PLoS ONE: Mycoplasma hyorhinis Aktiverer NLRP3 Inflammasome og fremmer migrasjon og invasjon av magekreft Cells

Abstract

Bakgrunn

Mycoplasma hyorhinis product: ( M.hyorhinis , M.hy
) er assosiert med utvikling av mage og prostatakreft. NLRP3 inflammasome, et proteinkompleks kontrollere modning av viktige proinflammatoriske cytokiner interleukin (IL) -1β og IL-18, er også involvert i tumordannelse og metastasering av ulike kreftformer.

metodikk /hovedfunnene

for å avklare om M.hy
fremmet svulst utvikling via inflammasome aktivering, analyserte vi monocytter for IL-1β og IL-18 produksjon på M.hy
utfordring. Når de utsettes for M.hy
, humane monocytter viste hurtig og robust IL-1β og IL-18 sekresjon. Vi videre avdekket at lipid-assosiert membran protein (LAMP) fra M.hy
var ansvarlig for IL-1β induksjon. Bruk av konkurrerende hemmere, genet bestemt shRNA og genet målrettet mus, bekreftet vi at M.hy
indusert IL-1β sekresjon var NLRP3 avhengig in vitro Hotell og in vivo
. Cathepsin B aktivitet, K ^{+ utstrømming, Ca 2 + strøm og ROS produksjon var nødvendig for NLRP3 inflammasome aktivering av M.hy
. Viktigere er det IL-1β men ikke IL-18 produsert fra makrofager utfordret med M.hy
fremmet magekreft celle migrasjon og invasjon.}

Konklusjoner

Våre data tyder at aktivering av NLRP3 inflammasome av M.hy
kan være forbundet med sin promotering av magekreft metastaser, og anti- M.hy
terapi eller begrense NLRP3 signale kan være effektiv tilnærming for kontroll av magekreft fremgang

Citation. Xu Y, Li H, Chen W, Yao X, Xing Y, Wang X, et al. (2013) Mycoplasma hyorhinis
Aktiverer NLRP3 Inflammasome og fremmer migrasjon og invasjon av Gastric kreftceller. PLoS ONE 8 (11): e77955. doi: 10,1371 /journal.pone.0077955

Redaktør: Suresh Yenugu, University of Hyderabad, India

mottatt: 5 juni 2013; Godkjent: 06.09.2013; Publisert: 06.11.2013

Copyright: © 2013 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra 100 talent Program av den kinesiske Academy of Sciences, Foundation of China (91029707, 31170868) Natural Science, Shanghai Natural Science Foundation (11ZR1442600), Novo Nordisk-CAS Research Foundation, SA-SIBS Scholarship Program, samt tilskudd fra National Key programmer på Infectious Disease (2012ZX10002007-003). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

mykoplasma er pleomorphic, vegg gratis, prokaryote organismer som befinner seg enten på eukaryote cellemembraner eller inne i cellene, og de er de minste organismene stand til selv replikering [1]. Hittil har minst 16 mycoplasma arter blitt isolert fra mennesker [2]. Mycoplasma hyorhinis product: ( M.hy
) ble ansett som ikke-patogene for mennesker som det vanligvis infiserer svin som fører til luftveissykdommer og betennelse i brystet og ledd [3], [4] . Men, samler bevis tyder på at M.hy
infeksjon hos mennesker vil resultere i kliniske utfall. M.hy
ble funnet i 56% av gastrisk karsinom, 55% av colon-karsinom og 52,6% av lungekarsinom biopsier [5]. Videre 36% menn med benign prostatahyperplasi (BPH) og 52% menn med prostatakreft er M.hy
sero-positive. Disse kliniske funnene tyder på en mulig sammenheng mellom M.hy
eksponering med mage, tykktarm, lunge og prostata kreft [5], [6].

Ved mikrobiell infeksjon, vert mønstergjenkjenning reseptorer ( PRRS) som TLR'ene avføle patogener og utløse syntesen av pro-inflammatoriske cytokiner som pro-IL-1β og pro-IL-18 via NF-kB-aktivering. På samme tid, en annen gruppe av PRRS inkludert NLRP3 rekruttere adapteren protein ASC og føre til aktivering av kaspase-1, som er en aktiv protease som spalter forløperen form av cytokiner inkludert pro-IL-1β og pro-IL-18 inn i modne, utskilte form [7]. Patogener eller utfordrende agenter forårsake kalium utstrømming, mitokondrier skade, mitokondrier DNA utgivelse, ROS produksjon, intracellulær kalsium økning eller cellular syklisk AMP nedgang i medfødte immunceller, som alle er involvert i caspase-1 aktivering [8], [9], [10 ], [11], [12], [13]. I løpet av denne prosessen, NLRP3, ASC og pro-caspase-1 danner en molekylær plattform kalt inflammasome. Hittil har en rekke inflammasomes har blitt identifisert, av dem, NLRP3 inflammasome er funnet forbundet med tumorutvikling [14], [15], selv om uenighet eksisterer fra forskjellige modeller [16], [17]. Likevel ble IL-1β rapportert å fremme tumorcellevekst og metastase ved å indusere flere pro-metastatiske gener som matriks-metalloproteinaser og endotelceller adhesjonsmolekyler, så vel som TGF-β, chemokiner og vekstfaktorer [18]. I en koreansk befolkning, er en kombinasjon av økt mucosal IL-1β nivå og homozygositet for IL-1β -31T enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) begge forbundet med økt risiko for magekreft [18]. Videre Tu et al. funnet at mage-spesifikk ekspresjon av humant IL-1β i transgene mus førte til spontan mage betennelse og kreft, [19], noe som ytterligere antyder at IL-1β kan fremme human magekreftutvikling. I motsetning til IL-18 forbedrer NK-celleaktivitet, reduserer tumorgenese, induserer apoptose og hemmer angiogenese i tumorceller for å utøve anti-tumoreffekter [20], [21]. I tillegg ble en upassende produksjon av IL-18 funnet å bidra til patogenesen av kreft, og kan påvirke det kliniske resultatet av pasienter [22]. IL-18 er rapportert å stimulere matriksmetalloprotease-9-produksjon, noe som resulterer i økt migrering og invasjon i koronararteriene glatte muskelceller og HL-60-myeloide leukemiceller [23], [24]. Det ble også rapportert at serum IL-18-nivået i magekreft pasientgruppen var signifikant høyere enn i magesår pasientgruppe [25] og IL-18 kan øke metastase og immun rømning av magekreft til ved nedregulering av CD70 og vedlikehold av CD44 i human magekreft cellelinje NCI-N87 og SNU16 [26]. Det er også en viktig formidler av VEGF-økt migrasjon i humane mage kreft cellelinjer SNU-601 [27]. Ovennevnte funn tyder på at Mycoplasma hyorhinis
kan fremme migrasjon og invasjon av magekreftceller ved å aktivere inflammasome.

Til dags dato, et bredt spekter av mikrober inkludert virus, bakterier, sopp og protozoer har vært identifisert for å aktivere NLRP3 inflammasome [28]. En fersk studie viste at Mycoplasma pneumoniae
var også i stand til å indusere IL-1β produksjon i humane celler [29]. Men om M.hy
, noe som er en viktig faktor i magekreftutvikling som nevnt ovenfor, [5], [30], [31], aktiverer NLRP3 inflammasome og om dette aktivering bidrar til magekreft utvikling er fortsatt ukjent. I denne studien fant vi at M.hy
utløst IL-1β sekresjon i en NLRP3 inflammasome avhengig måte, og den resulterende IL-1β indusert migrasjon og invasjon av mage kreftceller.

resultater

M.hy
triggere IL-1β og IL-18 Produksjonen i THP-1 celler

For å finne ut om M.hy
induserer IL -1β produksjon fra medfødte immunceller, overvåket vi modne IL-1B nivåer i menneskelig monocyttisk cellelinje THP-1 celler utfordret med ulike mengder av M.hy
. I dette eksperimentet, ble en sterk induksjon av IL-1β på en doseavhengig måte observert (figur 1A). Deretter målte vi pro-IL-1β mRNA-nivåer i celler og modne IL-1β proteinnivåer i kultursupernatantene ved forskjellige tidspunkter etter M.hy
utfordring. Det ble observert at IL-1β mRNA-nivåer nådde en topp på 3 timer etter utfordring (figur 1B) og modent IL-1β (figur 1C) og IL-18 (figur 1D) proteinnivåer nådde en topp på 12 timer etter utfordring. Dessuten, THP-1-avledede makrofager også oppviste sterk sekresjon av IL-1β, IL-18, så vel som andre inflammatoriske cytokiner så som IL-6 og IL-8 (figur 1E, fig S1). For å bekrefte ovennevnte funn i THP-1 cellelinjen, undersøkte vi IL-1β produksjon i primære, humane monocytter fra friske donorer utfordret med M.hy
, karakterisert ved at IL-1β ble også sterkt indusert (figur 1F) . Disse data indikerte at M.hy
utløst robust IL-1β og IL-18 sekresjon fra humane myeloide celler.

LAMP avledet fra M.hy
er ansvarlig for IL -1β Induksjon gjennom TLR2

Neste vi undersøkt om replikering av M.hy
var nødvendig for IL-1β produksjon i monocytter. Som vist i figur 2A, M
.hy
inaktiveres ved oppvarming eller ultrafiolett (UV) behandling indusert så mye IL-1β sekresjon fra THP-1 celler som lever M .hy
. Dette indikerte at visse varme- og UV-bestandig del av M.hy
var ansvarlig for induksjon av IL-1β sekresjon. Lipid-assosiert membranprotein (lampe) er rikelig uttrykt på overflaten av M.hy product: [32], og tidligere studie funnet at membran-lipoproteiner fra andre mycoplasma-arter indusert IL-1β sekresjon [33]. Vi derfor spekulert i at M.hy
avledet LAMP (MLAMP) kan være ansvarlig for IL-1β induksjon i THP-1 celler. Vi så ekstrahert LAMP fra M.hy plakater (figur 2B) og testet evnen til MLAMP å indusere IL-1β sekresjon i THP-1 celler. Vi fant at MLAMP tydelig indusert sekresjon av IL-1β på en doseavhengig måte, mens den vandige fasen til M.hy
ekstrakt var ikke i stand til å gjøre dette (figur 2C). For å utelukke mulige RNA og /eller DNA-kontaminering i MLAMP, behandlet vi MLAPMs med RNase og DNase og fant at MLAMP var den viktigste komponenten for IL-1β induksjon (figur S2).

Det ble rapportert at MLAMP aktivert hovedsakelig NF-kB via TLR2 og TLR6 [34], [35]. Derfor må vi først påføres et TLR2 nøytraliserende antistoff T2.5 å blokkere TLR2 signal, med ConT2 fungerer som en isotypekontrollantistoff [36]. Som vist i figur 2D, T2.5 blokkerte fullstendig IL-1β sekresjon stimulert av TLR2 agonist P3CSK4 men ikke av TLR4 ligand LPS. Viktigere, IL-1β sekresjon fra M.hy
infiserte celler ble sterkt redusert med T2.5, noe som indikerer at TLR2 var involvert i MLAMP utløste IL-1β sekresjon i humane monocytter. Interessant, IL-1β sekresjon fra M.hy
infiserte celler ble ikke fullstendig blokkert av T2.5 (figur 2D), som foreslo at TLR2-uavhengige signalveien var også involvert i MLAMP utløste IL-1β sekresjon, som fortjener videre undersøkelser i fremtiden.

M.hy
induserer IL-1β sekresjon gjennom aktivering av NLRP3 Inflammasome

for å teste om M.hy
indusert IL-1β sekresjon gjennom inflammasome aktivering, vi først utnyttet LPS primet THP-1-avledede makrofager for å undersøke om M.hy
kan aktivere inflammasome som ATP eller MSU, som er kjent inflammasome aktivatorer. Som vist i figur 3A, M
.hy
var i stand til å indusere IL-1β utgivelse i primet celler. Neste vi undersøkte spalting av caspase-1 og oligomerisering av ASC, to viktige beslutningstakere for inflammasome aktivering. Vi fant ut at M.hy
fremmet spalting av caspase-1 og oligomerisering av ASC (figur 3B), noe som indikerer en direkte aktivering av inflammasome av M.hy.

videre testet vi om M.hy
indusert IL-1β sekresjon var avhengig av visse inflammasome komponenter. For det første har vi funnet at den spesifikke caspase-1-inhibitor AC-YVAD-CHO redusert IL-1β sekresjon i THP-1-celler på en doseavhengig måte (figur 3C). Deretter da bestemt shRNA ble ansatt for å dempe uttrykket av caspase-1 og ASC (figur 3D), IL-1β produksjonen ble sterkt redusert på M.hy
utfordring (figur 3E), noe som indikerer at M.hy
indusert IL-1β sekresjon var avhengig av caspase-1 og ASC.

Da vi testet om NLRP3 var nødvendig for M.hy
indusert IL-1β sekresjon. Først fant vi at NLRP3 inhibitor Glybenclamide trykkes M.hy
indusert IL-1β sekresjon på en doseavhengig måte (figur 3F) [37]. Når spesifikk shRNA ble ansatt for å dempe uttrykk for NLRP3 (figur 3G), ble IL-1β produksjon sterkt redusert på M.hy
utfordring (figur 3 H), noe som indikerer at M.hy
induserte IL-1β sekresjon var avhengig av NLRP3. Dette ble ytterligere bekreftet ved immunblotting, hvor caspase-1-aktivering og IL-1β produksjon var begge NLRP3 avhengig (figur 3I). Videre fant vi videre at MLAMP var den største komponenten ansvarlig for NLRP3 inflammasome aktivering av M.hy plakater (figur S2C). I tillegg ble AIM2 inflammasome rapportert å bli aktivert av DNA [38], og vi fant ut at M.hy
DNA indusert IL-1β sekresjon via AIM2 inflammasome (figur S3A). Interessant, M.hy
indusert IL-1β sekresjon var i hovedsak avhengig NLRP3, mens AIM2 var bare delvis involvert (figur S3A). Samlet utgjør disse resultatene tydelig demonstrert at M.hy
indusert IL-1β sekresjon gjennom aktivering av NLRP3 inflammasome i menneskelige monocyttiske celler.

mekanismene bak M.hy
utløst NLRP3 inflammasome aktiverings

Aktivering av NLRP3 inflammasome ved en rekke stimuli, avhenger av Cathepsin B-aktivitet, K ^{+ effluks, kalsiuminnstrømning og /eller produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) [11], [ ,,,0],12], [13], [39]. For å utforske mekanismene bak IL-1β utgivelse i respons til M.hy
utfordring, vi først har søkt Cathepsin B-spesifikk hemmer CA-074 Me og observert en betydelig svekkelse av IL-1β sekresjon på M .hy
utfordring. Ved en konsentrasjon på 100 uM, CA-074 Me blokkerte fullstendig IL-1β frigjøring (figur 4A). Denne inhibering var ikke på grunn av noen toksisk effekt på cellene som IL-8-sekresjon påvirkes ikke av denne inhibitor var meget mild (figur 4E). Viktigst er at når cellene ble behandlet med Cathepsin K-inhibitor I, reduksjonen av IL-1β sekresjon var ikke synlig i det hele tatt (figur 4B og 4F), noe som tyder på at den Cathepsin B-aktivitet ble spesielt involvert i NLRP3 inflammasome aktivering i løpet av M .hy
utfordring. I tillegg, når vi blokkert K + effluks ved å øke ekstracellulære K + konsentrasjon, IL-1β sekresjon av THP-1-celler ved M.hy
utfordring ble signifikant redusert på en dose avhengig måte (figur 4C). Igjen var det ingen toksisk virkning fra KCL som IL-8 produksjon fra de samme cellene ble normal (figur 4G). For å finne ut hvorvidt kalsiuminnstrømningen hjalp inflammasome aktivering, tilsatte vi forskjellige doser av EGTA i cellekulturmediet, og fant at EGTA behandling blokkert M.hy
-indusert IL-1β sekresjon på en doseavhengig måte, og ingen toksisk virkning fra EGTA ble observert som gjenspeiles av IL-8 produksjon (figur 4D og 4H).}

Videre har vi testet om M.hy
utfordring indusert ROS generasjon i THP-1 celler . For denne analysen ble det THP-1-celler først lastet med redoks-følsomme fluorofor DCFDA og deretter utfordret med M.hy
, ATP ble inkludert som en positiv kontroll. Som vist i figur 5A, ble 16,9% CM-H2DCFDA-positive celler detektert 30 minutter etter M.hy
behandling sammenlignet med 1,6% i ubehandlede celler. Disse data antydet at ROS kan bidra til NLRP3 inflammasome aktivering i respons til M.hy
utfordring. For å bekrefte denne muligheten, forbehandlet vi THP-1 celler med ROS-hemmer difenyljodoniumheksa (DPI) i 30 minutter, og deretter utfordret cellene med M.hy
før måling av IL-1β produksjon 6 timer senere. Som forventet, DPI dramatisk redusert M.hy
indusert IL-1β frigjøring (figur 5B). En fersk studie viste at ROS-hemmer som DPI opphevet IL-1β utgivelse i musemakrofager ved å hemme NLRP3 genekspresjon [40]. Derfor overvåket vi også mRNA nivå av pro-IL-1β og NLRP3 henhold DPI behandling. Vi fant at DPI markert redusert ekspresjon av pro-IL-1β og NLRP3 (Figur 5C-D), som var i overensstemmelse med det funn fra museceller [40]. I tillegg har vi også undersøkt aktivering av caspase-1 og funnet ut at lave doser (1 eller 10 mm) av DPI behandling ikke påvirke caspase-1 aktivering mens 100 mikrometer av DPI hemmet caspase-1 aktivering (figur 5E). Dette viser at i humane celler DPI forstyrret NLRP3 inflammasome aktivisering gjennom hemming av NLRP3 transkripsjon samt caspase-1 aktivitet når høye doser ble brukt. Sammen er disse data tyder på at Cathepsin B-aktivitet, K ^{+ utstrømming, Ca 2 + strøm og ROS alle bidratt til NLRP3 inflammasome aktivering i respons til M.hy
utfordring.}

M.hy
Aktiverer NLRP3 Inflammasome in vivo

Når musen benmarg avledet dendrittiske celler (BMDCs) ble infisert med M.hy
, en vedvarende IL-1β induksjon ble observert (figur 6A). Ytterligere eksperimenter på BMDCs isolert fra villtype (WT) mus eller mus mangelfulle for caspase-1, ASC eller NLRP3 med M.hy
utfordring bekreftet at M.hy
induksjon av IL- 1β var NLRP3 inflammasome avhengig (Figur 6B). Videre har systemisk inokulering av M.hy
i WT mus induserte IL-1β produksjon i serum og peritoneal vaskevæske (PLF), men ikke i mus som mangler ASC eller NLRP3 (figur 6C-D). Interessant, basalnivået av IL-1β i ASC mangelfull mus var klart høyere enn det i WT eller NLRP3 mangelfull mus, men utfordring med M.hy
ikke ytterligere å øke sekresjonen av IL-1β i slike mus (Figur 6C-D). Sammen er disse funnene bekreftet at M.hy
også aktivert NLRP3 inflammasome i mus in vitro Hotell og in vivo
.

M. hy
indusert IL-1β Fremmer Gastric Tumor Cell migrasjon og invasjon

dataene ovenfor tydelig viste at M.hy
var i stand til å indusere IL-1β produksjon fra medfødte immunceller gjennom NLRP3 inflammasome aktivering. Tidlige epidemiske studier viste en mulig rolle av mykoplasma i utvikling av magekreft [5]. Og Mycoplasma hyorhinis
ble demonstrert for å fremme svulst celle migrasjon, invasjon og metastase in vitro Hotell og in vivo product: [41]. Vi antok at det kan eksistere en annen mekanisme for denne kampanjen, som er at M.hy
kan fremme magekreftutvikling og /eller metastase ved å fremme IL-1β produksjon. Og vi bekreftet at M.hy
fremmet magekreft celle migrasjon og invasjon (figur S5). Siden M.hy
ble demonstrert for å infisere mage kreftceller ([41], figur S4), er det derfor mulig at M.hy
kan indusere inflammasome aktivering i kreftceller direkte. Men ingen inflammasome aktivering ble påvist i magecancerceller (figur S6).

Deretter ble effekten av humant rekombinant IL-1β (rIL-1β) på magekreftcelle karsinogenese i en kolonidannelsesbestemmelsen, hvilken avslørte at rIL-1β ikke påvirket spredning av magekreft cellelinje MGC-803 (figur S7). Siden IL-1β ble rapportert å fremme metastasering av andre svulster [18], sjekket vi effekten av rIL-1β på migrasjon og invasjon av MGC-803 celler. Våre resultater viste at MGC-803 migrering og invasjon ble forbedret med rIL-1β behandling (figur 7A og 7C), mens behandling med rIL-18 ikke viste noen effekt (figur 7B og 7D). Deretter behandlet vi disse magekreftceller med kultursupernatantene fra M.hy
utfordret THP-1 avledet makrofager eller makrofager med å stanse all NLRP3, ASC og caspase-1 for migrasjon og invasjon analysen. Våre resultater viste at kultursupernatantene fra M.hy
utfordret krafse makrofagceller sterkt forbedrede migrasjon og invasjon av magekreftceller, mens kultursupernatantene fra NLRP3, ASC eller caspase-1 knockdown makrofager ikke, sannsynlig på grunn av den reduserte IL-1β sekresjon (Figur 8A og 8C). Denne forbedrede migrering og invasjon av MGC-803-celler ble fjernet ved å behandle cellene med anti-IL-1β mAb (figur 8B og 8D). Til sammen våre resultater viste at M.hy
indusert migrasjon og invasjon av magekreft cellelinje MGC-803 ved å fremme IL-1β sekresjon fra monocyttiske celler. Videre våre data tydet på at M.hy
indusert inflammasome aktivering kan fremme M.hy
replikering (figur S8), noe som kan skape en positiv tilbakemelding og til slutt fører til kroniske sykdom.

Diskusjoner

mykoplasma skille seg fra andre bakterier ved liten størrelse, minutt genom og mangel på celleveggen. Mange mykoplasma etablere kolonisering og infeksjon via tilslutning til vert vev. Fordi deres dynamiske flate arkitektur er antigent og funksjonelt allsidig, mycoplasmas er i stand til å gå utenom vertens immunangrep og tilpasse seg mange habitater og forårsaker kroniske sykdommer [32]. Etter identifisering av M.hy
fra svin i 1962, ble liten undersøkelse utført på dette patogenet inntil det ble funnet å være assosiert med flere humane cancere [5], [41], [42], [ ,,,0],43]. Mer nylig har forskere funnet ut at M.hy
protein p37 var ansvarlig for å fremme kreftcelle invasivitet og metastasering [30], [44]. I tillegg til denne direkte mekanismen, kan dette mikrobe også indusere tumorigenesis eller metastase indirekte gjennom en lokal kronisk inflammatorisk prosess. Det er vel kjent at IL-1β er et viktig proinflammatorisk cytokin som fremmer veksten av kolon kreftceller og forbedrer invasivitet og metastase av B16 melanomceller [19], [45]. Overekspresjon av IL-1β ble funnet å indusere gastrisk betennelse og kreft hos mus [19]. I denne studien undersøkte vi hvorvidt NLRP3 inflammasome, som kontrollerer IL-1β modning, ble aktivert ved M.hy
, og hvorvidt denne aktivering kan bidra til M.hy
ulcus ventriculi metastase . Våre resultater viste at M.hy
aktivert NLRP3 inflammasome in vitro Hotell og in vivo
, og fremming av magekreft celle migrasjon og invasjon av M .hy
var avhengig NLRP3 inflammasome aktivering. Foruten NLRP3, fant vi at M.hy
DNA aktivert også AIM2 inflammasome, men MLAMP aktivering av NLRP3 var den dominerende komponent for IL-1β induksjon av M.hy.

Det ble nylig rapportert at acylert lipopeptid fra varme drept mycoplasma Acholeplasma laidlawii plakater (HKAL) indusert IL-1β produksjon gjennom NLRP7 inflammasome i humane celler, mens total HKAL indusert IL-1β sekresjon var delvis NLRP3 avhengig [46], noe som indikerer at flere inflammasomes kan aktiveres ved visse mycoplasma. Våre data ikke utelukke mulige involvering av NLRP7 i M.hy
indusert IL-1β produksjon, men M.hy
aktivert hovedsakelig NLRP3 inflammasome, fordi IL-1β sekresjon var nesten fullstendig avskaffet i NLRP3 forstummet celler (Figur 3H og 3i).

Tidlige studier foreslått at ROS aktivert NLRP3 inflammasome ved å aktivere caspase-1 [47]. Men fersk undersøkelse viste at ROS-hemmere forstyrret transkripsjon av IL-1β og NLRP3, men ikke berørt aktivering av caspase-1 i museceller [40]. I vår studie, selv om ROS hemming med lav dose DPI (10 mm) betydelig redusert IL-1β produksjon på M.hy
utfordring, det hemmet ikke caspase-1 cleavage, markør for inflammasome aktivering. Når imidlertid høy dose av DPI (100 pM) ble påført, caspase-1-spaltningssetet var tydelig hemmet (figur 5E), noe som tyder på at høye doser av DPI kan undertrykke montering av inflammasome kompleks, selv om vi ikke kan utelukke en mulighet for at denne effekten kanskje har blitt ført fra NLRP3 mRNA avskaffe fra baseline (figur 5D). Det er sannsynlig at ROS-hemmer kan forstyrre både pro-IL-1β syntese og caspase-1 aktivering.

Hvordan M.hy
fremmer ROS produksjon i makrofag fortsatt ukjent. Mangelen på celleveggen fra M.hy
tillater direkte kontakt mellom membranen og mycoplasma vertscellemembran, og denne kontakt kan føre til sammensmelting av mykoplasma med eukaryotisk vertscelle. Denne fusjon kan ikke bare føre til mycoplasma komponenter som leverer inn i vertscellen, men også tillate innføring av mykoplasma membrankomponenter inn i membranen av den eukaryote vertscellen. Nylig, M.hy
membranene ble funnet å ha fosfolipase A (PLA), som kan være involvert i plasmamembranen avbrudd prosess som skjer ved invasjon av vertsceller [48], [49]. I løpet av denne prosessen, kan vertscellene produserer ROS. Det ville være verdt å undersøke om PLA er nødvendig for M.hy
indusert ROS produksjon og IL-1β sekresjon.

Som dokumentert av våre data, lysosomal brudd, K ^{+ utstrømming, Ca 2 + strøm og ROS var alle involvert i M.hy
indusert NLRP3 aktivering. Som rapportert tidligere, K + effluks og phagolysosomal brudd kanskje indusere Ca 2+ tilstrømning, mens Ca 2+ tilstrømning kan føre til dysfunksjon av mitokondrier, noe som resulterer i frigjøring av oksydert mitokondrie DNA (mtDNA) i cytosol, hvor det bindes til og aktivere NLRP3 inflammasome [9], [12]. Mitokondrier synes å fungere som et sentralt knutepunkt for integrering av ulike signaler registrert av NLRP3, men den relative bidraget av ROS og mtDNA for NLRP3 inflammasome aktivering er fortsatt ikke klart å date [9].}

Selv om M .hy
er ikke svært virulente, kan det etablere kronisk infeksjon. Ved en gradvis og progressiv interaksjon med vertsceller induserer det kromosom ustabilitet og ondartet transformasjon, og dermed fremme tumorvekst, migrasjon eller invasjon [50], [51]. M.hy
p37 protein fremmet magekreft celle, prostata karsinom og melanom cellelinjer invasivitet [30], [31]. I tillegg kan de pro-inflammatoriske mikromiljøet, for eksempel IL-1β produksjon også bidra til denne prosessen [19]. Vår studie fant at M.hy
indusert IL-1β forfremmet migrasjon og invasjon av mage kreftceller, mens M.hy
indusert IL-18 ikke bidra til migrasjon og invasjon av magekreftceller, som var forskjellig fra andre rapporter [26], [27]. En mulig forklaring er at IL-18 kan ha fremmet magekreftceller migrasjon og invasjon via regulering av CD70, CD44 og VEGF uttrykk i immunceller, som fortjener vår videre etterforskning [26]. En annen forklaring kan være at dosen av rIL-18 de brukes (150 ng /ml) er mye høyere enn hva vi har brukt [27]. Videre IL-1β fremmet migrering og invasjon av magekreftcellene kan være mediert av matriks-metalloproteinase-9 (MMP9) som andre søkere rapportert [52]. Men for å få direkte og mer solide bevis og de tilsvarende mekanismer om sammenhengen mellom NLRP3 inflammasome aktivering utløst av M.hy, etter og magekreft metastaser, egnede dyremodeller som for eksempel in vivo
tumorinvasjon analyse [53] og pasient studier er nødvendig for videre studier i fremtiden.

Materialer og Metoder

Cell Kultur

THP-1 celler, PMA-indusert makrofager og magekreft celle MGC-803 ble opprettholdt i RPMI 1640 medium med essensielle kosttilskudd. Humane monocytter ble isolert ved Percol TM tetthet-gradient sentrifugering (GE Healthcare, Bio-vitenskap, Sverige) fra humane perifere mononukleære blodceller (PBMC) oppnådd fra Shanghai Blood senter (Shanghai, Kina).

M.hy
Strain og PCR Detection

M.hy
belastning brukes i vår studie er hentet fra forurenset cellekultur. Mykoplasma påvisning ble utført gjennom to runder med PCR med cellekulturmedium [54]: Først kjører PCR med fire primere 5'-ACACCATGGGAGYTGGTAAT-3 ', 5'-CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT-3', 5'-AAAGTGGGCAATACCCAC GC-3 ', 5'-TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG-3 'med celle dyrket medium som templat. For det andre tar 1 pl av den ovenfor angitte PCR-produkt som templat og drives PCR med tre primerne 5'-GTGSGGMTGGATCACCTCCT-3 ', 5'-GCATCCACCAWAWACY CTTT-3', 5'-CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT-3 '. Den første og andre PCR kjøres under den samme syklus tilstand. Da vi sekvensert PCR-produktet og erholdt de følgende sekvenser: ACTCTTACTTAATTTAAAAGTTAATACAACTTTAATATT GCCTATTATTGCTAAAGATAAATATCTTAAGGTATTTTAATATTGGTAATCTATTTTAGAAATTTAATTTAAAAATTAAACTCGGTTATAAAAAAGATCGTTGAAATAATAAATATGAAGTTAATCATATTGTTATTTGCTATTCAGTTTTCAAAGAACTATAATTGAGAACTTAAAGCTCTCAAAACTAGACACGAATCGATTATGTAATAAGTCAATTAAGACTAACGGAAAGCGGAAAAAGAAGGTGATCCGTCCCCACG. Ved BLAST i NCBI database, fikk vi informasjon om at mycoplasma er M.hy
. Det kan være SK76, GDL-en eller MCLD belastning.

M.hy
Kultur, DNA Extraction og MLAMP Forberedelse

M.hy
var dyrket i modifisert SP-4 medium inneholdende 20% nyfødt bovint serum, 10% gjærekstrakt, 1% glukose, 0,00024% phenolsulfonphthalein, og 1000 IU /ml penicillin. DNA-ekstraksjon fra M.hy
ble gjennomført i henhold til instruksjonene med reagensene som tilbys av Shanghai Lifefeng Bioteknologi Co, Ltd M.hy
ble kvantifisert som fargeendring heter (CCU) per milliliter, som beskrevet [55]. Utvinning av MLAMP ble utført som beskrevet tidligere [34].

Real-time PCR

NLRP3 og IL-1β mRNA uttrykk ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR. Relativ kvantifisering av gener ble normalisert mot en endogen kontroll β-aktin via formel [2 ^{-ΔCt (target gen-β-aktin)]. Primerne som ble benyttet var: Homo sapiens (hs) IL-1β, 5'-CACGATGCACCTGTACGATCA- (forover) 3 ', 5'-GTTGCTCCATATCC TGTCCCT- (revers) 3'; p-aktin, 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG- (fremover) 3 ', 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC- (bakover) 3'; NLRP3, 5'-AAGGGCCATGGACTATTTCC- (fremover) 3 ', 5'-GACTCCACCCGATGACAGTT- (bakover) 3'. M.hy
DNA kopier ble dertermined ved kvantitativ real-time PCR med standard-kurve metodikk for absolutt kopiantall. De spesifikke primere for M.hy
var:. 5'CGATTCGTGTCTAGTTTTGAG - (fremover) 3 ', 5'ATTGCCTATTATTGCTAAAG - (bakover) 3'}

ELISA

supernatanter fra dyrkede celler, mus serum og mus peritoneal vaskevæske ble analysert for cytokiner IL-1β, IL-18, IL-6 eller IL-8-sekresjon ved hjelp av ELISA (BD Biosciences) i henhold til produsentens instruksjoner.

generering av THP-1 celler som uttrykker shRNAs målretting gener av interesse

shRNA vektorer mot menneske NLRP3, caspase-1 og ASC, og deres krafse vektorer er gaver fra Dr. Jurg Tschopp [56]. Om genereringen av THP-1-celler som uttrykker shRNAs, går i korthet nt GATGCGGAAGCTCTTCAGTTTCA av human ASC kodende sekvens, nt CAGGTTTGACTATCTGTTCT av human NLRP3 kodende sekvens, nt GTGAAGAGATCCTTCTGTA av 3'-UTR av human caspase-1 ble innført i pSUPER.

• PLoS ONE: Negativ Node Count Forbedring Prognostic Prediksjon av den syvende utgaven av TNM klassifisering for magekreft
• PLoS ONE: Natural History of Ondartet Bone Disease in Gastric Cancer: endelige resultatene av en multi Bone Metastase Survey