genspecifik shRNA och gen riktade möss verifierade vi att M.hy
inducerad IL-1β sekre var NLRP3 beroende In vitro Mössor och In vivo
. Katepsin B-aktivitet, K ^{+ utflöde, Ca 2 + inflöde och ROS-produktionen var alla nödvändiga för NLRP3 inflammasome aktivering av M.hy
. Viktigt är det IL-1β men inte IL-18 produceras av makrofager utmanade med M.hy
främjas magcancer cellmigration och invasion.}

Slutsatser

Våra data tyder att aktivering av NLRP3 inflammasome av M.hy
kan vara förknippade med främjandet av magcancer metastaser, och anti- M.hy
terapi eller begränsa NLRP3 signalering kan vara effektiv metod för kontroll av magcancer framsteg

Citation. Xu Y, Li H, Chen W, Yao X, Xing Y, Wang X, et al. (2013) Mycoplasma hyorhinis
Aktiverar NLRP3 Inflammasome och främjar migration och invasion av Gastric cancerceller. PLoS ONE 8 (11): e77955. doi: 10.1371 /journal.pone.0077955

Redaktör: Suresh Yenugu, University of Hyderabad, Indien

Mottagna: 5 juni 2013, Accepteras: 6 september 2013, Publicerad: 6 november 2013

Copyright: © 2013 Xu et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete har finansierats med bidrag från 100 Talent Program Chinese Academy of Sciences, Natural Science Foundation i Kina (91.029.707, 31.170.868), Shanghai Natural Science Foundation (11ZR1442600), Novo Nordisk-CAS Research Foundation, SA-SIBS Scholarship Program, liksom bidrag från den nationella viktiga program på Smittskydds (2012ZX10002007-003). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Mycoplasma är pleomorfa, vägg gratis, prokaryota organismer som bor antingen på eukaryota cellmembran eller inuti cellerna, och de är de minsta organismerna kan självreplikeringen [1]. Hittills har minst 16 mykoplasmaarter isolerats från människor [2]. Mycoplasma hyorhinis
( M.hy
) ansågs icke-patogen för människor eftersom det smittar oftast svin leder till luftvägssjukdom och inflammation i bröstet och leder [3], [4] . Men ackumulera tyder på att M.hy
infektion hos människa resulterar i kliniska resultat. M.hy
påträffades i 56% av magcancer, 55% av koloncancer och 52,6% av lungkarcinom biopsier [5]. Dessutom 36% män med godartad prostataförstoring (BPH) och 52% män med prostatacancer är M.hy
sero-positiv. Dessa kliniska fynd tyder på ett möjligt samband mellan M.hy
exponering med gastric, kolon-, lung- och prostatacancer [5], [6].

Efter mikrobiell infektion, erkännande receptorer värd mönster ( PRRs) såsom TLRs avkänna de patogener och utlösa syntesen av pro-inflammatoriska cytokiner, såsom pro-IL-1β och pro-IL-18 via NF-kB-aktivering. Samtidigt, en annan grupp av PRRs inklusive NLRP3 rekrytera adapterprotein ASC och leda till aktivering av kaspas-1, som är ett aktivt proteas som klyver prekursorformen av cytokiner inklusive pro-IL-1β och pro-IL-18 in i mogna, utsöndrade formen [7]. Patogener eller utmanande medel orsakar kaliumutflödet, mitokondrier skador, mitokondrier DNA release, ROS produktion, intracellulär ökning kalcium eller cellulärt cykliskt AMP minskning av medfödda immunceller, som alla är inblandade i kaspas-1-aktivering [8], [9], [10 ], [11], [12], [13]. Under denna process NLRP3, ASC och pro-kaspas-1 bildar en molekylär plattform som kallas inflammasome. Hittills har ett antal inflammasomes identifierats av dem, NLRP3 inflammasome har konstaterats i samband med tumörutveckling [14], [15], även om kontroverser finns från olika modeller [16], [17]. Icke desto mindre, var IL-1β rapporterats att främja tumörcelltillväxt och metastas genom att inducera flera pro-metastatiska gener såsom matrismetalloproteinaser och endoteliala adhesionsmolekyler, såväl som TGF-β, kemokiner och tillväxtfaktorer [18]. I en koreansk befolkning, kombinationen av ökad slemhinna IL-1β nivå och homozygositet för IL-1β -31T single nucleotide polymorphism (SNP) är båda förknippade med ökad risk för magcancer [18]. Vidare Tu et al. fann att magen specifikt uttryck av humant IL-1β i transgena möss ledde till spontan gastric inflammation och cancer [19], vilket ytterligare tyder på att IL-1β kan främja människors gastric cancer. I kontrast, IL-18 förstärker NK-cellaktivitet, reducerar tumorigenes, inducerar apoptos och inhiberar angiogenes i tumörceller för att utöva antitumöreffekter [20], [21]. Dessutom genomfördes en olämplig produktion av IL-18 befunnits bidra till patogenesen av cancer och kan påverka det kliniska resultatet av patienterna [22]. IL-18 rapporterades stimulera matrismetalloproteas-9 produktion, vilket resulterar i ökad migration och invasion i koronarartär glatta muskelceller och HL-60 myeloida leukemiceller [23], [24]. Det rapporterades också att serum IL-18 nivå i magcancer patientgrupp var betydligt högre än i magsår patientgrupp [25] och IL-18 kan öka metastaser och immun flykt av magcancer via nedreglering av CD70 och underhåll av CD44 i humana magcancer-cellinjen NCI-N87 och SNU16 [26]. Det är också en kritisk förmedlare av VEGF-förbättrad migration i humana gastriska cancercellinjer SNU-601 [27]. Ovanstående fynd tyder på att Mycoplasma hyorhinis
kan främja migration och invasion av gastric cancerceller genom att aktivera inflammasome.

Hittills ett brett spektrum av mikrober, inklusive virus, bakterier, svampar och protozoer har varit identifierats för att aktivera NLRP3 inflammasome [28]. En nyligen genomförd studie visade att Mycoplasma pneumoniae
kunde också inducera IL-1β i humana celler [29]. Men om M.hy
, vilket är en viktig faktor i magcancer utveckling som nämnts ovan [5], [30], [31], aktiverar NLRP3 inflammasome och om denna aktivering bidrar till magcancer utveckling fortfarande okända. I denna studie fann vi att M.hy
utlöste IL-1β sekretion i en NLRP3 inflammasome beroende sätt, och den resulterande IL-1β inducerade migration och invasion av gastric cancerceller.

resultat

M.hy
Triggers IL-1β och IL-18 Produktionen i THP-1 celler

För att avgöra om M.hy
inducerar IL -1β produktion från medfödda immunceller, övervakas vi mogna IL-1-nivåer i humana monocytiska cellinjen THP-1-celler utmanade med olika mängder av M.hy
. I detta experiment, var en stark induktion av IL-1β på ett dos-beroende sätt observerades (Figur 1A). Därefter mätte vi pro-IL-1β-mRNA-nivåer i cellerna och mogna IL-1β proteinnivåer i odlingssupernatanterna vid olika tidpunkter efter M.hy
utmaning. Det observerades att IL-1β-mRNA-nivåer nådde en topp på 3 timmar efter utmaningen (Figur 1B) och moget IL-1β (Figur 1C) och IL-18 (figur 1D) proteinnivåer nådde en topp på 12 timmar efter utmaning. Dessutom THP-1-härledda makrofager uppvisade även robust sekretion av IL-1β, IL-18 såväl som andra inflammatoriska cytokiner, såsom IL-6 och IL-8 (figur 1E, Figur S1). För att bekräfta ovanstående resultat i THP-1 cellinje undersökte vi IL-1β produktion i primära humana monocyter från friska donatorer utmanade med M.hy
, vari IL-1β var också starkt inducerade (figur 1F) . Dessa data indikerade att M.hy
utlöste robust IL-1β och IL-18-utsöndring från humana myeloidceller.

LAMP härrör från M.hy
är ansvarig för IL -1β Induktion genom TLR2

Nästa vi undersökt om replikering av M.hy
krävdes för IL-1β produktion i monocyter. Såsom visas i fig 2A, M
.hy
inaktiveras genom upphettning eller ultraviolett (UV) behandling inducerade lika mycket IL-1β-utsöndring från THP-1-celler som levande M .hy
. Detta indikerade att vissa värme- och UV-resistent komponent i M.hy
var ansvarig för induktion av IL-1β sekretion. Lipid-associerat membranprotein (LAMP) är rikligt uttryckt på ytan av M.hy
[32], och tidigare studie visade att membran lipoproteiner från andra mykoplasmaarter inducerad IL-1β sekre [33]. Vi spekulerade därför att M.hy
härrör LAMP (MLAMP) kan vara ansvarig för IL-1β induktion i THP-1-celler. Vi extraherades sedan LAMP från M.hy
(figur 2B) och testades förmågan hos MLAMP att inducera IL-1β sekretion i THP-1-celler. Vi fann att MLAMP klart inducerad sekretion av IL-1β i en dosberoende sätt, medan vattenfasen av M.hy
extrakt var inte kunna göra det (figur 2C). Att utesluta den möjliga RNA och /eller DNA-kontaminering i MLAMP, behandlade vi de MLAPMs med RNas och DNas och fann att MLAMP var huvudkomponenten med avseende på IL-1β-induktion (figur S2).

Det rapporterades att MLAMP huvudsakligen aktiverad NF-kB genom TLR2 och TLR6 [34], [35]. Därför ansökte vi först en TLR2 neutraliserande antikroppar T2.5 att blockera TLR2 signal, med ConT2 fungerar som en isotyp kontroll [36]. Såsom visas i figur 2D, T2.5 blockerad fullständigt IL-1β-utsöndring stimulerades genom TLR2 agonisten P3CSK4 men inte av de TLR4 ligand LPS. Viktigt, IL-1β sekre från M.hy
infekterade celler kraftigt minskat med T2.5, vilket tyder på att TLR2 var inblandad i MLAMP utlöste IL-1β sekretion i humana monocyter. Intressant nog IL-1β sekre från M.hy
infekterade celler inte helt blockerad av T2.5 (figur 2D), som föreslog att TLR2 oberoende signalväg också var inblandad i MLAMP utlöste IL-1β sekretion, som förtjänar ytterligare utredning i framtiden.

M.hy
inducerar IL-1β utsöndring genom Aktivering av NLRP3 Inflammasome

för att testa om M.hy
inducerad IL-1β utsöndring genom inflammasome aktivering, vi först utnyttjas LPS primade THP-1 härledda makrofager för att kontrollera om M.hy
kan aktivera inflammasome som ATP eller MSU, som är kända inflammasome aktivatorer. Som visas i figur 3A, M
.hy
kunde inducera IL-1β frisättning i primade cellerna. Nästa vi undersökte klyvning av kaspas-1 och oligomerisering av ASC, två viktiga beslutsfattare för inflammasome aktivering. Vi fann att M.hy
främjade klyvning av caspas-1 och oligomerisering av ASC (figur 3B), vilket indikerar en direkt aktivering av inflammasome av M.hy.

Dessutom undersökte vi om M.hy
inducerad IL-1β sekre var beroende av vissa inflammasome komponenter. Först har vi funnit att den specifika kaspas-1-inhibitor AC-YVAD-CHO minskade IL-1β sekretion i THP-1-celler i en dosberoende sätt (figur 3C). Nästa, när specifika shRNA användes för att tysta uttrycket av kaspas-1 och ASC (figur 3D), var IL-1β produktionen minskade kraftigt på M.hy
utmaning (figur 3E), vilket indikerar att M.hy
inducerad IL-1β sekre var beroende av kaspas-1 och ASC.

Sedan undersökte vi om NLRP3 krävdes för M.hy
inducerad IL-1β sekretion. Först, fann vi att NLRP3 hämmaren Glybenclamide tryckt M.hy
inducerad IL-1β sekretion i ett dosberoende sätt (Figur 3F) [37]. När specifika shRNA användes för att tysta ett uttryck för NLRP3 (figur 3G), var IL-1β produktionen minskade kraftigt på M.hy
utmaning (figur 3H), vilket indikerar att M.hy
inducerad IL-1β-utsöndring var beroende NLRP3. Detta bekräftades ytterligare genom immunoblotting, där kaspas-1 aktivering och IL-1β produktion var både NLRP3 beroende (Figur 3I). Dessutom fann vi vidare att MLAMP var huvudkomponenten som ansvarar för NLRP3 inflammasome aktivering av M.hy
(Figur S2C). Dessutom har AIM2 inflammasome rapporterades att aktiveras av DNA [38], och vi fann att M.hy
DNA-inducerad IL-1β sekretion via AIM2 inflammasome (Figur S3A). Intressant, M.hy
inducerad IL-1β sekre främst beroende NLRP3, medan AIM2 var endast delvis involverad (Figur S3A). Sammantaget visar dessa resultat tydligt att M.hy
inducerad IL-1β sekre genom aktivering av NLRP3 inflammasome i humana monocytiska celler.

mekanismerna bakom M.hy
utlöst NLRP3 inflammasome Aktivering

Aktivering av NLRP3 inflammasome genom en mängd olika stimuli är beroende av Katepsin B-aktivitet, K ^{+ efflux, kalciuminflöde och /eller produktion av reaktiva syrespecies (ROS) [11], [ ,,,0],12], [13], [39]. Att undersöka mekanismerna bakom IL-1β frisättning som svar på M.hy
utmaning, vi först tillämpas Cathepsin B-specifik hämmare CA-074 Me och observerade en betydande dämpning av IL-1β sekre på M .hy
utmaning. Vid en koncentration av 100 | iM, CA-074 Me helt blockerade IL-1β frisättning (Figur 4A). Denna hämning var inte på grund av någon toxisk effekt på cellerna som IL-8-utsöndring påverkas av denna inhibitor var mycket mild (Figur 4E). Viktigare, när cellerna behandlades med cathepsin K-hämmare jag, var minskningen av IL-1β sekre inte uppenbart alls (figur 4B och 4F), vilket tyder på att Katepsin B aktivitet specifikt involverad i NLRP3 inflammasome aktivering under M .hy
utmaning. Dessutom, när vi blockerade K + utflöde genom att öka extracellulära K + koncentration, IL-1β sekre av THP-1-celler vid M.hy
utmaning reducerades signifikant på ett dos- beroende sätt (Figur 4C). Återigen, det fanns ingen toxisk effekt från KCL som IL-8-produktion från samma celler normal (Figur 4G). Ta reda på om kalciuminflöde hjälpte inflammasome aktivering, har vi lagt till olika doser av EGTA i cellodlingsmediet och fann att EGTA behandling blockerat M.hy
inducerad IL-1β sekretion i ett dosberoende sätt, och ingen toxisk effekt från EGTA observerades som framgår av IL-8-produktion (Figur 4D och 4H).}

Dessutom testade vi om M.hy
utmaning inducerad ROS generation i THP-1-celler . För denna analys var THP-1-celler först laddas med redox-känslig fluorofor DCFDA och utmanades sedan med M.hy
, ATP inkluderades som en positiv kontroll. Som visas i figur 5A, var 16,9% CM-H2DCFDA positiva celler detekterades 30 minuter efter M.hy
behandling jämfört med 1,6% hos obehandlade celler. Dessa data antydde att ROS kan bidra till NLRP3 inflammasome aktivering som svar på M.hy
utmaning. Att kontrollera denna möjlighet, förbehandlade vi THP-1-celler med ROS-hämmare difenyljodonium (DPI) under 30 minuter, och därefter utmanade cellerna med M.hy
före mätning av IL-1β produktion 6 timmar senare. Som väntat, DPI minskade dramatiskt M.hy
inducerad IL-1β frisättning (figur 5B). En nyligen genomförd studie visade att ROS-hämmare såsom DPI avskaffas IL-1β release i mus makrofager genom att hämma NLRP3 genuttryck [40]. Därför övervakade vi också mRNA-nivån av pro-IL-1β och NLRP3 enligt DPI behandling. Vi fann att DPI minskade markant expressionen av pro-IL-1β och NLRP3 (figur 5C-D), vilket var i överensstämmelse med konstaterandet från musceller [40]. Dessutom undersöktes också vi aktiveringen av kaspas-1 och fann att låga doser (1 eller 10 | iM) av DPI behandling påverkade inte kaspas-1-aktivering medan 100 iM av DPI inhiberade kaspas-1 aktivering (Figur 5E). Detta visade att DPI i humana celler stört NLRP3 inflammasome aktivering genom hämning av NLRP3 transkription samt kaspas-1 aktivitet när hög dos anbringades. Sammantaget antyder dessa data att Katepsin B-aktivitet, K ^{+ utflöde, Ca 2 + inflöde och ROS bidrog till NLRP3 inflammasome aktivering som svar på M.hy
utmaning.}

M.hy
Aktiverar NLRP3 Inflammasome in vivo

När mus benmärgs härledda dendritiska celler (BMDCs) infekterades med M.hy
ades en ihållande IL-1β induktion observerades (Figur 6A). Ytterligare experiment på BMDCs isolerade från vildtyp (WT) möss eller möss med brist för kaspas-1, ASC eller NLRP3 med M.hy
utmaning bekräftade att M.hy
induktion av IL- 1β var NLRP3 inflammasome beroende (Figur 6B). Vidare systemisk ympning av M.hy
i WT möss inducerade IL-1β produktion i serum och peritoneal lavage (PLF), men inte i möss som saknar ASC eller NLRP3 (Figur 6C-D). Interestingly, den basala nivån av IL-1β i ASC brist möss var klart högre än den i WT eller NLRP3 brist möss, men utmaning med M.hy
inte ytterligare öka utsöndringen av IL-1β i sådana möss (Figur 6C-D). Sammantaget bekräftade dessa fynd att M.hy också
aktiverad NLRP3 inflammasome i möss In vitro Mössor och In vivo
.

M. hy
Induced IL-1β Främjar Gastric Tumör Cell Migration och Invasion

Ovanstående stående~~POS=HEADCOMP data visade tydligt att M.hy
kunde inducera IL-1β produktion från medfödda immunceller genom NLRP3 inflammasome aktivering. Tidiga epidemiska studier avslöjade en möjlig roll för mykoplasma i utvecklingen av magcancer [5]. Och Mycoplasma hyorhinis
visades att främja tumörcellvandring, invasion och metastas In vitro Mössor och In vivo
[41]. Vi antar att det kan finnas en annan mekanism för denna kampanj, vilket är att M.hy
kan främja gastric cancer och /eller metastaser genom att främja IL-1β produktion. Och vi bekräftat att M.hy
främjas magcancer cell migration och invasion (figur S5). Eftersom M.hy
demonstrerades att infektera gastriska cancerceller ([41], figur S4), är det således möjligt att M.hy
kan inducera inflammasome aktivering i cancerceller direkt. Men ingen inflammasome aktivering detekteras i gastric cancerceller (Figur S6).

Vi nästa bestäms effekten av humant rekombinant IL-1β (rIL-1β) på gastric cancercell cancer i en kolonibildningsanalys, som visade att rIL-1β inte påverka spridningen av magcancer cellinje MGC-803 (Figur S7). Eftersom IL-1β rapporterades att främja metastas av andra tumörer [18], vi kontrollerat effekterna av rIL-1β på migration och invasion av MGC-803 celler. Våra resultat visade att MGC-803 migration och invasion var förstärkt med rIL-1β-behandling (figur 7A och 7C), medan behandling med rIL-18 inte visade någon effekt (Figur 7B och 7D). Därefter behandlade vi dessa gastric cancerceller med odlingssupernatanterna från M.hy
utmanade THP-1-härledda makrofager eller makrofager med tysta NLRP3, ASC och kaspas-1 för migration och invasion analys. Våra resultat visade att odlingssupernatanterna från M.hy
utmanade scramble makrofagceller starkt förbättrade migration och invasion av gastriska cancerceller, medan odlingssupernatanterna från NLRP3, ASC eller kaspas-1-knockdown makrofager inte gjorde det, sannolikt på grund av den minskade IL-1β sekretion (figur 8A och 8C). Denna förbättrade migration och invasion av MGC-803 celler avskaffades genom att behandla cellerna med anti-IL-1β mAb (figur 8B och 8D). Sammantaget visade våra resultat som M.hy
inducerad migration och invasion av magcancer cellinje MGC-803 genom att främja IL-1β sekretion från monocytiska celler. Dessutom indikerade våra data att M.hy
inducerad inflammasome aktivering kan främja M.hy
replikation (figur S8), som kan skapa en positiv feedback och slutligen leder till kroniska sjukdomar.

Diskussion

Mycoplasma skilja sig från andra bakterier av små, minut genom och brist på cellväggen. Många mykoplasma etablera kolonisering och infektion via anslutning till värdvävnader. Eftersom deras dynamiska yta arkitektur är anti och funktionellt mångsidig, mykoplasma är kapabla att kringgå värdens immunangrepp och anpassa sig till många livsmiljöer och orsaka kroniska sjukdomar [32]. Eftersom identifieringen av M.hy
svin i 1962, var liten undersökning genomförts på denna patogen tills det visade sig vara associerad med flera humana cancerformer [5], [41], [42], [ ,,,0],43]. På senare tid, fann forskarna att M.hy
protein p37 var ansvarig för att främja cancercellinvasion och metastaser [30], [44]. Förutom denna direkta mekanism, kan denna mikrob även framkalla tumörbildning eller metastaser indirekt genom en lokal kronisk inflammatorisk process. Det är väl känt att IL-1β är en viktig pro-inflammatoriska cytokiner som främjar tillväxt av koloncancerceller och ökar invasivitet och metastasering av B16-melanomceller [19], [45]. Överexpression av IL-1β befanns inducera gastrisk inflammation och cancer hos möss [19]. I denna studie undersökte vi om NLRP3 inflammasome, som styr IL-1β mognad, aktiverades av M.hy
, och om denna aktivering kan bidra till M.hy
tillhörande gastric metastaser . Våra resultat visade att M.hy
aktiverat NLRP3 inflammasome In vitro Mössor och In vivo
och främjande av magcancer cellmigration och invasion av M .hy
var beroende NLRP3 inflammasome aktivering. Förutom NLRP3, fann vi att M.hy
DNA aktiveras också AIM2 inflammasome, men MLAMP aktivering av NLRP3 var den dominerande komponent för IL-1β induktion av M.hy.

Det har nyligen rapporterats att acylerad lipopeptid från värmedödade mykoplasma Acholeplasma laidlawii
(HKAL) inducerad IL-1β produktion genom NLRP7 inflammasome i humana celler, medan den totala HKAL inducerad IL-1β sekre var delvis NLRP3 beroende [46], vilket indikerar att multipla inflammasomes kan aktiveras av vissa mykoplasma. Våra data utesluter inte en eventuell medverkan av NLRP7 i M.hy
inducerad IL-1β produktion, men M.hy
huvudsakligen aktiverat NLRP3 inflammasome, eftersom IL-1β sekre var nästan helt avskaffas i NLRP3 tystas celler (figur 3H och 3i).

Tidiga studier föreslog att ROS aktiveras NLRP3 inflammasome genom att aktivera kaspas-1 [47]. Men nyligen Undersökningen visade att ROS-hämmare störde transkriptionen av IL-1β och NLRP3, men påverkas inte aktivering av kaspas-1 i musceller [40]. I vår studie, men ROS hämning med låg dos DPI (10 M) reducerade IL-1β produktion på betydligt M.hy
utmaning, det inte hämmar kaspas-1-klyvning, markören inflammasome aktivering. Men när hög dos av DPI (100 M) applicerades, kaspas-1 klyvning tydligt hämmades (Figur 5E), vilket tyder på att hög dos av DPI kan undertrycka montering av inflammasome komplex, även om vi inte kan utesluta möjligheten att denna effekt kanske har resulterat från NLRP3 mRNA avskaffa från baslinjen (Figur 5D). Det är troligt att ROS-inhibitorn kan störa både pro-IL-1β-syntes och kaspas-1-aktivering.

Hur M.hy
främjar ROS-produktionen i makrofag fortfarande instabil. Avsaknaden av cellvägg från M.hy
tillåter direkt kontakt mellan mykoplasma membranet och värdcellens membran, och denna kontakt kan leda till sammansmältning av mykoplasma med eukaryot värdcell. Denna fusion kan inte bara leda till mykoplasma komponenter som levererar in i värdcellen, utan också medge insättning av de mykoplasma membrankomponenter in i membranet av den eukaryotiska värdcellen. Nyligen M.hy
membran befanns ha fosfolipas A (PLA) som kan vara inblandade i plasmamembranet avbrott process som sker vid invasionen av värdceller [48], [49]. Under denna process, kan värdceller producerar ROS. Det skulle vara värt att undersöka huruvida PLA krävs för M.hy
inducerad ROS produktion och IL-1β sekre.

Som framgår av våra data, lysosomal bristning, K ^{+ utflöde, Ca 2 + inflöde och ROS var alla inblandade i M.hy
inducerad NLRP3 aktivering. Som rapporterats tidigare, K + utflödet och phagolysosomal bristning kan inducera Ca 2 + inflöde, medan Ca 2 + inflöde kan orsaka dysfunktion av mitokondrier, vilket resulterar i frisättning av oxiderad mitokondrie-DNA (mtDNA) i cytosolen, där det binder till och aktiverar NLRP3 inflammasome [9], [12]. Mitokondrier verkar fungera som ett centralt nav för integration av olika signaler avkända av NLRP3, men den relativa betydelsen av ROS och mtDNA för NLRP3 inflammasome aktivering är fortfarande oklart hittills [9].}

Även om M .hy
är inte mycket virulent, kan det skapa kronisk infektion. Genom en gradvis och progressiv interaktion med värdceller, inducerar det kromosomala instabilitet och malign transformation, vilket främjar tumörtillväxt, migration eller invasion [50], [51]. M.hy
p37 protein främjas magcancer cell prostata carcinoma och melanomcellinjer invasions [30], [31]. Dessutom kan den pro-inflammatoriska mikromiljön såsom IL-1β produktion också bidra till denna process [19]. Vår studie visar att M.hy
inducerad IL-1β främjas migration och invasion av mag cancerceller, medan M.hy
inducerad IL-18 inte bidrar till migration och invasion av gastric cancerceller, som var annorlunda än andra rapporter [26], [27]. En möjlig förklaring är att IL-18 kan ha främjat gastric cancerceller migration och invasion via regleringen av CD70, CD44 och VEGF-produktion i immunceller, som förtjänar vår vidare undersökning [26]. En annan förklaring kan vara att dosen av rIL-18 de som används (150 ng /ml) är mycket högre än vad vi använde [27]. Dessutom IL-1β främjas migration och invasion av mag cancerceller kan förmedlas genom matrix metalloproteinas-9 (MMP9) som andra forskare rapporterat [52]. Men för att få direkt och mer hållbara bevis och motsvarande mekanismer om sambandet mellan NLRP3 inflammasome aktivering utlöses av M.hy, Mössor och magcancer metastas lämpliga djurmodeller såsom In vivo
tumörinvasion analys [53] och patientstudier behövs för vidare studier i framtiden.

Material och metoder

Cell Culture

THP-1-celler, PMA-inducerad makrofager och magcancer cell MGC-803 upprätthölls i RPMI 1640-medium med viktiga tillskott. Humana monocyter isolerades med Percol TM densitetscentrifugering (GE Healthcare Bio-Sciences, Sverige) från humana perifera mononukleära blodkroppar (PBMC) erhölls från Shanghai Blood Center (Shanghai, Kina).

M.hy
Sila och PCR Detection

M.hy
stam som används i vår studie erhölls från kontaminerad cellkultur. Mycoplasm Detektionen utfördes genom två omgångar av PCR med cellodlingsmedium [54]: För det första, köra PCR med fyra primrar 5'-ACACCATGGGAGYTGGTAAT-3 ', 5'-CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT-3', 5'-AAAGTGGGCAATACCCAC GC-3 ', 5'-TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG-3 'med cell odlade mediet som mall. För det andra, ta ett pl av ovanstående PCR-produkten som mall och köra PCR med tre primrar 5'-GTGSGGMTGGATCACCTCCT-3 ', 5'-GCATCCACCAWAWACY CTTT-3', 5'-CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT-3 '. Den första och andra PCR körs under samma cykel skick. Sedan vi sekvens PCR-produkten och fick följande sekvenser: ACTCTTACTTAATTTAAAAGTTAATACAACTTTAATATT GCCTATTATTGCTAAAGATAAATATCTTAAGGTATTTTAATATTGGTAATCTATTTTAGAAATTTAATTTAAAAATTAAACTCGGTTATAAAAAAGATCGTTGAAATAATAAATATGAAGTTAATCATATTGTTATTTGCTATTCAGTTTTCAAAGAACTATAATTGAGAACTTAAAGCTCTCAAAACTAGACACGAATCGATTATGTAATAAGTCAATTAAGACTAACGGAAAGCGGAAAAAGAAGGTGATCCGTCCCCACG. Genom BLAST i NCBI databasen, fick vi information om att mykoplasma är M.hy
. Det kan vara SK76, GDL-en eller MCLD stam.

M.hy
kultur, DNA-extraktion och MLAMP Förberedelse

M.hy
var odlas i modifierad SP-4-medium innehållande 20% nyfödda bovinserum, 10% jästextrakt, 1% glukos, 0,00024% phenolsulfonphthalein, och 1000 IE /ml penicillin. DNA-extraktion från M.hy
utfördes enligt instruktionerna med reagens som tillhandahålls av Shanghai Lifefeng Biotechnology Co, Ltd M.hy
kvantifierades som färgförändring heter (CCU) per milliliter såsom beskrivits [55]. Extraktionen av MLAMP utfördes såsom beskrivits tidigare [34].

Realtids-PCR

NLRP3 och IL-1β mRNA-expression bestämdes genom kvantitativ realtids-PCR. Relativ kvantifiering av gener normaliserades mot en endogen kontroll β-aktin via formel [2 ^{-ΔCt (målgen-β-aktin)]. De primers som användes var: Homo sapiens (hs) IL-1β, 5'-CACGATGCACCTGTACGATCA- (framåt) 3 ', 5'-GTTGCTCCATATCC TGTCCCT- (bakåt) 3'; p-aktin, 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG- (framåt) 3 ', 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC- (bakåt) 3'; NLRP3, 5'-AAGGGCCATGGACTATTTCC- (framåt) 3 ', 5'-GACTCCACCCGATGACAGTT- (bakåt) 3'. M.hy
DNA exemplar dertermined av kvantitativ realtids-PCR med standardkurva metodik för absoluta kopietal. De specifika primers för M.hy
var. 5'CGATTCGTGTCTAGTTTTGAG - (framåt) 3 ', 5'- ATTGCCTATTATTGCTAAAG - (bakåt) 3'}

ELISA

supernatanter från odlade celler, mus-serum och mus peritoneala lavage analyserades med avseende cytokiner IL-1β, IL-18, IL-6 eller IL-8-utsöndring genom ELISA (BD Biosciences) enligt tillverkarens instruktioner.

generation av THP-1 celler som uttrycker shRNAs inriktning gener av intresse

shRNA vektorer mot mänsklig NLRP3, kaspas-1 och ASC, och deras scramble vektorer är gåvor från Dr. Jurg Tschopp [56]. Om genereringen av THP-1-celler som uttrycker shRNAs, kortfattat, nt GATGCGGAAGCTCTTCAGTTTCA av human ASC kodande sekvensen, nt CAGGTTTGACTATCTGTTCT av human NLRP3 kodande sekvensen, nt GTGAAGAGATCCTTCTGTA av 3 'UTR av humant kaspas-1 infördes i pSUPER.

• PLOS ONE: Negativ Node Count Förbättring Prognostic Prediktion av den sjunde upplagan av TNM klassificering för Gastric Cancer
• PLOS ONE: Natural History av malignt skelettskador i Gastric Cancer: slutresultaten av en Multi benmetastaser Survey