PLOS ONE: Mycoplasma hyorhinis Activa la NLRP3 inflamasoma y promueve la migración y la invasión de células de cáncer gástrico

Extracto

Antecedentes

Mycoplasma hyorhinis gratis ( M.hyorhinis, M.hy
) se asocia con el desarrollo de cáncer gástrico y de próstata. Inflamasoma NLRP3, un complejo de proteínas que controla la maduración de las citoquinas pro-inflamatorias importantes interleuquina (IL) -1β e IL-18, también está involucrado en la tumorigénesis y metástasis de varios tipos de cáncer.

Metodología /Principales conclusiones

para aclarar si M.hy
ha promovido el desarrollo de tumores a través de la activación inflamasoma, se analizaron los monocitos de IL-1β e IL-18 de producción en M.hy
desafío. Cuando se expone a M.hy
, monocitos humanos exhiben rápida y robusta IL-1β y IL-18 secreción. Se identificaron además que la proteína de membrana asociada a lípidos (LAMP) de M.hy
era responsable de la inducción de IL-1β. La aplicación de inhibidores competitivos, shRNA gen específico y ratones de genes dirigidos, se verificó que M.hy
ha inducido la secreción de IL-1β fue NLRP3 dependiente de in vitro en
y in vivo
. actividad de la catepsina B, K ^{+ flujo de salida, Ca 2 + afluencia y la producción de ROS eran todos necesarios para la activación inflamasoma NLRP3 por M.hy
. Es importante destacar que, es IL-1β, pero no IL-18 producido a partir de macrófagos estimulados con M.hy
promovió la migración de células de cáncer gástrico y la invasión.}

Conclusiones

Nuestros datos sugieren que la activación de la inflamasoma NLRP3 por M.hy
puede estar asociada con la promoción de la metástasis del cáncer gástrico, y anti- M.hy
terapia o la limitación de la señalización NLRP3 podría ser enfoque eficaz para el control de del progreso del cáncer gástrico

Visto:. Xu Y, Li H, Chen W, Yao X, Y Xing, Wang X, et al. (2013) Mycoplasma hyorhinis
Activa la NLRP3 inflamasoma y promueve la migración y la invasión de células de cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (11): e77955. doi: 10.1371 /journal.pone.0077955

Editor: Suresh Yenugu, Universidad de Hyderabad, India

Recibido: 5 de Junio, 2013; Aceptado: September 6, 2013; Publicado: 6 Noviembre 2013

Derechos de Autor © 2013 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de 100 Programa Talento de la Academia china de Ciencias, la Fundación de Ciencias Naturales de china (91029707, 31170868), fundación de Shanghai de Ciencias Naturales (11ZR1442600), Fundación de Investigación de Novo Nordisk-CAS, Programa de becas SA-SIB, así como becas de los programas nacionales esenciales sobre Enfermedades Infecciosas (2012ZX10002007-003). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

los micoplasmas son libres de pared organismos pleomórficos, procariotas, ya sea que residen en las membranas de las células eucariotas o dentro de las células, y son los organismos más pequeños capaces de autorreplicación [1]. Hasta la fecha, al menos 16 especies de micoplasmas se han aislado de los seres humanos [2]. Mycoplasma hyorhinis gratis ( M.hy
) se consideró no patógeno para los seres humanos, ya que normalmente infecta a los cerdos que conduce a la enfermedad de las vías respiratorias y la inflamación del pecho y articulaciones [3], [4] . Sin embargo, la evidencia acumulada sugiere que M.hy
la infección en los seres humanos da lugar a resultados clínicos. M.hy
se encontró en el 56% de carcinoma gástrico, el 55% de los carcinomas de colon y el 52,6% de las biopsias de carcinoma de pulmón [5]. Por otra parte, 36% de hombres con hiperplasia benigna de próstata (HBP) y 52% de hombres con cáncer de próstata son M.hy
sero-positivo. Estos hallazgos clínicos sugieren una posible conexión entre los M.hy
exposición con gástrico, de colon, de pulmón y de próstata [5], [6].

Tras la infección microbiana, modelo de acogida receptores de reconocimiento ( RRP) como TLRs sentido, los agentes patógenos y activar la síntesis de citoquinas pro-inflamatorias tales como la pro-IL-1β y pro-IL-18 a través de la activación de NF-kB. Al mismo tiempo, otro grupo de PRRs incluyendo NLRP3 reclutar la ASC proteína adaptadora y conducir a la activación de caspasa-1, que es una proteasa activa que escinde la forma precursora de citoquinas incluyendo pro-IL-1β y pro-IL-18 en forma madura, secretada [7]. Patógenos o agentes desafiantes provocan la salida de potasio, el daño mitocondrial, la liberación de ADN mitocondrial, la producción de ROS, aumento de calcio intracelular o celular disminución del AMP cíclico en las células inmunes innatas, los cuales están involucrados en la activación de la caspasa-1 [8], [9], [10 ], [11], [12], [13]. Durante este proceso, el NLRP3, ASC y pro-caspasa-1 forma una plataforma molecular llamada inflamasoma. Hasta el momento, un número de inflamosomas han sido identificados, de ellos, el inflamasoma NLRP3 se ha encontrado asociada con el desarrollo de tumores [14], [15], aunque existe controversia de diferentes modelos [16], [17]. No obstante, se informó de IL-1β para promover el crecimiento de células tumorales y la metástasis mediante la inducción de varios genes pro-metastásicos, tales como metaloproteinasas de la matriz y moléculas de adhesión endoteliales, así como TGF-β, quimiocinas y factores de crecimiento [18]. En una población de Corea, la combinación de una mayor nivel de IL-1β de la mucosa y la homocigosis para la IL-1β -31T polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) se asocian con un aumento del riesgo de cáncer gástrico [18]. Además, Tu et al. se encontró que la expresión de estómago específico de IL-1β humana en ratones transgénicos condujo a la inflamación gástrica espontánea y el cáncer [19], lo que sugiere que la IL-1β puede promover la carcinogénesis gástrica humana. Por el contrario, IL-18 aumenta la actividad de las células NK, reduce la tumorigénesis, induce la apoptosis y la inhibe la angiogénesis en las células tumorales para ejercer efectos anti-tumorales [20], [21]. Además, se encontró una producción inadecuada de IL-18 para contribuir a la patogénesis de los cánceres y puede influir en el resultado clínico de los pacientes [22]. IL-18 se informó para estimular la producción de matriz de metaloproteasa-9, lo que resulta en aumento de la migración y la invasión en la arteria coronaria células musculares lisas y células HL-60 de leucemia mieloide [23], [24]. También se informó que el suero nivel de IL-18 en el grupo de pacientes con cáncer gástrico fue significativamente más alta que en la úlcera gástrica grupo de pacientes [25] y la IL-18 puede aumentar la metástasis y el escape inmunológico de cáncer de estómago a través de la regulación por disminución de CD70 y mantenimiento de CD44 en la línea celular de cáncer gástrico humano NCI-N87 y SNU16 [26]. También es un mediador crítico de la migración VEGF-mejorado en líneas celulares de cáncer gástrico humano SNU-601 [27]. Los resultados anteriores sugieren que Mycoplasma hyorhinis
puede promover la migración y la invasión de células de cáncer gástrico mediante la activación de inflamasoma.

Hasta la fecha, un amplio espectro de microbios incluyendo virus, bacterias, hongos y protozoos han sido identificado para activar el inflamasoma NLRP3 [28]. Un estudio reciente mostró que Mycoplasma pneumoniae
también fue capaz de inducir la producción de IL-1β en las células humanas [29]. Sin embargo, si M.hy
, que es un factor importante en el desarrollo del cáncer gástrico como se mencionó anteriormente [5], [30], [31], se activa el inflamasoma NLRP3 y si esta activación contribuye a la cáncer gástrico el desarrollo siguen siendo desconocidos. En este estudio, se encontró que los M.hy
desencadena la secreción de IL-1β de una manera dependiente de inflamasoma NLRP3, y la consiguiente migración inducida por IL-1β y la invasión de células de cáncer gástrico.

resultados

M.hy
disparadores IL-1β e IL-18 Producción de células THP-1

Para determinar si M.hy
induce IL -1β la producción de células inmunes innatas, que supervisa maduros niveles de IL-1ß en la línea celular de monocitos humanos THP-1 células estimuladas con diferentes cantidades de M.hy
. En este experimento, una fuerte inducción de IL-1β de una manera dependiente de la dosis se observó (Figura 1A). A continuación, se midieron los niveles de pro-IL-1β de ARNm en las células y los niveles de proteína IL-1β madura en los sobrenadantes de cultivo en diferentes puntos de tiempo después de M.hy
desafío. Se observó que los niveles de IL-1β de ARNm alcanzaron un máximo de 3 horas después de la exposición (Figura 1B) y maduro IL-1β (Figura 1C) y los niveles de proteína IL-18 (Figura 1D) alcanzó su punto máximo a las 12 horas después del desafío. Por otra parte, macrófagos THP-1 derivadas también mostraron secreción robusta de IL-1β, IL-18, así como otras citoquinas inflamatorias tales como IL-6 y IL-8 (Figura 1E, la Figura S1). Para confirmar los resultados anteriores en THP-1 línea celular, se analizó la producción de IL-1β en monocitos humanos primarios de donantes sanos expuestos a M.hy
, en el que la IL-1β también fue fuertemente inducidos (Figura 1F) . Estos datos indicaron que M.hy
desencadenó robusta IL-1β e IL-18 secreción de las células mieloides humanas.

LAMP se deriva de M.hy
es responsable de la IL inducción -1β través de TLR2

a continuación se investigó si se requiere la replicación de M.hy Opiniones de la producción de IL-1β en monocitos. Como se muestra en la Figura 2A, M
.hy
inactivado por calentamiento o ultra-violeta tratamiento (UV) inducida por la secreción de IL-1β mucho a partir de células THP-1 como en vivo M .hy
. Esto indicó que ciertos componentes resistentes al calor ya los rayos UV de M.hy
fue responsable de la inducción de la secreción de IL-1β. Lipid asociada a la proteína de membrana (LAMP) se expresa abundantemente en la superficie de M.hy
[32], y el estudio anterior encontró que las lipoproteínas de membrana de otras especies de micoplasmas inducida por IL-1β secreción de [33]. por tanto, se especuló que Lámpara M.hy
derivados (mLAMP) pueden ser responsables de la inducción de IL-1β en las células THP-1. a continuación, se extrajeron de la lámpara del M.hy gratis (Figura 2B) y puesto a prueba la capacidad de mLAMP para inducir la secreción de IL-1β en las células THP-1. Se encontró que mLAMP claramente induce la secreción de IL-1β en una forma dependiente de la dosis, mientras que la fase acuosa de M.hy
extracto no fue capaz de hacerlo (Figura 2C). Para excluir la posibilidad de ARN y /o la contaminación de ADN en mLAMP, se trataron los MLAPMs con RNasa y DNasa y se encontró que era mLAMP el componente principal para la inducción de IL-1β (Figura S2).

Se informó que mLAMP principalmente activado NF-kB a través de TLR2 y TLR6 [34], [35]. Por lo tanto, se aplicó primero una T2.5 anticuerpo neutralizante TLR2 para bloquear la señal de TLR2, con CONT2 que sirve como un control de isotipo [36]. Como se muestra en la Figura 2D, T2.5 bloqueó completamente la secreción de IL-1β estimulada por agonista TLR2 P3CSK4 pero no por los LPS ligando TLR4. Es importante destacar que la secreción de IL-1β de M.hy
células infectadas se redujo fuertemente por T2.5, lo que indica que TLR2 participó en mLAMP desencadenado la secreción de IL-1β en monocitos humanos. Curiosamente, la secreción de IL-1β a partir de células M.hy
ha infectado no fue completamente bloqueado por T2.5 (Figura 2D), lo que sugiere que la vía de señalización de TLR2 independiente también participó en mLAMP desencadena la secreción de IL-1β, que merece una mayor investigación en el futuro.

M.hy
induce la secreción de IL-1β través de la activación de la NLRP3 inflamasoma

Para probar si M.hy
inducida por la secreción de IL-1β través de la activación inflamasoma, primero se utilizó LPS cebó macrófagos THP-1 derivadas para comprobar si M.hy
puede activar inflamasoma como ATP o MSU, que son conocidos activadores inflamosoma. Como se muestra en la Figura 3A, M
.hy
fue capaz de inducir la liberación de IL-1β en las células cebadas. A continuación examinamos la escisión de la caspasa-1 y oligomerización de ASC, dos fabricantes importantes para la activación inflamasoma. Hemos encontrado que M.hy
promueve la escisión de la caspasa-1 y oligomerización de ASC (Figura 3B), lo que indica una activación directa de inflamasoma por M.hy.

por otra parte, hemos probado si M.hy
ha inducido la secreción de IL-1β dependía de ciertos componentes inflamosoma. En primer lugar, se encontró que el específico de caspasa-1 inhibidor de AC-YVAD-CHO disminución de la secreción de IL-1β en las células THP-1 de una manera dependiente de la dosis (Figura 3C). A continuación, cuando se empleó específica shRNA para silenciar la expresión de caspasa-1 y ASC (Figura 3D), la producción de IL-1β se vio fuertemente disminuida a M.hy
desafío (Figura 3E), lo que indica que M.hy
induce la secreción de IL-1β fue dependiente de caspasa-1 y ASC.

a continuación, hemos probado si se requiere NLRP3 para M.hy
inducida por la secreción de IL-1β. En primer lugar, se encontró que el inhibidor de NLRP3 glibenclamida suprime la secreción de IL-1β M.hy
ha inducido de una manera dependiente de la dosis (Figura 3F) [37]. Cuando se empleó específica shRNA para silenciar la expresión de NLRP3 (Figura 3G), la producción de IL-1β se vio fuertemente disminuida a M.hy
desafío (Figura 3H), lo que indica que M.hy
inducida por la secreción de IL-1β dependía de NLRP3. Esto fue confirmado por inmunotransferencia, en el que la producción de caspasa-1 de activación y IL-1β eran ambos NLRP3 dependiente (Figura 3I). Por otra parte, hemos encontrado, además, que mLAMP era el componente principal responsable de la activación inflamasoma NLRP3 por M.hy gratis (Figura S2C). Además, se informó AIM2 inflamasoma para ser activado por el ADN [38], y encontramos que M.hy
ADN inducida por la secreción de IL-1β a través de AIM2 inflamasoma (Figura S3 A). Curiosamente, M.hy
ha inducido la secreción de IL-1β dependía principalmente de NLRP3, mientras AIM2 era sólo parcialmente implicados (Figura S3 A). Tomados en conjunto, estos resultados demostraron claramente que M.hy
induce la secreción de IL-1β través de la activación de la inflamasoma NLRP3 en las células monocíticas humanas.

mecanismos subyacentes M.hy
Triggered NLRP3 inflamasoma activación

la activación de NLRP3 inflamasoma por una variedad de estímulos depende de la actividad catepsina B, K ^{+ de flujo de salida, la entrada de calcio y /o la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) [11], [ ,,,0],12], [13], [39]. Para explorar los mecanismos subyacentes a la liberación de IL-1β en respuesta a M.hy
desafío, se aplicó primer inhibidor de la CA-074 catepsina B-específica de mí y observó una atenuación significativa de la secreción de IL-1β en M .hy
desafío. A una concentración de 100 mM, CA-074 Me completamente bloqueado IL-1β de liberación (figura 4A). Esta inhibición no se debió a un efecto tóxico para las células como IL-8 secreción afectados por este inhibidor era muy suave (Figura 4E). Es importante destacar que, cuando las células se trataron con la catepsina K inhibidor I, la disminución de la secreción de IL-1β no era evidente en absoluto (Figura 4B y 4F), lo que sugiere que la actividad de la catepsina B estaba implicado específicamente en la activación inflamasoma NLRP3 durante M .hy
desafío. Además, cuando bloqueamos K + flujo de salida mediante el aumento de la K extracelular + concentración, la secreción de IL-1β por THP-1 células tras M.hy
desafío se redujo significativamente en una dosis de manera dependiente (Figura 4C). Una vez más, no había efecto tóxico de KCL como IL-8 de producción de las mismas células fue normal (Figura 4G). Para averiguar si la entrada de calcio ayudó activación inflamasoma, hemos añadido diferentes dosis de EGTA en el medio de cultivo celular y se encontró que el tratamiento EGTA bloqueado M.hy
inducida por la secreción de IL-1β de una manera dependiente de la dosis, y no se observó ningún efecto tóxico de EGTA como se evidencia por la producción de IL-8 (Figura 4D y 4H).}

Además, hemos probado si M.hy
desafío inducida por la generación de ROS en las células THP-1 . Para este ensayo, las células THP-1 se cargaron primero con el fluoróforo sensible a redox DCFDA y luego desafiados con M.hy
, ATP se incluyó como control positivo. Como se muestra en la Figura 5A, se detectaron 16,9% de células CM-H2DCFDA positivos 30 minutos después de M.hy
tratamiento en comparación con 1,6% en las células no tratadas. Estos datos sugirieron que ROS puede contribuir a la activación inflamasoma NLRP3 en respuesta a M.hy
desafío. Para comprobar esta posibilidad, pretratados células THP-1 con difenil-inhibidor ROS (DPI) durante 30 minutos y, a continuación, el desafío de las células con M.hy
antes de la medición de la IL-1β producción de 6 horas más tarde. Como era de esperar, el DIP reduce drásticamente M.hy
ha inducido la liberación de IL-1β (Figura 5B). Un estudio reciente mostró que el inhibidor de ROS como DPI abolió la liberación de IL-1β en macrófagos de ratón mediante la inhibición de la expresión génica NLRP3 [40]. Por lo tanto, también supervisó el nivel de ARNm de la pro-IL-1β y NLRP3 bajo tratamiento DPI. Se encontró que el DPI reduce notablemente la expresión de pro-IL-1β y NLRP3 (Figura 5C-D), que era consistente con el hallazgo de células de ratón [40]. Además, también examinamos la activación de la caspasa-1 y se encontró que dosis bajas (1 o 10 mM) de tratamiento DPI no afectó a la activación de la caspasa-1, mientras que 100 M de DPI inhibió la caspasa-1 de activación (Figura 5E). Esto demostró que en las células humanas DPI interfería con la activación inflamasoma NLRP3 través de la inhibición de la transcripción NLRP3, así como la actividad de caspasa-1 cuando se aplicó la dosis alta. En conjunto, estos datos sugieren que la actividad de la catepsina B, K ^{+ flujo de salida, Ca 2 + afluencia y ROS todos contribuyeron a la activación inflamasoma NLRP3 en respuesta a M.hy
desafío.}

M.hy
Activa NLRP3 inflamasoma in vivo

Cuando las células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón (BMDCs) fueron infectados con M.hy
, una inducción de IL-1β sostenida se observó (Figura 6A). Otros experimentos en BMDCs aislados de tipo salvaje (WT) o ratones deficientes en caspasa-1, ASC o NLRP3 con confirmó M.hy
reto que M.hy
inducción de IL 1β fue NLRP3 inflamasoma dependiente (Figura 6B). Además, la inoculación sistémica de M.hy
en ratones WT indujo la producción de IL-1β en el suero y el líquido de lavado peritoneal (PLF), pero no en ratones que carecen de ASC o NLRP3 (Figura 6C-D). Curiosamente, el nivel basal de IL-1β en ratones deficientes ASC era claramente más alta que en los ratones deficientes WT o NLRP3, pero reto con M.hy
no aumentar más la secreción de IL-1β en tales ratones (Figura 6C-D). En conjunto, estos resultados confirmaron que los M.hy también
activan NLRP3 inflamasoma en ratones in vitro
y in vivo
.

M. HY
inducida por IL-1β gástrico promueve la migración de células tumorales y la invasión

Los datos anteriores muestran claramente que M.hy
era capaz de inducir la producción de IL-1β a partir de células inmunes innatas a través NLRP3 inflamasoma activación. Los primeros estudios epidemiológicos revelaron un posible papel de micoplasma en el desarrollo de cáncer gástrico [5]. Y Mycoplasma hyorhinis
fue demostrado para promover la migración de células tumorales, invasión y metástasis in vitro
y in vivo
[41]. La hipótesis de que puede existir otro mecanismo para esta promoción, que es que M.hy
puede promover la carcinogénesis y /o metástasis gástrica mediante la promoción de la producción de IL-1β. Y confirmamos que M.hy
ha promovido la migración celular y la invasión de cáncer gástrico (Figura S5). Desde M.hy
se demostró para infectar células de cáncer gástrico ([41], la figura S4), por lo que es posible que M.hy
puede inducir la activación inflamasoma en las células cancerosas directamente. Sin embargo, no se detectó activación inflamasoma en células de cáncer gástrico (Figura S6)
.

Determinamos siguiente el efecto de la IL-1β recombinante (rIL-1β) sobre la carcinogénesis de células de cáncer gástrico en un ensayo de formación de colonias, que reveló que la rIL-1β no influyó en la proliferación de la línea celular de cáncer gástrico MGC-803 (Figura S7). Desde que se informó de la IL-1β para promover la metástasis de otros tumores [18], hemos comprobado los efectos de RIL-1β en la migración y la invasión de las células MGC-803. Nuestros resultados muestran que la migración MGC-803 y la invasión se mejoraron con el tratamiento rIL-1β (Figura 7A y 7C), mientras que el tratamiento con rIL-18 no mostró ningún efecto (Figura 7B y 7D). A continuación, se trataron estas células de cáncer gástrico con los sobrenadantes de cultivo de M.hy
ha desafiado THP-1 macrófagos o macrófagos derivados con silenciamiento de NLRP3, ASC y la caspasa-1 para la migración y la invasión de ensayo. Nuestros resultados muestran que los sobrenadantes de cultivo de M.hy
desafiaron células de macrófagos scramble migración y la invasión de células de cáncer gástrico mejoradas fuertemente, mientras que los sobrenadantes de cultivo de la NLRP3, ASC o caspasa-1 macrófagos desmontables no lo hicieron, probablemente debido a la disminución de la secreción de IL-1β (Figura 8A y 8C). Este aumento de la migración y la invasión de células MGC-803 fue suprimida por el tratamiento de las células con anti-IL-1β mAb (Figura 8B y 8D). Tomados en conjunto, nuestros resultados demostraron que M.hy
inducen la migración y la invasión de la línea celular de cáncer gástrico MGC-803 mediante la promoción de la secreción de IL-1β a partir de células monocíticas. Por otra parte, nuestros datos indican que M.hy
inducida por la activación inflamasoma puede promover M.hy
replicación (Figura S8), lo que puede crear una retroalimentación positiva y finalmente conduce a la cronicidad de la enfermedad.

Discusión

Los micoplasmas se distinguen de otras bacterias por su pequeño tamaño, genoma minutos y la falta de la pared celular. Muchos micoplasmas establecer la colonización e infección a través de la adhesión a los tejidos del huésped. Debido a su arquitectura superficial dinámica es antigénicamente y funcionalmente versátil, micoplasmas son capaces de evadir el ataque inmune de acogida y la adaptación a diversos hábitats y causan enfermedades crónicas [32]. Desde la identificación de M.hy En venta porcina en 1962, poca investigación se llevó a cabo en este patógeno hasta que fue encontrado para ser asociado con varios cánceres humanos [5], [41], [42], [ ,,,0],43]. Más recientemente, los científicos descubrieron que M.hy
p37 proteína era responsable de promover la invasividad de las células cancerosas y la metástasis [30], [44]. Además de este mecanismo directo, este microbio también puede inducir la tumorigénesis o metástasis indirectamente a través de un proceso inflamatorio crónico local. Es bien sabido que la IL-1β es una citocina importante pro-inflamatorio que promueve el crecimiento de células de cáncer de colon y mejora la capacidad de invasión y metástasis de las células de melanoma B16 [19], [45]. Se encontró sobreexpresión de IL-1β para inducir la inflamación gástrica y cáncer en ratones [19]. En este estudio, se investigó si la inflamasoma NLRP3, que controla la maduración de IL-1β, fue activado por M.hy
, y si esta activación puede contribuir a M.hy servicios asociados metástasis gástrica . Nuestros resultados mostraron que M.hy
activa inflamasoma NLRP3 in vitro
y in vivo
, y la promoción de la migración celular de cáncer gástrico y la invasión por M .hy
era dependiente de la activación inflamasoma NLRP3. Además NLRP3, encontramos que ADN M.hy
también activó inflamasoma AIM2, pero la activación de mLAMP NLRP3 fue el componente dominante para la inducción de IL-1β por M.hy.

se informó recientemente de que lipopéptido acilados de micoplasma muertos por calor Acholeplasma laidlawii gratis (HKAL) inducida por la producción de IL-1β a través NLRP7 inflamasoma en las células humanas, mientras que HKAL inducida total secreción de IL-1β fue parcialmente dependiente NLRP3 [46], lo que indica que múltiples inflamosomas pueden ser activados por cierto micoplasma. Nuestros datos no descartan la posible implicación de NLRP7 en M.hy
inducen la producción de IL-1β, pero M.hy
principalmente activa inflamasoma NLRP3, debido a que la secreción de IL-1β fue casi completamente abolidos en las células NLRP3 silenciada (Figura 3H y 3I).

los primeros estudios proponen que las ROS activa inflamasoma NLRP3 mediante la activación de la caspasa-1 [47]. Sin embargo, la investigación reciente mostró que los inhibidores de ROS interfirieron con la transcripción de IL-1β y NLRP3, pero no la activación afectada de la caspasa-1 en células de ratón [40]. En nuestro estudio, a pesar de la inhibición de ROS con dosis bajas de DPI (10 M) redujo significativamente la producción de IL-1β en M.hy
reto, no inhibió la escisión de la caspasa-1, el marcador de la activación inflamasoma. Sin embargo, cuando se aplicó la dosis alta de DPI (100 M), caspasa-1 de escisión estaba claramente inhibida (Figura 5E), lo que sugiere que la alta dosis de DPI puede suprimir el ensamblaje del complejo de inflamasoma, aunque no podemos excluir la posibilidad de que este efecto podría han sido el resultado de la supresión de ARNm NLRP3 desde la línea base (Figura 5D). Es probable que el inhibidor de la ROS podría interferir con tanto pro-IL-1β síntesis y activación de la caspasa-1.

Cómo M.hy
promueve la producción de ROS en macrófagos sigue siendo difícil de alcanzar. La ausencia de pared celular de M.hy
permite el contacto directo de la membrana membrana de micoplasma y de la célula huésped, y este contacto puede conducir a la fusión de micoplasma con la célula huésped eucariota. Esta fusión no sólo puede dar lugar a componentes de micoplasma entrega en la célula huésped, sino también permitir la inserción de los componentes de la membrana micoplasma en la membrana de la célula huésped eucariota. Recientemente, se encontraron M.hy
membranas que poseen fosfolipasa A (PLA) que pueden estar involucrados en el proceso de destrucción de la membrana plasmática que se produce tras la invasión de células huésped [48], [49]. Durante este proceso, las células huésped pueden producir ROS. Sería digno de investigar si se requiere para el PLA M.hy
indujo la producción de ROS y la secreción de IL-1β.

Como se desprende de nuestros datos, lisosomal ruptura, K ^{+ flujo de salida, Ca 2 + afluencia y ROS estuvieron involucrados en la activación NLRP3 M.hy
inducido. Como se informó anteriormente, K + de flujo de salida y la ruptura fagolisosómico pueden inducir Ca 2 + afluencia, mientras que Ca 2 + afluencia puede causar disfunción de la mitocondria, lo que resulta en la liberación de ADN mitocondrial oxidado (ADNmt) en el citosol, donde se unen y activan el inflamasoma NLRP3 [9], [12]. Las mitocondrias parece actuar como un eje central para la integración de las diversas señales detectadas por NLRP3, pero la contribución relativa de ROS y ADNmt para la activación inflamasoma NLRP3 todavía no está claro hasta la fecha [9].}

A pesar de M .hy
no es altamente virulenta, se puede establecer una infección crónica. Por una interacción gradual y progresiva con células huésped, que induce la inestabilidad cromosómica y la transformación maligna, promoviendo así el crecimiento del tumor, la migración o invasión [50], [51]. El M.hy
proteína p37 promueve celulares de cáncer gástrico, carcinoma de próstata y de células de melanoma líneas de invasión [30], [31]. Además, el pro-inflamatoria micro-entorno como la producción de IL-1β también puede contribuir a este proceso [19]. Nuestro estudio encontró que M.hy
inducida por IL-1β promovió la migración y la invasión de las células de cáncer gástrico, mientras que M.hy
inducida por IL-18 no contribuyó a la migración y la invasión de células de cáncer gástrico, que era diferente de otros informes [26], [27]. Una posible explicación es que la IL-18 puede haber promovido la migración gástrica células del cáncer y la invasión a través de la regulación de CD70, CD44 y la expresión de VEGF en las células inmunes, que merece nuestra mayor investigación [26]. Otra explicación podría ser que la dosis de rIL-18 que usaron (150 ng /ml) es mucho mayor que lo que antes [27]. Por otra parte, IL-1β promovió la migración y la invasión de las células de cáncer gástrico puede estar mediada por la metaloproteinasa de matriz 9 (MMP9) como otros investigadores informaron [52]. Sin embargo, para obtener pruebas directas y más sólida y los mecanismos correspondientes sobre la conexión entre la activación NLRP3 inflamasoma provocada por M.hy, España y la metástasis del cáncer gástrico, modelos animales adecuados, tales como el in vivo
ensayo de invasión del tumor [53] y de pacientes para un estudio más estudios en el futuro.

Materiales y Métodos

Cell Cultura y

THP-1 células, inducida por PMA macrófagos y de células de cáncer gástrico MGC-803 se mantuvieron en medio RPMI 1640 con los suplementos esenciales. monocitos humanos se aislaron por centrifugación Percol TM gradiente de densidad (GE Healthcare Bio-Sciences, Suecia) a partir de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) obtenidas de Shanghai Centro de Sangre (Shanghai, China).

M.hy
Colar y detección por PCR

M.hy
cepa utilizada en este estudio se obtuvo de cultivo celular contaminada. detección de Mycoplasma se llevó a cabo a través de dos rondas de PCR con medio de cultivo celular [54]: En primer lugar, PCR correr con cuatro cebadores 5'-ACACCATGGGAGYTGGTAAT-3 ', 5'-CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT-3', 5'-AAAGTGGGCAATACCCAC GC-3 ', 5'-TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG-3 'con la célula medio de cultivo como plantilla. En segundo lugar, tomar 1 l del producto PCR anterior como plantilla y ejecutar PCR con tres cebadores 5'-GTGSGGMTGGATCACCTCCT-3 ', 5'-GCATCCACCAWAWACY CTTT-3', 5'-CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT-3 '. La primera y segunda PCR se ejecuta bajo la misma condición de ciclo. A continuación, hemos secuenciado el producto de PCR y se obtuvieron las siguientes secuencias: ACTCTTACTTAATTTAAAAGTTAATACAACTTTAATATT GCCTATTATTGCTAAAGATAAATATCTTAAGGTATTTTAATATTGGTAATCTATTTTAGAAATTTAATTTAAAAATTAAACTCGGTTATAAAAAAGATCGTTGAAATAATAAATATGAAGTTAATCATATTGTTATTTGCTATTCAGTTTTCAAAGAACTATAATTGAGAACTTAAAGCTCTCAAAACTAGACACGAATCGATTATGTAATAAGTCAATTAAGACTAACGGAAAGCGGAAAAAGAAGGTGATCCGTCCCCACG. Por BLAST en la base de datos NCBI, se obtuvo la información de que el micoplasma es M.hy
. Puede ser SK76, GDL-1 o MCLD cepa.

M.hy
Cultura, Extracción de ADN y mLAMP Preparación

M.hy
WAS cultivada en medio SP-4 modificado que contiene suero 20% recién nacido bovino, 10% de extracto de levadura, 1% de glucosa, 0,00024% phenolsulfonphthalein, y 1000 UI /ml de penicilina. Extracción de ADN de M.hy
se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones con los reactivos proporcionados por Shanghai Lifefeng Biotecnología Co., Ltd. M.hy
se cuantificó como unidades de cambio de color (CCU) por mililitro como se describe [55]. La extracción de mLAMP se llevó a cabo como se describe anteriormente [34].

-PCR en tiempo real

expresión del ARNm NLRP3 e IL-1β se determinaron por cuantitativa en tiempo real PCR. Cuantificación relativa de los genes se normalizaron en contra de un endógena de control de β-actina a través de la fórmula [2 ^{-ΔCt (meta-gen β-actina)]. Los cebadores utilizados fueron: Homo sapiens (Hs) de IL-1β, 5'-CACGATGCACCTGTACGATCA- (avance) 3 ', 5'-GTTGCTCCATATCC TGTCCCT- (el revés) 3'; ß-actina, 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG- (avance) 3 ', 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC- (marcha atrás) 3'; NLRP3, 5'-AAGGGCCATGGACTATTTCC- (avance) 3 ', 5'-GACTCCACCCGATGACAGTT- (el revés) 3'. M.hy
copias de ADN fueron dertermined por Cuantitativo PCR en tiempo real con la metodología de la curva estándar para el número de copias absolutas. Los cebadores específicos para M.hy
eran:. CGATTCGTGTCTAGTTTTGAG 5 '- (hacia delante) 3', 5'-ATTGCCTATTATTGCTAAAG - (hacia atrás) 3 '}

ELISA

los sobrenadantes de las células cultivadas, de suero de ratón y el fluido de lavado peritoneal de ratón se analizaron para las citoquinas IL-1β, IL-18, IL-6 o IL-8 secreción por ELISA (BD Biosciences) según las instrucciones del fabricante.

generación de THP-1 células que expresan shRNAs dirigir genes de interés en

shRNA vectores contra NLRP3 humana, la caspasa-1 y ASC, y sus vectores revueltos son un regalo del Dr. Jurg Tschopp [56]. Sobre la generación de células THP-1 que expresan shRNAs, brevemente, nt GATGCGGAAGCTCTTCAGTTTCA de secuencia de codificación ASC humano, nt CAGGTTTGACTATCTGTTCT de secuencia de codificación de NLRP3 humano, nt GTGAAGAGATCCTTCTGTA de la 3 'UTR de la caspasa-1 humano se insertaron en pSUPER. Los Pol III cassettes promotor shRNA de estos vectores y de una lamina A /C-específica construcción de control pSUPER se insertaron en el vector lentiviral pAB286.1, un derivado de pHR que contiene un casete SV40-puromicina acetil transferasa para la selección de antibióticos.

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