PLoS One: Mycoplasma hyorhinis Aktiválja a NLRP3 Inflammasome és Elősegíti migrációs és behatolás gyomorrák Cells

absztrakt katalógusa

Háttér katalógusa

Mycoplasma hyorhinis katalógusa ( M.hyorhinis , M.hy
) társul fejlődése gyomor és a prosztata rák. A NLRP3 inflammasome, egy fehérje komplex szabályozására érését fontos gyulladásos citokinek interleukin (IL) -1β és IL-18, is részt vesz a tumorigenezis és metasztázis különféle rákok.

módszertan /fő eredményei katalógusa

Annak tisztázására, hogy M.hy
támogatni daganat kialakulását, inflammasome aktiválás elemeztük monociták IL-1β és IL-18 termelés után M.hy katalógusa kihívás. Amikor kitett M.hy katalógusa, humán monociták mutatott gyors és robusztus IL-1β és IL-18-szekréciót. Azt is megállapították, hogy a lipid asszociált membrán fehérje (LAMP) re M.hy katalógusa megbízott IL-1β indukció. Alkalmazása kompetitív inhibitorok, génspecifiusan shRNS és gén célzott egerekre, ellenőrizte, hogy M.hy
indukált IL-1β szekréció NLRP3 függő in vitro katalógusa és in vivo katalógusa . Katepszin B aktivitás, K ^{+ leadás, Ca 2+ beáramlás és ROS termelés mind szükséges NLRP3 inflammasome aktiválás M.hy katalógusa. Fontos megjegyezni, hogy ez az IL-1β, de nem IL-18 előállított makrofágok megtámadni M.hy
támogatni gyomorrák sejtek migrációját és invázióját. Katalógusa}

Következtetések katalógusa

Adataink arra utalnak, hogy aktiválja a NLRP3 inflammasome által M.hy katalógusa társulhat annak előmozdítása gyomorrák áttét, és anti- M.hy katalógusa terápia vagy korlátozó NLRP3 jelátviteli lehet hatékony megközelítés az ellenőrzési gyomorrák haladást.

bevezető hivatkozás: Xu Y, Li H, Chen W, Yao X, Xing Y, Wang X. et al. (2013) Mycoplasma hyorhinis katalógusa Aktiválja a NLRP3 Inflammasome és Elősegíti migrációs és behatolás gyomorrák sejtek. PLoS ONE 8 (11): e77955. doi: 10,1371 /journal.pone.0077955 katalógusa

Szerkesztő: Suresh Yenugu, University of Hyderabad, India katalógusa

Beérkezett: június 5, 2013; Elfogadva: szeptember 6, 2013; Megjelent: november 6, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Xu et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka ben támogatták 100 Talent Program a kínai Tudományos Akadémia, Természettudományi Alapítvány Kína (91029707, 31170868), Shanghai Természettudományi Alapítvány (11ZR1442600), Novo Nordisk-CAS Research Foundation, SA-SIBS Ösztöndíj Program, valamint a támogatást a Nemzeti Key programok fertőző betegségek (2012ZX10002007-003). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

mycoplasmák pleomorph, fal szabad, prokarióta szervezetekre, hogy tartózkodjon vagy az eukarióta sejt membránok vagy a sejteken belül, és ezek a legkisebb organizmusok képesek az ön-replikáció [1]. A mai napig, legalább 16 Mycoplasma-fajok izoláltak emberben [2]. Mycoplasma hyorhinis katalógusa ( M.hy katalógusa) tartották, nem patogén az emberekre, mivel általában a sertést megfertőző vezető légúti betegség és a gyulladás a mellkas és az ízületek [3], [4] . Ugyanakkor egyre több bizonyíték arra, hogy M.hy katalógusa fertőzés emberben nem eredményezi a klinikai kimenetelt. M.hy
találtak 56% -a gyomor karcinóma, 55% vastagbél-karcinóma és 52,6% tüdőkarcinóma biopsziák [5]. Sőt, 36% a férfiak jóindulatú prosztata megnagyobbodás (BPH) és 52% a prosztatarákban szenvedő férfiak M.hy katalógusa szeropozitív. Ezek a klinikai eredmények arra utalnak, hogy lehetséges kapcsolatot M.hy katalógusa expozíció gyomor-, vastagbél-, tüdő- és prosztatarák [5], [6]. Katalógusa

Amikor a mikrobiális fertőzések, gazda mintázat felismerő receptorok ( PRRS), mint például TLR-ek érzékelik a kórokozók és kiváltó szintézisét proinflammatorikus citokinek, mint például a pro-IL-1β és a pro-IL-18-n keresztül az NF-kB aktiválást. Ugyanakkor, egy másik csoportja PRRS beleértve NLRP3 toborozni az adapter protein ASC, és vezet a kaszpáz-1, amely egy aktív proteáz, amely hasítja a prekurzor formájában citokinek, beleértve a pro-IL-1β és a pro-IL-18 érett, szekretált formáját [7]. Kórokozók vagy kihívó szerek okoznak kálium efflux, mitokondriumok károsodás, mitokondrium DNS kiadás, ROS-termelés, a sejten belüli kalcium növekedésének vagy celluláris ciklikus AMP csökkenése veleszületett immunrendszer sejtek, amelyek mindegyike szerepet játszik a kaszpáz-1 aktiválás [8], [9], [10 ], [11], [12], [13]. E folyamat során a NLRP3, ASC és a pro-kaszpáz-1 forma molekulatömege platform úgynevezett inflammasome. Eddig számos inflammasomes azonosítottak, ezek, a NLRP3 inflammasome találtuk társított tumor fejlődését [14], [15], bár vita van a különböző modellek [16], [17]. Ennek ellenére, az IL-1β jelentették, hogy támogassák a tumorsejtek növekedését és a metasztázist indukálásával több pro-metasztatikus gének, mint például a mátrix metalloproteinázok és az endoteliális adhéziós molekulák, valamint a TGF-β, kemokinek és növekedési faktorok [18]. Egy koreai populációban, a kombináció a fokozott nyálkahártya IL-1β szint és homozigóta az IL-1β -31T egypontos nukleotid polimorfizmus (SNP) egyaránt összefüggésbe hozható a megnövekedett kockázata gyomorrák [18]. Továbbá, Tu et al. megállapította, hogy a gyomor-specifikus expresszióját a humán IL-1β transzgenikus egerekben vezetett spontán gyomor gyulladás és rák [19], továbbá arra utal, hogy az IL-1β elősegítheti emberi gyomor karcinogenezis. Ezzel szemben, az IL-18 növeli NK sejt aktivitás, csökkenti a tumorigenezis, apoptózist indukál és gátolja az angiogenezist a tumorsejtekben gyakorolni tumorellenes hatását [20], [21]. Ezen túlmenően, a nem megfelelő termelt IL-18-t találtuk, hogy hozzájárulnak a patogenezisében rákok és befolyásolhatja a klinikai kimenetelét betegeknél [22]. IL-18-ben számoltak be, hogy ösztönözzék mátrix metalloproteáz-9 termelést, ami növeli a migrációs és behatolás koszorúér simaizom sejtek és a HL-60 mieloid leukémia sejtek [23], [24]. Azt is jelentette, hogy a szérum IL-18 szintjét a gyomorrák beteg csoportban szignifikánsan magasabb volt, mint a gyomorfekély betegcsoportban [25], és az IL-18 növeli a metasztázis és immun menekülési gyomorrák keresztül down-regulációja CD70 és karbantartása CD44 humán gyomorrák sejtvonal NCI-N87 és SNU16 [26]. Ez is egy kritikus mediátora a VEGF-fokozott migrációt humán gyomorrák sejtvonalakon SNU-601 [27]. A fenti eredmények azt sugallják, hogy a Mycoplasma hyorhinis katalógusa elősegítheti migrációs és behatolás gyomorrák sejtek aktiválásával inflammasome. Katalógusa

Eddig széles spektrumát mikrobák, beleértve a vírusokat, baktériumokat, gombákat és protozoonok volna azonosított, hogy aktiválja a NLRP3 inflammasome [28]. Egy nemrégiben készült tanulmány kimutatta, hogy a Mycoplasma pneumoniae katalógusa is képes indukálni az IL-1β termelést az emberi sejtekben [29]. Azt azonban, hogy M.hy katalógusa, amely fontos tényező a gyomorrák fejlesztés a fent említett [5], [30], [31], aktiválja a NLRP3 inflammasome e, és hogy ez az aktiválás hozzájárul a gyomorrák fejlődése azonban továbbra is ismeretlen. Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy M.hy
kiváltott IL-1β szekréció egy NLRP3 inflammasome-függő módon, és a kapott IL-1β indukált migrációs és behatolás a gyomor rákos sejteket.

Eredmények katalógusa

M.hy katalógusa triggerek IL-1β és IL-18 termelés THP-1 sejtek katalógusa

Annak megállapításához, hogy M.hy katalógusa indukál IL -1β termelés veleszületett immunsejteket, mi monitorozni érett IL-1β szintek humán monocita sejtvonal THP-1 sejtek megtámadta különböző mennyiségű M.hy katalógusa. Ebben a kísérletben egy erős indukcióját IL-1β dózis-függő módon megfigyelhető volt (1A ábra). Ezután mértük a pro-IL-1β mRNS szintje a sejtek és az érett IL-1β protein szintje a tenyészet felülúszójában különböző időpontokban után M.hy
kihívás. Azt figyeltük meg, hogy az IL-1β mRNS-szintek tetőzött után 3 órán kihívás (1B ábra), és az érett IL-1β (1C) és IL-18 (1D ábra) fehérje szinten tetőzött 12 órával a fertőzés után. Sőt, THP-1-eredetű makrofágok is mutatott robusztus szekréciót IL-1β, IL-18, valamint más gyulladásos citokinek, mint az IL-6 és IL-8 (1 E. ábra, ábra S1). Annak igazolására, hogy a fenti megállapításokkal THP-1 sejtvonal, megvizsgáltuk az IL-1β termelést primer humán monociták egészséges donorok megtámadni M.hy katalógusa, ahol az IL-1β-t is erősen indukálta (ábra 1F) . Ezek az adatok azt mutatták, hogy M.hy
kiváltott robusztus IL-1β és IL-18 szekrécióját humán mieloid sejtekben.

LAMP származó M.hy
felelős IL -1β indukciós keresztül TLR2 katalógusa

a következő azt vizsgáltuk, hogy a replikáció M.hy katalógusa volt szükség az IL-1β termelést monociták. Amint azt a 2A ábra, M
.hy
melegítve inaktiválódik, vagy ultra-ibolya (UV) kezelés által kiváltott annyi IL-1β szekrécióját THP-1 sejtek az élő M .hy katalógusa. Ez azt jelzi, hogy bizonyos hő- és UV-ellenálló komponense M.hy
felelős volt az IL-1β szekréció. Lipid-asszociált membránprotein (lámpa) bőségesen fejezik ki a felületén M.hy katalógusa [32], és a korábbi tanulmány megállapította, hogy a membrán lipoproteinek más Mycoplasma-fajok által kiváltott IL-1β szekréció [33]. Mi így feltételezték, hogy M.hy
származtatott LAMP (MLAMP) felelős lehet az IL-1β indukció THP-1 sejtekben. Ezután extraháljuk lámpát a M.hy katalógusa (2b ábra) és tesztelte a képességét MLAMP indukáló IL-1β szekréció THP-1 sejtekben. Azt találtuk, hogy MLAMP egyértelműen indukált szekréciója az IL-1β dózis-függő módon, míg a vizes fázis a M.hy
kivonat nem volt képes megtenni (2C ábra). Hogy kizárják az esetleges RNS és /vagy DNS-szennyeződés MLAMP kezeltünk a MLAPMs az áz és ázt és megállapította, hogy MLAMP volt a fő összetevője az IL-1β indukció (S2 kép). Katalógusa

Azt jelentették, hogy MLAMP főként az aktivált NF-kB keresztül TLR2 és TLR6 [34], [35]. Ezért először alkalmazzák egy TLR2 semlegesítő antitest T2.5, hogy blokkolja a TLR2 jel, azzal ConT2 szolgáló egy izotípus kontroll [36]. Ábrán látható a 2D, T2.5 teljesen blokkolta az IL-1β szekréció stimulált TLR2 agonista P3CSK4 de nem a TLR4 ligandum LPS. Fontos, hogy az IL-1β szekréció M.hy
fertőzött sejtek erősen csökken T2.5, jelezve, hogy a TLR2 részt MLAMP kiváltott IL-1β szekréció humán monocitákban. Érdekes, hogy az IL-1β szekréció M.hy
fertőzött sejtekben, nem volt teljesen blokkolta T2.5 (2D, ábra), ami arra utalt, hogy a TLR2 független jelátviteli útvonal is részt MLAMP kiváltott IL-1β szekréció amely további vizsgálatot érdemel a jövőben. katalógusa

M.hy katalógusa indukálja az IL-1β szekréció révén aktiválása NLRP3 Inflammasome katalógusa

Annak ellenőrzésére, hogy M.hy
indukált IL-1β szekréciót inflammasome aktiválás, először használták LPS alapozott THP-1 eredetű makrofágok hogy ellenőrizze, ha a M.hy katalógusa aktiválhatja inflammasome mint ATP vagy MSU, amelyek ismertek inflammasome aktivátor. Amint az a 3a ábrát, M
.hy
volt képes indukálni az IL-1β felszabadulását az alapozott sejtekben. Ezután megvizsgáltuk a hasítás a kaszpáz-1 és oligomerizációs ASC, két fontos döntéshozók a inflammasome aktiválást. Azt találtuk, hogy M.hy katalógusa elősegítette a kaszpáz-1 és oligomerizálásához ASC (3B), jelezve, hogy közvetlen aktiválása inflammasome által M.hy. Matton

Továbbá azt teszteltük, hogy M.hy
indukált IL-1β szekréció ezt bizonyos inflammasome alkatrészeket. Először azt találtuk, hogy a specifikus kaszpáz-1 inhibitor AC-YVAD-CHO csökkent IL-1β szekréció THP-1 sejtek egy dózis-függő módon (3C, ábra). Ezután, ha meghatározott shRNS alkalmaztunk, hogy elhallgattassa a kifejezés a kaszpáz-1 és ASC (ábra 3D), IL-1β termelést erősen csökkent után M.hy katalógusa kihívás (ábra 3E), jelezve, hogy M.hy
indukált IL-1β szekréció függ kaszpáz-1 és ASC. katalógusa

Ezt azt teszteltük, hogy NLRP3 volt szükség M.hy
indukált IL-1β szekréció. Először azt találtuk, hogy a NLRP3 inhibitor Glybenclamide elfojtott M.hy
indukált IL-1β szekréciót dózisfüggő módon (ábra 3F) [37]. Ha egy adott shRNS alkalmaztunk, hogy elhallgattassa a kifejezés NLRP3 (ábra 3G), IL-1β termelést erősen csökkent után M.hy katalógusa kihívás (ábra 3H), jelezve, hogy M.hy katalógusa indukált IL-1β szekréció függött NLRP3. Ezt alátámasztotta immunoblot amelyben a kaszpáz-1 aktiválását és az IL-1β termelés mindketten NLRP3 függő (ábra 3i). Sőt, azt is megállapították, hogy MLAMP volt a fő komponens felelős NLRP3 inflammasome aktiválás M.hy katalógusa (ábra S2C). Emellett AIM2 inflammasome jelentették aktiválható DNS [38], és azt találtuk, hogy M.hy katalógusa DNS indukált IL-1β szekréció révén AIM2 inflammasome (ábra S3A). Érdekes, hogy M.hy
indukált IL-1β szekréció elsősorban függ NLRP3, míg AIM2 csak részben volt érintett (ábra S3A). Együttesen ezek az eredmények egyértelműen igazolták, hogy a M.hy
indukált IL-1β szekréció aktiválása révén a NLRP3 inflammasome humán monocita sejtekben. Katalógusa

mechanizmusok mögöttes M.hy katalógusa kiváltása NLRP3 Inflammasome Aktiválás

aktiválása NLRP3 inflammasome a különböző ingerekre függ katepszin B-aktivitást, k ^{+ efflux, kalcium-beáramlás és /vagy termelési reaktív oxigéngyökök (ROS) [11], [ ,,,0],12], [13], [39]. Ahhoz, hogy vizsgálja meg a mechanizmusok mögöttes IL-1β Release válaszul M.hy
kihívás, először alkalmazott katepszin B-specifikus inhibitor CA-074 Me és a megfigyelt jelentős csillapítás az IL-1β szekréció upon M .hy katalógusa kihívás. A koncentrációja 100 uM, a CA-074 Me teljesen blokkolta az IL-1β Release (4a ábra). Ez a gátlás nem annak volt köszönhető, hogy bármilyen toxikus hatást a sejtek IL-8-szekréciót érinti ez a gátló nagyon enyhe volt (ábra 4E). Fontos, hogy amikor a sejteket kezeltük katepszin K inhibitor I, a csökkenés az IL-1β szekréció nem volt nyilvánvaló egyáltalán (4b ábra és 4F), ami arra utal, hogy a katepszin B-aktivitást specifikusan részt NLRP3 inflammasome aktiválás során M .hy katalógusa kihívás. Ezen túlmenően, amikor blokkolt k + efflux növelésével az extracelluláris K + koncentráció, az IL-1β szekréció THP-1 sejtek esetén M.hy
kihívás szignifikánsan csökkent dózis- függő módon (4C). Ismét nem volt toxikus hatást KCL például az IL-8-termelését az azonos sejtek normális volt (ábra 4G). Hogy kitaláljuk, hogy a kalcium beáramlás segített inflammasome aktiválás, adtunk különböző dózisú EGTA a sejttenyésztő közegben, és megállapította, hogy EGTA kezelés blokkolt M.hy
indukált IL-1β szekréciót dózisfüggő módon, és nem toxikus jétől EGTA volt megfigyelhető, amint azt az IL-8 termelés (ábra 4D és a 4H).}

Továbbá megvizsgáltuk, hogy M.hy
kihívás indukált ROS-termelés a THP-1 sejtek . Ehhez a vizsgálathoz, a THP-1 sejteket először töltöttünk fel a redox-érzékeny fluorofor DCFDA majd megtámadta az M.hy katalógusa, az ATP-t tartalmaz, mint a pozitív kontroll. Ábrán látható 5A, 16,9% CM-H2DCFDA pozitív sejteket 30 perccel azután, hogy M.hy
kezelés képest 1,6% a kezeletlen sejtekben. Ezek az adatok azt javasolta, hogy a ROS hozzájárulhat NLRP3 inflammasome aktiválás válaszul M.hy katalógusa kihívás. Annak ellenőrzésére, ezt a lehetőséget, mi előkezelt THP-1 sejtek ROS inhibitor diphenyliodonium (DPI) 30 percig, majd megtámadta a sejtek M.hy
mérése előtt az IL-1β termelés 6 órával később. Ahogy az várható volt, DPI drámaian lecsökkent M.hy
indukált IL-1β kiadás (5B). Egy nemrégiben készült tanulmány kimutatta, hogy a ROS-gátlót, például DPI megszüntette az IL-1β felszabadulását egér makrofágok gátlásával NLRP3 génexpresszió [40]. Ezért is nyomon követte a mRNS szintje a pro-IL-1β és NLRP3 alatt DPI kezelést. Azt találtuk, hogy a DPI jelentősen csökkentette az expressziós pro-IL-1β és NLRP3 (5C-D), amely összhangban volt a megállapítás származó egér sejtekben [40]. Ezen kívül azt is megvizsgálták, a kaszpáz-1, és megállapította, hogy az alacsony dózisú (1 vagy 10 uM) a DPI kezelés nem volt hatással a kaszpáz-1 aktiválás közben 100 uM DPI gátolta kaszpáz-1 aktiváció (5E ábra). Ez azt bizonyítja, hogy az emberi sejtekben DPI beavatkozni NLRP3 inflammasome aktiválás gátlása útján NLRP3 transzkripció valamint a kaszpáz-1-aktivitás, amikor a magas dózist alkalmazva. Összességében ezek az adatok arra utalnak, hogy a katepszin B aktivitás, K ^{+ leadás, Ca 2+ beáramlás és ROS mind hozzájárultak NLRP3 inflammasome aktiválás válaszul M.hy katalógusa kihívás.}

M.hy katalógusa Aktiválja NLRP3 Inflammasome in vivo Matton

Ha az egér csontvelő eredetű dendritikus sejtek (BMDCs) fertőződött M.hy katalógusa , tartós IL-1β indukció volt megfigyelhető (6a ábra). További kísérletek BMDCs izolált vad típusú (WT) egereken vagy hiányos egerekben kaszpáz-1, ASC vagy NLRP3 a M.hy katalógusa kihívás megerősítette, hogy M.hy katalógusa indukció IL 1β volt NLRP3 inflammasome függő (6B). Továbbá, a szisztémás beoltása M.hy
WT egerekben indukált IL-1β termelés a szérumban és a peritoneális mosófolyadékban (PLF), de nem hiányos egereken ASC vagy NLRP3 (ábra 6c-D). Érdekes, hogy a bazális szint az IL-1β ASC deficiens egerekben egyértelműen magasabb, mint a WT vagy NLRP3 deficiens egerekben, de kihívást M.hy
növelése nem fokozta az IL-1β ilyen egerekben (ábra 6C-D). Együttesen ezek az eredmények megerősítették, hogy M.hy
is aktiválódik NLRP3 inflammasome egerekben in vitro katalógusa és in vivo katalógusa.

M. hy katalógusa indukált IL-1β Elősegíti Gyomor tumorsejtek migrációját és Invasion katalógusa

A fenti adatok egyértelműen azt mutatták, hogy M.hy katalógusa képes indukálni az IL-1β termelést veleszületett immunsejtek révén NLRP3 inflammasome aktiválást. Korai járvány vizsgálatok kimutatták, egy lehetséges szerepe Mycoplasma a fejlesztés a gyomorrák [5]. És Mycoplasma hyorhinis katalógusa kimutatták, hogy elősegíti a tumor sejtek migrációját, invázió és metasztázis in vitro katalógusa és in vivo katalógusa [41]. Feltételeztük, hogy létezhetnek más mechanizmus az akcióban, ami az, hogy M.hy katalógusa elősegítheti a gyomor carcinogenesis és /vagy áttétel előmozdításával IL-1β termelést. És meggyőződtünk róla, hogy a M.hy
támogatni gyomorrák sejt migrációt és inváziót (ábra S5). Mivel M.hy
kimutatták, hogy megfertőzi gyomorrák-sejtek ([41], ábra S4), tehát lehetővé, hogy a A M.hy
indukálhat inflammasome aktiválás a rákos sejtekben közvetlenül. Azonban nem inflammasome aktiválás volt kimutatható gyomorrák-sejtek (ábra S6).

következő meghatároztuk a hatását humán rekombináns IL-1β (rIL-1β) a gyomorrák sejtek karcinogenezisének egy telepképző assay, mely feltárta, hogy a rIL-1β nem befolyásolja a proliferációját gyomorrák sejtvonal MGC-803 (ábra S7). Mivel az IL-1β jelentették, hogy támogassák metasztázis más tumorban [18], megvizsgáltuk a hatását rIL-1β a migrációs és invázió MGC-803 sejtekben. Eredményeink azt mutatták, hogy az MGC-803 migrációs és behatolás megerősödött az rIL-1β kezelés (7a ábra és 7c), míg a kezelés rIL-18 nem mutatott semmilyen hatást (7B ábra és 7D). Ezután azt kezelni ezeket a gyomorrák sejtek a felülúszóit M.hy
támadott THP-1 eredetű makrofágok vagy makrofágok elhallgattatása NLRP3, ASC és a kaszpáz-1 migrációs és behatolás vizsgálattal. Eredményeink azt mutatták, hogy a tenyészet felülúszóit M.hy
támadott Scramble makrofág sejtek erősen fokozott migrációt és inváziót gyomor rákos sejtek, míg a tenyészet felülúszóit a NLRP3, ASC vagy kaszpáz-1 knockdown makrofágok nem, valószínű mivel a csökkent IL-1β szekréció (8a ábra és 8C). Ez a fokozott migráció és invázió MGC-803 sejtek eltörölte kezeljük a sejteket anti-IL-1β mAb (8b ábra és 8d). Mindent összevetve, az eredmények igazolták, hogy M.hy
kiváltott migráció és invázió gyomorrák sejtvonal MGC-803 előmozdításával IL-1β szekrécióját monocitasejte. Sőt, az adataink azt mutatták, hogy M.hy
indukált inflammasome aktiválás elősegítése M.hy katalógusa replikáció (ábra S8), amely a pozitív visszajelzés és végül vezet idült betegség.

Vita katalógusa

mycoplasmák megkülönböztetik magukat más baktériumok a kis méret, perc genom és nem a sejtfal. Sok mikopiazmák létre kolonizáció és fertőzés útján ragaszkodás fogadó szövetekben. Mivel a dinamikus felületi építészet antigén-és funkcionálisan sokoldalú, mycoplasma képesek megkerülése gazda autoimmun és alkalmazkodva számos élőhely, ami a krónikus betegségek [32]. Mivel az azonosító M.hy
a sertés 1962-ben, kis vizsgálatot végeztünk a kórokozó évig azt találták, hogy kapcsolatban számos emberi rákos megbetegedések [5], [41], [42], [ ,,,0],43]. Újabban a kutatók megállapították, hogy M.hy katalógusa protein p37 volt előmozdításáért felelős a rákos sejtek invazív és metasztatikus [30], [44]. Emellett ez a közvetlen mechanizmus, ez a mikroba is indukálják tumorigenezis vagy metasztázis közvetve egy helyi krónikus gyulladásos folyamat. Ez jól ismert, hogy az IL-1β egy fontos gyulladáskeltő citokin, amely elősegíti a növekedést a vastagbél rákos sejteket, és javítja a invazivitását és metasztázis B16 melanóma sejtek [19], [45]. Túlexpressziója az IL-1β-t találtuk, hogy indukál gyomor gyulladás és rák egerekben [19]. Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy a NLRP3 inflammasome, amely szabályozza az IL-1β érését, aktiválták M.hy katalógusa, és hogy ez az aktiválás hozzájárulhat a M.hy
összefüggő gyomor- metasztázis . Eredményeink azt mutatták, hogy M.hy katalógusa aktiválta a NLRP3 inflammasome in vitro katalógusa és in vivo katalógusa, és előmozdítása gyomorrák sejtek migrációját és inváziója M .hy katalógusa függött NLRP3 inflammasome aktiválást. Emellett NLRP3, azt találtuk, hogy M.hy katalógusa DNS is aktiválja a AIM2 inflammasome, de MLAMP aktiválása NLRP3 a domináns elem az IL-1β által indukált M.hy. Matton

Ez volt a közelmúltban számolt be, hogy az acilezett lipopeptid származó hővel elölt mycoplasma acholeplasma laidlawii katalógusa (HKAL) által kiváltott IL-1β termelés révén NLRP7 inflammasome az emberi sejtekben, míg a teljes HKAL indukált IL-1β szekréció részben NLRP3 függő [46], ami azt jelzi, hogy a többszörös inflammasomes lehet aktiválni bizonyos mikoplazma. Adataink nem zárja ki az esetleges érintettségét NLRP7 M.hy
indukált IL-1β termelést, de M.hy katalógusa elsősorban aktiválta a NLRP3 inflammasome, mert az IL-1β szekréció szinte teljesen eltörölte a NLRP3 hangtompítós sejtek (ábra 3H és a 3i). katalógusa

a korai vizsgálatok azt javasolta, hogy a ROS aktiválta a NLRP3 inflammasome aktiválásával kaszpáz-1 [47]. Azonban a legújabb vizsgálat kimutatta, hogy a ROS-inhibitorok zavarta a transzkripció az IL-1β és NLRP3, de nem befolyásolta kaszpáz-1 egér sejtekben [40]. Vizsgálatunkban bár ROS gátlás alacsony dózisú DPI (10 uM) szignifikánsan csökkentette az IL-1β termelés upon M.hy
kihívás, hogy nem gátolja a kaszpáz-1 hasítás, a markere inflammasome aktiválást. Azonban, ha nagy dózisú DPI (100 nM) alkalmazták, a kaszpáz-1 hasítás egyértelműen gátolta (5E ábra), ami arra utal, hogy a nagy dózisú DPI elnyomhatja a szerelvény inflammasome összetett, bár nem zárhatjuk ki a lehetőségét, hogy ez a hatás már származott NLRP3 mRNS eltörlését az alapvonaltól (5D ábra). Valószínű, hogy a ROS-inhibitor zavarhatják mind pro-IL-1β szintézis és a kaszpáz-1 aktiválást.

Hogyan M.hy
elősegíti a ROS-termelés makrofág megfoghatatlan marad. A hiányzó sejt fal M.hy
megengedi a közvetlen kapcsolat a Mycoplasma membrán és gazdasejt membrán, és ez a kapcsolat vezethet fúziós Mycoplasma eukarióta gazdasejtben. Ez a fúziós nem csak akkor vezet a Mycoplasma komponenseket nyilvánított a gazdasejtbe, hanem lehetővé teszik behelyezését a Mycoplasma membrán komponensek a membrán az eukarióta gazdasejtben. A közelmúltban, M.hy
membránokat találtuk, hogy rendelkeznek foszfoiipáz (PLA), amelyek részt vesznek a plazma membrán zavar folyamat, amely akkor fordul elő után az invázió gazdasejtek [48], [49]. E folyamat során a gazda sejtek termelnek ROS. Érdemes lenne azt vizsgáltuk, hogy a PLA szükséges a M.hy
indukált ROS-termelés és az IL-1β szekréció. Katalógusa

Amint az adataink, lizoszomális szakadás, K ^{+ kiáramlás, Ca 2+ beáramlás és ROS bevonták az M.hy
indukált NLRP3 aktiválást. Amint arról korábban, k + efflux és fagolizoszomális ruptura indukálhat Ca 2+ beáramlás, míg a Ca 2+ beáramlás okozhatja diszfunkció a mitokondriumok, ami felszabadulását oxidált mitokondriális DNS (mtDNS) a citoszolban, ahol kötődnek és aktiválják a NLRP3 inflammasome [9], [12]. A mitokondriumok tűnik, hogy egyfajta központi hub integrálása terén jelek által érzékelt NLRP3, de a relatív hozzájárulását ROS és mtDNS az NLRP3 inflammasome aktiválás még mindig nem világos, hogy dátum. [9] katalógusa}

Bár M .hy katalógusa nem nagyon virulens, meg tudja állapítani, a krónikus fertőzés. Fokozatos és progresszív kölcsönhatás gazdasejt arra készteti kromoszómális instabilitás és a malignus transzformáció, elősegítve ezzel a tumor növekedését, a migráció, invázió [50], [51]. A M.hy katalógusa p37 fehérje támogatni gyomorrák sejt, prosztatarák és melanoma sejtvonalak invazív [30], [31]. Ezen túlmenően, a pro-gyulladásos mikro-környezet, mint például az IL-1β termelés is hozzájárul ehhez a folyamathoz. [19] A tanulmány megállapította, hogy a M.hy
indukált IL-1β mozdítani a migráció és invázió a gyomor rákos sejtek, míg a M.hy
indukált IL-18 nem járulnak hozzá a migráció és invázió gyomorrák sejtek, ami különbözött a többi jelentés [26], [27]. Az egyik lehetséges magyarázat az, hogy az IL-18 lehet mozdítani a gyomorrák sejtek migrációs és behatolás révén a szabályozás CD70, CD44 és a VEGF expresszió immunsejtek, amely megérdemli a további vizsgálatot. [26] Egy másik magyarázat az lehet, hogy a dózis rIL-18 használtak (150 ng /ml) sokkal nagyobb, mint amit mi használt [27]. Ezen túlmenően, az IL-1β mozdítani a migráció és invázió a gyomorrák sejtek által közvetített mátrix metalloproteináz-9 (MMP9), mint a többi keresők számolt [52]. Ahhoz azonban, hogy a közvetlen és szilárdabb bizonyítékokat, és a megfelelő mechanizmusok a kapcsolatot NLRP3 inflammasome aktiválása által kiváltott M.hy, katalógusa és gyomorrák metasztázis, megfelelő állatkísérletekben, például a in vivo
tumor inváziós vizsgálati eljárás [53] és a beteg vizsgálatokra van szükség a további vizsgálat a jövőben.

anyagok és módszerek

Cell Culture

THP-1 sejtek, PMA-val indukált a makrofágok és a gyomorrák sejt MGC-803 tartottunk fenn RPMI 1640 tápközegben, esszenciális kiegészítők. Humán monocitákat izoláltunk által Percol TM sűrűség-gradiens centrifugálással (GE Healthcare, Bio-Sciences, Svédország) származó humán perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC-k) nyert Shanghai Blood Center (Shanghai, Kína).

M.hy katalógusa törzs és PCR Detection katalógusa

M.hy katalógusa törzs vizsgálatunkban kaptuk a szennyezett sejtet. Mycoplasma detektálás végeztük két fordulóban a PCR sejttenyésztő táptalajjal [54]: Először is, futtatni PCR négy primerek 5'-ACACCATGGGAGYTGGTAAT-3 ', 5'-CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT-3', 5'-AAAGTGGGCAATACCCAC GC-3 ', 5'-TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG-3 'sejt tenyészetben sablonként. Másodszor, hogy 1 ul a fenti PCR-termék templátként és futtatni PCR három primer 5'-GTGSGGMTGGATCACCTCCT-3 ', 5'-GCATCCACCAWAWACY CTTT-3', 5'-CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT-3 '. Az első és a második PCR alatt fut ugyanabban a ciklusban állapotban. Aztán szekvenáltuk a PCR termék és megkapta a következő szekvenciával: ACTCTTACTTAATTTAAAAGTTAATACAACTTTAATATT GCCTATTATTGCTAAAGATAAATATCTTAAGGTATTTTAATATTGGTAATCTATTTTAGAAATTTAATTTAAAAATTAAACTCGGTTATAAAAAAGATCGTTGAAATAATAAATATGAAGTTAATCATATTGTTATTTGCTATTCAGTTTTCAAAGAACTATAATTGAGAACTTAAAGCTCTCAAAACTAGACACGAATCGATTATGTAATAAGTCAATTAAGACTAACGGAAAGCGGAAAAAGAAGGTGATCCGTCCCCACG. BLAST NCBI adatbázisban, megkaptuk az információt, hogy a mycoplasma M.hy katalógusa. Lehet SK76, GDL-1 vagy MCLD törzs. Katalógusa

M.hy katalógusa kultúra, DNS kivonása és MLAMP előkészítése katalógusa

M.hy katalógusa WAS termesztett módosított SP-4 tápközeg, amely 20% újszülött borjúszérummal, 10% élesztőkivonat, 1% glükóz, 0,00024% phenolsulfonphthalein, és 1000 NE /ml penicillinnel. DNS-kivonást a M.hy katalógusa szerint végeztük utasítások A reagensekkel Shanghai Lifefeng Biotechnology Co., Ltd. M.hy katalógusa mennyiségileg a színváltozás egység (CCU) per milliliter leírt [55]. A kitermelés a MLAMP végeztük a korábban leírtak szerint [34].

Real-time PCR

NLRP3 és IL-1β mRNS expresszió határoztuk meg kvantitatív valós idejű PCR-rel. Relatív mennyiségi gének normalizálódtak ellen endogén kontroll β-aktin keresztül formula [2 ^{-ΔCt (target gén-β-aktin)]. Az alkalmazott primerek a következők voltak: Homo sapiens (HS) az IL-1β, 5'-CACGATGCACCTGTACGATCA- (előre) 3 ', 5'-GTTGCTCCATATCC TGTCCCT- (fordított) 3'; p-aktin, 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG- (előre) 3 ', 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC- (fordított) 3'; NLRP3, 5'-AAGGGCCATGGACTATTTCC- (előre) 3 ', 5'-GACTCCACCCGATGACAGTT- (fordított) 3'. M.hy katalógusa DNS kópia dertermined kvantitatív, valós idejű PCR standard görbe módszer abszolút kópiaszám. A specifikus primer M.hy katalógusa voltak: 5'CGATTCGTGTCTAGTTTTGAG - (előre) 3 ', 5'ATTGCCTATTATTGCTAAAG - (fordított) 3'. Katalógusa}

ELISA katalógusa

a felülúszókat a tenyésztett sejtekből, az egér szérum és az egér peritoneális mosófolyadékban analizáltuk citokinek, az IL-1β, IL-18, IL-6 vagy IL-8 szekréciójának ELISA-val (BD Biosciences), a gyártó utasításai szerint.

Generation THP-1 kifejező sejtek shRNS célzás bíró gének katalógusa

shRNS vektorok az emberi NLRP3, kaszpáz-1 és ASC, és tülekedés vektorok ajándéka Dr. Jurg Tschopp [56]. Körülbelül a generációs THP-1-t expresszáló sejtek shRNS, röviden, NT GATGCGGAAGCTCTTCAGTTTCA humán ASC kódoló szekvencia, NT CAGGTTTGACTATCTGTTCT humán NLRP3 kódoló szekvencia, NT GTGAAGAGATCCTTCTGTA a 3 'UTR az emberi kaszpáz-1 inszertáltunk pSUPER.

• PLoS One: Negatív Node Count javítása prognosztikai Jóslás a hetedik kiadása a TNM osztályozás gyomorrák
• PLoS One: Natural History of rosszindulatú csontbetegség gyomorrákban: Végeredményeket multicentrikus csontáttét felmérés