PLoS ONE: Photoimmunotherapy karcinoma želuca peritonejsku karcinomatoza u mišjem modelu

Sažetak pregled

Photoimmunotherapy (PIT) je novi liječenje raka koja kombinira specifičnost protutijela za ciljanje tumora s toksičnosti inducirane foto-nakon izlaganja u blizini infracrvenog (NIR) svjetlosti. Izvršili smo PIT u modelu raširene raka želuca peritonealnoj karcinomatoza i prati učinkovitost s in vivo
GFP fluorescentne slike. In vitro pregled i in vivo
Pokusi su provedeni s, ispoljavaju GFP, želučani rak staničnoj liniji HER2-ekspresijom (N87-GFP). Konjugat se sastoji od fotosenzibilizator, IR-700, konjugirani trastuzumab (tra-IR700), nakon čega slijedi NIR svjetlom se koristi za PIT. In vitro pregled PIT, procijenjena je mjerenjem citotoksičnost s mrtvom bojenja i smanjenja GFP fluorescencije. In vivo pregled PIT bio je procijenjen u diseminirane peritonealnoj karcinomatoza model i bok ksenografta pomoću mjerenja tumorskih obujam i intenzitet GFP fluorescencije. In vivo pregled antitumorski učinci PIT potvrđeni su značajno smanjenje volumena tumora (na dan 15, p 0.0001 u odnosu na kontrolu) i intenzitet fluorescencije GFP (bok model: 3 dana, PIT liječeni vs. kontrola p < 0.01 i peritonealni diseminirani model: na dan 3 PIT liječeni vs kontrola, p 0.05). Citotoksični učinci In vitro pregled pokazalo da su ovisni o dozi svjetla i izazvao nekrotično stanica rupture vodi do oslobađanja GFP i smanjenja intenziteta fluorescencije in vitro. Pregled, ovako, gubitak GFP fluorescencije služio kao koristan biomarkera nekroze stanica nakon PIT pregled

Izvor:. Sato K, Choyke PL, Kobayashi H (2014) Photoimmunotherapy karcinoma želuca peritonejsku karcinomatoza u mišjem modelu. PLoS ONE 9 (11): e113276. doi: 10,1371 /journal.pone.0113276 pregled

Urednik: Irina V. Lebedeva, Sveučilište Columbia, Sjedinjene Američke Države Netlogu

Primljeno: 2. srpnja 2014; Prihvaćeno: 21. listopada 2014; Objavljeno: 17 studeni 2014 pregled

Ovo je otvorenog pristupa članak, slobodna od svih autorskih prava, a može slobodno reproducirati, distribuirati, prenositi, mijenjati, izgrađena na, ili na drugi način koristiti bilo tko za bilo koju zakonitu svrhu. Rad je dostupan pod licencijom Creative Commons CC0 javne domene predano pregled

Podaci Dostupnost:. Autori potvrđuju da su svi podaci na kojima se temelji nalaze u potpunosti na raspolaganju bez ograničenja. Svi relevantni podaci u radu i njegove popratne podatke datoteka pregled

Financiranje:. Ovaj rad je podržan od strane NIH unutar škole programu i JSPS Research Fellowship. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Želučani karcinom uzrokuje više od 740.000 smrtnih slučajeva vezanih za rak godišnje u svijetu a posebno u Aziji [1] - [3]. Većina pacijenata s rakom želuca prisutna s lokalno uznapredovalim, povratan ili metastatske bolesti oslobađanje od kurativne operaciju koja se uglavnom upravlja ne-kurativne terapije [1]. Peritonejska karcinomatoza i metastaze jetre su zajednički život opasne manifestacije uznapredovalom stadiju raka želuca [1], [4]. Peritonejska karcinomatoza također pojavljuje u jajnika, appendiceal, debelog crijeva, gušterače i želuca raka. Prognoza je univerzalno loša i lokalne tretmani su uvijek neuspješan s visokim postotkom recidiva i smrtnost povezana s ascitesom i opstrukcija crijeva. Sistemska terapija je također obično neuspješni. Stoga su nove metode liječenja peritonealnoj karcinomatoza. Pregled

Photoimmunotherapy (PIT) je specifičan tretman raka nova meta-stanice koji koristi fotosenzibilizatora konjugata protutijela (APSC), a zatim u blizini infracrvenog (NIR) izlaganju svjetlosti. APSC sastoji od raka stanično specifičnim monoklonalnim antitijelima (mAb) i fotosenzibilizator, IR700, što je silika ftalocijanin derivata kovalentno konjugiranih na protutijelo. APSC veže ciljne molekule na staničnoj membrani i inducira gotovo neposrednu nekroze stanica nakon izlaganja NIR svjetlom na 690 nm. In vitro studije su pokazale
PIT se vrlo stanično specifičan stoga ne-stanice koje eksprimiraju neposredno uz ciljnim stanicama pokazuju toksičnih učinaka [5]. Stanice tretirane PIT prolaze brzu ekspanziju volumena dovodi do rupture stanične membrane ekstruzijom sadržaja stanica u izvanstanični prostor, i ireverzibilni nekroze [6] - [8]. Naši rezultati i drugi pokazuju da citotoksičnost izazvana dohodak ne u potpunosti oslanja na reaktivnih kisikovih ili postojanju singlet kisik quenchers [9]. Nadalje, citotoksičnost izazvana dohodak je prvenstveno u staničnoj membrani, a unutar mitohondrija što se događa s PDT. Pregled

Dok PIT rezultira brzim staničnom nekrozom, ukupni volumen tumora ne može se promijeniti za nekoliko dana. To je zato što je potrebno barem nekoliko dana za makrofage ući, postupak i ostaviti liječi tumor. Dakle, nove metode, preko mjerenja veličine, potrebno je pratiti učinke poreza na dohodak. Fluorescentna proteini (fps) najčešće se koriste za vizualizaciju stanične procese [10], [11]. Dok većina rezultati apoptoze stanica Smrt u očuvanju stanične membrane i zadržavanja FP što fluorescencija neosjetljivi do stanične smrti [12], [13], u jamu, iznenadno prsnuće stanične membrane rezultira ekstruziju citoplazmatske FPS i prema tome, relativno brzo očitanje stanične smrti. Prednost FPS za In vivo
imaging je da oni ne zahtijevaju izvanjske injekcije agentima (kao što luciferina u slučaju bioluminiscencijom) i može se pratiti u stvarnom vremenu [14] - [18]. Budući da oni zahtijevaju transfekcije gena, oni će vjerojatno biti samo korisno u pretkliničkim studijama. Pregled

U ovom istraživanju ispitali smo učinkovitost PIT u mišjem modelu raširene peritonejsku raka želuca upotrebom in vivo GFP fluorescentne slike za pratiti odgovor. pregled

Materijali i metode pregled

Reagensi pregled

topiv u vodi, silicij-ftalacijanin derivata, IRDye 700DX NHS estera i IRDye800 CW NHS ester su dobivene od LI-COR biomedicine (Lincoln, NE, USA). Panitumumab, potpuno humanizirano IgG _{2 mAb protiv EGFR, je kupljen od Amgen (Thousand Oaks, CA, USA). Trastuzumab, 95% humanizirano IgG 1 mAb protiv HER2, je kupljen od tvrtke Genentech (South San Francisco, Kalifornija, SAD). Sve ostale kemikalije su bili reagensa razred. Pregled}

Sinteza IR700-konjugirane trastuzumab ili panitumumab i IR800-konjugirani trastuzumab pregled

konjugacija boje s Mab provodi prema prethodnom izvješću [19]. Ukratko, panitumumab ili trastuzumab (1 mg, 6,8 nmol) inkubiraju se s IR700 NHS estera (60,2 ug, 30,8 nmol) ili IRDye800 CW NHS estera (35,9 ug, 30,8 nmol) u 0,1 mol /L Na _{2HPO 4 (pH 8,6) pri sobnoj temperaturi 1 sat. Smjesa je pročišćena s Sephadex G50 koloni (PD-10; GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Koncentracija proteina je određena Coomassie Plus Protein test kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA) mjerenjem apsorpcije na 595 nm sa spektroskopijom (8453 vrijednosnog sustava, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Koncentracija IR700 ili IR800 je mjerena odnosno apsorpcijom pri 689 nm i 774 nm, s spektroskopija potvrđuje broj fluorofora molekula konjugiran na svako mAb. Sinteza je kontrolirana tako da je u prosjeku od četiri IR700 molekula i dva IR800 molekula su dužni da jednog antitijela. Izvršili smo SDS-PAGE kao kontrole kvalitete za svaku konjugata kao što je ranije izvijestili [19]. Mi skratiti IR700 konjugirani za trastuzumab kao tra-IR700, da panitumumab kao pan-IR700 i IR800 konjugirani za trastuzumab kao tra-IR800. Pregled}

stanična kultura pregled

N87-GFP stanice koje stabilno eksprimiraju GFP su kupili od ANTI RAKA (San Diego, CA, USA). Visoka ekspresija GFP je potvrđena u odsutnosti selekcijskog sredstva s 10 prolaza. Procijeniti specifičnog ubijanja stanica po PIT, 3T3 stanice koje stabilno eksprimiraju DsRed (3T3 /Dsred) su korišteni kao negativna kontrola. [5] Stanice su rasle u RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) s dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma i 1% penicilina /streptomicina (Life Technologies) u tikvicama s kulturom tkiva u vlažnom inkubatoru pri 37 ° C u atmosferi 95 % zraka i 5% ugljičnog dioksida pregled

fluorescentne mikroskopije pregled

Kako otkriti lokalizaciju antigen specifične za IR700 konjugata i promjene u morfologiji stanica nakon PIT, fluorescentna mikroskopija izvršena je (IX61 ili IX81. Olympus Americi, Melville, NY, USA). Deset tisuća stanice su nasađene na poklopac staklenim dnom jela i inkubiraju 24 sata. Tra-IR700 zatim se doda u medij za kulturu (bez fenol-crvenog) na 10 ug /ml i inkubiraju na 37 ° C tijekom 6 h. Stanice su zatim isprane s PBS-om; Propidij jodid (PI) (1:2000) ili Cytox Blue (1:500) (Life Technologies) dodana je u medij 30 minuta prije PIT detektirati mrtve stanice. Stanice su zatim bile izložene NIR svjetlo i dobiveni su serijski slike. Jedan dan nakon PIT, stanice su isprane i inkubirane s novom podlogom, nakon PIT (0.5 J /cm ^{2), PI ponovno dodan. Kako bi se osiguralo da je ista regija je snimljena oznake su napravili na svakoj kulturi jelo koje pokazuju oslikavanje stečen. Filter je postavljen za otkrivanje IR700 fluorescencije sa 590-650 nm ekscitacije filter i 665-740 nm band pass filter emisija. Analiza slika je izvedena s ImageJ softvera (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Pregled}

protočnom citometrijom pregled

Fluorescentna iz stanica nakon inkubacije s pan-IR700 ili tra-IR700 mjerena je pomoću protočnog citometra (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) i CellQuest softver (BD Biosciences). Stanice (1 × 10 ^{5) su inkubirani s svakom konjugatu tijekom 6 sati na 37 ° C. Za provjeru specifično vezanje protutijela konjugirane, višak antitijela (50 ug) je korišten za blokiranje 0,5 J..lg boja antitijelo konjugata [8].}

In vitro PIT

sto tisuća stanica su nasađene u 24 jažica te se inkubiraju 24 sata. Medij kulture je zamijenjen sa svježim kulture mediju koji sadrži 10 ug /ml tra-IR700 i stanice su inkubirane 6 sati na 37 ° C. Nakon ispiranja s PBS, dodano je medij bez fenol-crvenog kulture. Zatim, stanice su ozračene s NIR laserskim svjetlom na 685 do 695 nm valne duljine (BWF5-690-8-600-0.37; B &. W TEK INC, Newark, DE, USA). Stvarna gustoća snage mW /cm ^{2 mjerena je pomoću optičkog mjerač snage (PM 100, Thorlabs, Newton, New Jersey, USA).}

citotoksičnosti Test pregled

citotoksični učinci PIT s tra-IR700 su određena protočnom citometrijom PI bojenja, koji detektira ugrožena stanične membrane. Za test protočnom citometrijom, stanice su tripsinizirane 1 h nakon tretmana i ispere s PBS. PI se doda u suspenzije stanica (konačna 2 ug /mL) i inkubirano je na sobnoj temperaturi tijekom 30 minuta, a zatim protočnom citometrijom. Pregled

Procjena GFP intenziteta fluorescencije u vitro pregled

Stotinu tisuća stanice su nasađene na poklopac staklenim dnom jela i inkubira 12 sati. Tra-IR700 zatim se doda u medij za kulturu (bez fenol-crvenog) na 10 ug /ml i inkubiraju na 37 ° C tijekom 6 h. Stanice su isprane s PBS i zamijeniti novim, fenola bez crvenog medija za kulturu bez i donju stranu pokrovnog stakla je označena (da se odredi položaj promatranja). Nakon PIT, stanice se ponovno inkubirana tijekom 1 dan. Jedan dan nakon PIT, stanice su ponovno pridržavati. Intenzitet GFP je ocijenjena s ukupnim piksela s istom pragu u istom području [20]. Analiza slike izvedena je ImageJ softverom (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Pregled

fluorescencije iz obrađenih stanica je mjeren pomoću protočnog citometra (FACS Calibur).

Životinjski i tumorskih modela pregled

Sve in vivo
je provedeno u skladu sa vodiču za odgajanje i korištenje laboratorijskih životinja resursa (1996.), američki Nacionalnog vijeća za istraživanje i odobren od strane njega i uporaba odbora NIH životinja. Od šest do osam tjedana starih ženka homozigot atimičnih golih miševa nabavljeni su od Charles River (NCI-Frederick). Kako bi se ocijenila je samo izravna stanica tumora ubijajući učinak in vivo pregled PIT, korišteni su imunokompromitirani golim miševima. Tijekom postupka, miševi su anestezirani s izofluranom. Deset milijuna N87-GFP stanice su injektirane subkutano u pravom količinu od miševa. Kako bi se odredio volumen tumora, najveći uzdužni promjer (duljina) i najveći poprečni promjer (širina) mjereni su s vanjskim čeljusti. Volumen tumora se temelje na mjernim šestarom je pomoću slijedeće formule: volumen tumora = dužina x širina ^{2 × 0,5. Tumori dosežu oko 100 mm 3 volumena bili odabrani za proučavanje. Mjeriti GFP fluorescenciju nakon PIT deset milijuna N87-GFP stanice potkožno je injicirano u obje mišić miševa. Za diseminirane peritonealnoj modelu raka miša, pedeset milijuna N87-GFP stanice s PBS (ukupno 300 mL) se ubrizgava u peritonejsku šupljinu. Pregled}

In vivo fluorescentne slike pregled

In vivo
fluorescencije slike dobivene su s bisernom Imager (LI-COR Bioscience) za otkrivanje IR700 /IR800 fluorescenciju i Maestro Imager (CRI, Woburn, MA, USA) za GFP. Za GFP, korišteni su bend-pass filter od 445 do 490 nm (pobuda) i dugo-pass plavom filteru preko 515 nm (emisija). Filter melodičan emisija je automatski stao u 10 koracima nm od 500 do 600 nm za zelenim filter setovi u stalne izloženosti (500 ms). Spektralnim fluorescencije slika se sastoji od autofluorescencija spektara i spektara iz GFP (N87-GFP tumora), koji se tada miješa, na temelju karakteristične spektralnom uzorak GFP pomoću Maestro softvera (CRI). Područja interesa (ROI) su ručno nacrtana ili na tumor bok ili preko trbuha kao odgovara modelu i intenziteta fluorescencije je mjerena [19]. Pregled

Karakterizacija diseminirane peritonejsku mišjem modelu pregled

Miševi s bilo diseminirane rak peritoneuma (6 tjedana nakon implantacije stanica) ili bočnih tumora (na 7 dana nakon implantacije stanica) su intravenozno 100 ug tra-IR700 i tra-IR800. Jedan dan nakon injekcije, serijski slike su sprovedena sa Pearl Imager detektirati IR700 /IR800 fluorescencija i Maestra za GFP. Bijela svjetlost slike miševa dobivene su s iphone5 (Apple Inc., Cupertino, Kalifornija, SAD). Pregled

In vivo PIT pregled

Kako bi se procijenilo učinak poreza na dohodak u bok modelu , N87-GFP nose tumor miševi su nasumično raspoređeni u 4 skupine od najmanje 10 životinja po skupini kako slijedi: (1) bez tretmana (kontrola); (2) samo NIR dnevnog svjetla na 50 J /cm ^{2 na dan 1 i 100 J /cm 2 dana 2; (3) 100 J..lg tra-IR700 i.v., bez izlaganja NIR svjetlosti; (4) 100 ug tra-IR700 i.v., NIR svjetlo primjenjuje na 50 J /cm 2 1. dana nakon injekcije i 100 J /cm 2 dana 2 poslije injekcije. Ovi uvjeti se primjenjuju svaki tjedan do 3 tjedna. Miševi su praćeni dnevno, a dobiveni su fluorescencije slike počevši 1 dan prije PIT i volumeni tumora je mjerena tri puta tjedno dok se promjer tumora dosegla 2 cm, nakon čega miševi su eutanazirani s ugljičnim dioksidom. Fluorescencije slike, miševi su injicirani s 100 ug tra-IR700 ili ozrači na sljedeći način: (1) NIR svjetlo primjenjuje na 50 J /cm 2 1. dana nakon injektiranja i 100 J /cm 2 on 2. dan na pravo tumora (2) ne NIR svjetlo primjenjuje na lijevoj tumor koji je služio kao kontrola. Kontrole uključuju: (1) samo NIR izlaganje svjetlo na 50 J /cm 2 na dan 1 i 100 J /cm 2 dana 2 u desno tumora; (2) tretman za lijevu tumor pregled}

Da bi se procijenila proširenu peritonealnoj raka, miševi su nasumično podijeljeni u 4 skupine od po 5 životinja po skupini za sljedeće tretmane:. (1) bez liječenja (kontrola); (2) samo NIR dnevnog svjetla na 50 J /cm ^{2 na dan 1 i 100 J /cm 2 dana 2; (3) 100 J..lg tra-IR700 i.v., bez izlaganja NIR svjetlosti; (4) 100 ug tra-IR700 iv, NIR svjetlo primjenjuje na 50 J /cm 2 na dan 1 i 100 J /cm 2 dana 2 poslije injekcije.}

Statistička analiza pregled

Podaci su izraženi kao prosjek ± SEM od minimalno četiri eksperimenata, ukoliko nije drugačije naznačeno. Statističke analize su provedene korištenjem statističkih programa (GraphPad Prism, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Višestruke usporedbe, upotrijebljen je jednosmjerna analiza varijance (ANOVA) s post testa (Kruskal-Wallis test s post-testa) i Tukey testom. Kumulativna vjerojatnost preživljavanja, određena je ovdje kao promjer tumora ne uspije doći do 2 cm, procijenjeno je u svakoj grupi s uporabom analize krivulja preživljavanja Kaplan-Meier, a rezultati su uspoređeni s log-rank testa i Wilcoxon testa. Student je t pregled test također se koristi za usporedbu dva In vitro
studija; p < 0,05 smatra da ukazuju na statistički značajnu razliku pregled

Rezultati

Potvrda izražavanja profila N87-GFP stanice kao meta za PIT Netlogu

Ispitali smo fluorescentne signale. od pan-IR700 i tra-IR700 vezana za N87-GFP stanice FACS. Nakon 6 sati inkubacije s bilo pan-IR700 ili tra-IR700, N87-GFP stanice konzistentno pokazuju višu svjetlinu s tra-IR700 od pan-IR700 (Sl. 1). Ti signali se gotovo u cijelosti blokirano dodatkom suviška trastuzumab ili panitumumab, što ukazuje na specifično vezanje i potvrđuje višu ekspresiju HER2 od EGFR [21]. Ovi podaci sugerirao da HER2 bila poželjna meta za PIT u N87-GFP stanice zbog veće izražavanja. Pregled

mikroskopiranje in vitro PIT

Serijski fluorescentnim mikroskopom za N87-GFP stanice je izvedena prije a nakon poreza na dohodak. Nakon izlaganja NIR svjetlosti (2 J /cm ^{2) naticanje stanica, stvaranje mjehuriće i vrši rupture lizosoma zabilježene, što je rezultiralo ekstrudiranje citoplazme ekstracelularno (Sl. 1b). PI bojenje pokazao akutno oštećenje citotoksični membranski uzrokovane dohodak. Većina tih staničnih promjena zabilježene su u roku od 30 minuta od izlaganja svjetlosti (pratećeg informacijskog videa S1 i S2). Nema značajnih promjena u EGFR-negativnih otkrivene su 3T3 stanice ozrači s NIR svjetlosti, što upućuje na dohodak nije uzrokovao štetu u ne-ciljnim stanicama (Sl. S1). Pregled}

Procjena in vitro PIT učinak Netlogu

kako bi se kvantificirala učinak in vitro
PIT, Izvršili smo test citotoksičnosti ugradnjom PI koji je pokazao da smrt stanica povećava s povećanjem doze svjetla (Sl. 1C). Nema značajne citotoksičnost otkrivena s NIR dnevnog svjetla ili tra-IR700 sama. Pregled

Procjena s GFP fluorescentne in vitro nakon PIT Netlogu

Jedan dan nakon izlaganja NIR svjetlu 0.5 J /cm ^{2, približno 50% stanica je pokazalo akutnu citotoksičnost (Sl. 1C), a intenzitet fluorescencije GFP je znatno smanjena kod mrtve stanice (obojenih pozitivno s PI), a GFP fluorescencija sačuvan u preživjelih stanica (sl. 1d). Ova istraživanja pokazuju da GFP istisnuti iz stanice nakon membranske loma. Kako bi istražili promjenu u GFP fluorescencije, usporedili smo ukupne GFP piksela u istom području prije i jedan dan poslije PIT (Sl. S2). Omjer GFP fluorescentne smanjio direktno sa svjetlom doze, a ne smanjenje je otkrivena s NIR izlaganja svjetlosti ili tra-IR700 sam (Sl. 1 E). Ovi rezultati su potvrđeni s FACS analizom (sl. 1F i sl. S3), i sugeriraju da PIT dovodi do smanjenja GFP fluorescencije sljedećem nekrotičnog smrti stanica 1. dana nakon PIT na način ovisan o dozi svjetla. Pregled}

In vivo PIT smanjuje volumen tumora u bok modelu ksenografta pregled

Zatim smo ispitali učinak PIT In vivo
na bok s tumorom miševa (Sl. 2). PIT inducirane značajno smanjenje volumena tumora (n = 10 u svakoj skupini, * p = 0,0456 i 0,05, Tukey test). Četiri miševi od deset u PIT grupe su u potpunosti izliječiti liječenje (sl. 2b). Preživljavanje je značajno produžen u jami skupini u usporedbi s kontrolnom skupinom (n = 10 u svakoj grupi, ** p < 0.0001, dugo rank test i Wilcoxon test) (Slika 2C).. Ovi podaci ukazuju na to da PIT uzrokovalo značajno smanjenje tumora i dugotrajno preživljavanje in vivo pregled. Pregled

GFP Fluorescentna imaging nakon in vivo PIT u bok modelu ksenografta pregled

U cilju praćenja in vivo pregled PIT, real-time GFP slike je izvršena u miševa s N87-GFP bilateralna stijenke tumora (sl. 3a). GFP fluorescencija pokazao tumora teret i odgovora na dohodak. GFP fluorescencija korelaciji s IR700 fluorescencije, koja se brzo smanjio nakon PIT (Sl. 3c). Ukupno fluorescentna slika (TFI) iz GFP-u neobrađenim tumorima (kontrola), a tumori su primali samo svjetlo povećan zbog rasta tumora. U tumorima liječenih PIT, TFI od GFP postupno smanjio u tretiranom tumora, dok suprotno tumor u istom miša (iv samo, nema svjetla) pokazali su povećanu GFP fluorescencija (sl. 3b).

Utvrđivanje ukupne količine GFP intenzitet fluorescencije otkrila je da postoji značajan pad nakon PIT (n = 5 miševa u svakoj skupini, * p = 0.0118 0,05, ** p = 0,0010 i 0,01, *** p = 0,0049 i 0,01, Tukey test ANOVA) (Sl. 3c). Zbog tumora ponovni rast, omjer GFP opet povećan sa 4. dana nakon dohodak, iako je bila niža od druge kontrolne skupine. Real-time GFP fluorescencija slikanje i njegova kvantifikacija omogućio usporedbu u realnom vremenu od skupina i pokazao snažnu povezanost između visokog GFP fluorescencije i progresiji tumora u svakoj grupi. Pregled

Da biste potvrdili ovaj efekt, ex vivo pregled, analiza provedena je (Sl. 4a). PIT učinak je potvrđen sa smanjenjem IR700 fluorescencijom (Sl. 4B). Pod tim uvjetom, GFP intenzitet ex vivo
tumora smanjila nakon PIT (Sl. 4B). Ovi podaci ukazuju na to da u stvarnom vremenu GFP live snimanje je u skladu s ex vivo pregled slike. Pregled

Kada PIT se ponavlja svaki tjedan, GFP fluorescencija aktivnost s vremenom nestala (Sl. 4C i D), što ukazuje na potpuni ubijanje tumora. pregled

Karakterizacija diseminirane peritonejsku model s fluorescentnom slike Netlogu

kako bi se utvrdila prirodnu povijest diseminirane peritonealnoj modela, serijski fluorescencija slike je izvršena. Implantiranog tumora Pokazali fluorescentnog signala s IR700, IR800 i GFP, od kojih su svi lokalizirani međusobno (IR800 je korišten kako bi se izbjeglo crijevna autofluorescencija) (Sl. 5). Ovi podaci ukazuju na to da je ovaj model diseminirane peritonejsku raka može se pratiti u živih miševa pomoću GFP fluorescenciju.

GFP fluorescencije snimanje nakon in vivo jame diseminirane peritonejsku modelu pregled

Real-time GFP fluorescencija slike je obavlja u diseminirane peritonealnoj modela prije i poslije PIT (Sl. 6a). IR700 fluorescencija smanjuje nakon PIT (Sl. S4). GFP TFI postupno povećavati u ne-dohodak skupina s obzirom na rast tumora. U skupini PIT liječi, GFP TFI smanjio od 1 dana do 3 dana nakon PIT (Sl. 6B). Kvantificiranje ukupnog intenziteta GFP fluorescencije pokazuju značajan pad nakon PIT (n = 5 miševa u svakoj skupini, * p = 0,0295 i 0,05, ** p = 0.0355 < 0.05, Kruskal-Wallis test s post-testom) (Sl. 6C). Zbog tumora ponovni rast, omjer GFP ponovno povećala se od 4 dana PIT, iako se održava nižim od druge skupine, kao što je uočeno s modelom bok tumora. Dakle, PIT prouzročio značajne ciljano tumor ubijanje učinak u oba boka i šire peritonejsku tumorskih modela i to se može pratiti s GFP TFI. Pregled

Rasprava pregled

Ovo istraživanje pokazuje da je učinak poreza na dohodak može biti pratiti s GFP fluorescentnom slike. Za razliku od apoptoze [12], [13], u kojoj GFP i srodnim fluorescentne proteini postaju svjetlije zbog smanjivanja citoplazmatski volumen, vrijeme nekrotičnog smrti stanica sa PIT, oštećenje membrane dovodi do oslobađanja citoplazmatske sadržaja uključujući GFP. Ova jedinstvena karakteristika GFP i srodnih fluorescentnim proteinima ih čini korisnim biomarkera za porez na dohodak. Pregled

In vivo pregled GFP fluorescentne slike omogućava potpunu proces tumorigenezi, liječenja, regresija, metastaza ili recidiva, da detektirati u istoj životinji bez invazivne postupke [10], [11]. Upotrebom stanica koje izražavaju citoplazmatski GFP, antitumorska efekte izazvane dohodak se može lako prati zbog istiskivanje GFP iz tretiranih stanica. Pregled

Koncept primjene ciljanog terapiju svjetlom je više od tri desetljeća stara [22]. Zbog hidrofobnosti tradicionalnih fotodinamička terapija (PDT) senzibilizatora farmakokinetike antitijela konjugirana PDT agensi jako ograničena sposobnost isporuke konjugata do cilja. Stoga PDT senzibilizatore ciljane protutijelima je samo uspješne u modelima gdje konjugat je ubrizgana direktno u tumor i peritoneum [23]. Kako bi se osiguralo pripremanje antitijelima fotosenzibilizatora konjugata (APSC) sistemski, fotosenzibilizator trebao biti po mogućnosti hidrofilan. Hidrofilni ftalocijanin bazi fotosenzibilizator, IR700DX kada je konjugiran na protutijelo postaje APC koje se mogu primijeniti intravenski. Ovaj oblik terapije, nazvao PIT, razlikuje se od tradicionalnog PDT ne samo u hidrofilnosti fotosenzibilizatora, ali također u svojoj oslanjanja na NIR svjetlo za aktiviranje fotosenzibi. NIR svjetlost ima bolju penetraciju tkiva od donjeg valnih duljina svjetlosti koja se koristi u PDT. Ova nova generacija APC pokazuje slične intravenska farmakokinetiku u gole antitijela, rezultira visoko ciljano akumulacije tumora s minimalnim nisu ciljne vezanje i može se primijeniti na širokom spektru antitijela, čime mnogo potencijalnih primjena u cijelom tijelu. Pregled

Unatoč citotoksične kemoterapije, ishod za uznapredovali karcinom želuca faza ostaje siromašan. Jer, većina bolesnika s metastazama peritonealni prisutne s podmuklim simptoma kao što su smanjen apetit, gubitak težine, nadutost osjećaja, boli ili anemije dijagnoze često je odgođeno i lokalne terapije su više nije moguće [24]. PIT je obećavajući metoda liječenja proširenu peritonealnoj raka. U svrhu obavljanja učinkovitog jamu, APSC treba dostaviti sistemski i svjetlo treba se selektivno primjenjuje na peritoneum. Pod tim uvjetima ima dovoljno isporuka APSCs za posljedicu smanjenje rasprostranjenih tumora nakon poreza na dohodak. Ovaj proces može se pratiti sa stvarnom vremenu In vivo pregled GFP fluorescentne slike. Pregled

Postoji nekoliko ograničenja ove studije. Treba primijetiti da se sve karcinome želuca izražavaju HER2 i stoga, tra-IR700 ne mora biti jednako učinkoviti u diseminirane raka želuca. Doista, može biti neophodno da se koriste za koktelom APSCs učinkovito pokriva većinu profile ekspresije u određenom tumora [25]. Drugo upozorenje u ovoj studiji je to svjetlo može se davati u malim transkutano miševima, ali to nije moguće kod ljudi. Kako bi se učinkovito liječenje ljudi s PIT, bit će potrebno primijeniti svjetlo laparoskopski za sprječavanje apsorpcije na koži. Drugo ograničenje je da je naš model je ocijenjena samo u imunokompromitiranih miševa. Imunološki reakcija PIT će se vrednovati u budućnosti, u imunokompetentnih miševa. Na kraju, u kratkom roku GFP fluorescentne slike će biti ograničena na studijama na životinjama, kao što to zahtijeva transfekciji tumora s endogenim proteinima. Ipak, ovo je korisno čitanje za pretkliničkim ispitivanjima. Pregled

Zaključci pregled

PIT je učinkovit protiv HER2-pozitivnim rakom želuca peritonejsku karcinomatoza u mišjem modelu i GFP fluorescentnim snimanje omogućuje praćenje dohodak efekte.

popratne podatke
Slika S1. pregled Specifična ciljano nekrotično stanična smrt je opaženo nakon PIT in vitro.
N87-GFP stanice su ko-kultiviran s 3T3 /DsRed (ne-HER eksprimiraju) stanica. Liječeni su tra-IR700 i promatraju (prije i nakon zračenja NIR svjetlosti). Ciljano specifična smrt nekrotične stanice opažena nakon pobude s NIR svjetla (nakon 30 minuta). Nema oštećenja je pokazao u 3T3 /DsRed stanica. . * 3T3 /DsRed stanice, bar = 25 um pregled doi: 10,1371 /journal.pone.0113276.s001 pregled (TIFF) pregled Slika S2. pregled smanjivanje GFP-fluorescencije na 1 dan nakon PIT uočeno je in vitro.
Opadajući intenzitet GFP-fluorescentne na 1 dan nakon PIT uočeno da se na način koji ovisi o svjetlosti doze. = 100 um. Crna crta na rubu je marker za određivanje pozicije promatranja pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s002 pregled (TIFF) pregled slika S3. pregled smanjuje u GFP-fluorescentnom 1. dana nakon PIT ocjenjuje protočnom citometrijom. Smanjenjem intenziteta fluorescencije na GFP-1 dan PIT je na način koji ovisi o dozi svjetla protočnom citometrijskom analizom pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s003 pregled (TIFF) pregled Slika S4. pregled, In vivo pregled fluorescentnom slike kao odgovor na ponovljenom PIT u peritonealnoj širiti modelu miševa. In vivo pregled fluorescentnom slike kao odgovor na ponovljenom dohodak. IR700 fluorescencija smanjen je u odgovoru na dohodak pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s004 pregled (TIFF) pregled, Video S1. pregled Time-lapse DIC slike na N87-GFP stanice tretirane jamu. Time-lapse sekvencijalni DIC slike (video) N87-GFP stanice pokazuju morfološke promjene stanica nakon NIR svjetlosnog zračenja u stanicama tretiranim s tra-IR700 (25 min promatranja ukupno). Bljeskanjem je NIR svjetlosnog zračenja (2 J /cm ^{2) pregled, doi:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s005 pregled (AVI) pregled video S2. pregled Time-lapse PI fluorescencije slike na N87-GFP stanice tretirane dohodak. Time-lapse sekvencijalni PI fluorescencije slike (video) pokazuje brzo oštećenje membrane na N87-GFP stanice nakon NIR svjetlosnog zračenja u stanicama tretiranim s tra-IR700 (25 min promatranja ukupno). Bljeskanjem je NIR svjetlosnog zračenja (2 J /cm 2) pregled, doi:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s006 pregled (AVI) pregled}

Izvori pregled

Ovo istraživanje je podržan od strane unutar škole Research program National Institutes of Health, National Cancer Institute, Centar za istraživanje raka. Kazuhide Sato je podržana s JSPS Research Fellowship za japanske biomedicinskih i ponašanja istraživači na NIH-u. Pregled

• PLoS ONE: MED30 regulira proliferaciju i pokretljivosti želučanog raka Cells
• PLoS ONE: Komparativna Proteomika Analiza rak želuca matičnih Cells