PLoS ONE: Photoimmunotherapy рака желудка карциноматоз брюшины в Mouse Model

Абстрактный
<р> Photoimmunotherapy (PIT) является новый метод лечения рака, который сочетает в себе специфичность антител для нацеливания опухолей с токсичностью, вызванной фотосенсибилизаторов после воздействия ближней инфракрасной области спектра (NIR) света. Мы выполнили PIT в модели диссеминированного рака желудка перитонеального карциноматозом и мониторинг эффективности с в естественных условиях
GFP флуоресцентных изображений. В пробирке
и В естественных условиях
были проведены эксперименты с HER2-экспрессирующих, GFP-экспрессирующих, желудочная линии клеток рака (N87-GFP). Конъюгат состоит из фотосенсибилизатора, IR-700, конъюгированный с трастузумаб (TRA-IR700), с последующим NIR света использовался для PIT. В пробирке
PIT оценивали путем измерения цитотоксичности с мертвыми окрашивания и уменьшением флуоресценции GFP. В естественных условиях
PIT оценивали в рассеянном перитонеального модели карциноматоз и флангового ксенотрансплантата с использованием измерения объема опухоли и интенсивности флуоресценции GFP. В естественных условиях
противоопухолевые эффекты PIT были подтверждены значительным снижением объема опухоли (на 15-й день, р < 0,0001 по сравнению с контролем) и интенсивность флуоресценции GFP (бочка модель: на 3-й день, PIT лечение vs. контроль р &л; 0,01 и перитонеальный диссеминированный модель: в день 3 PIT лечение по сравнению с контролем, р &ЛТ; 0,05). Цитотоксические эффекты в пробирке
как было показано, зависит от дозы света и вызвало некротических клеток разрыв, приведшей к выпуску GFP и уменьшению интенсивности флуоресценции в пробирке.
Таким образом, потеря флуоресценции GFP служил как полезный биомаркеров некроза клеток после PIT
<р> Образец цитирования:. Сато K, Choyke PL, Кобаяши H (2014) Photoimmunotherapy рака желудка карциноматоз брюшины в мышиной модели. PLoS ONE 9 (11): e113276. DOI: 10.1371 /journal.pone.0113276
<р> Редактор: Ирина В. Лебедева, Колумбийский университет, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 2 июля 2014 года; Принято: 21 октября, 2014 года; Опубликовано: 17 ноября 2014
<р> Это статья с открытым доступом, свободной от всех авторских прав, и могут быть свободно воспроизведены, распространять, передавать, изменять, построен на, или иным образом использоваться кем-либо для любой законной цели. Работа доступна под общественное достояние Creative Commons cc0
<р> Доступность данных:. Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводы полностью доступны без ограничений. Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> Финансирование:. Эта работа была поддержана программой NIH Intramural и JSPS Research Fellowship. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> Желудочный рак является причиной более 740000 связанных с раком смертей в год во всем мире, особенно в Азии [1] - [3]. Большинство больных раком желудка присутствует с местно-распространенным, рецидивирующим или метастатическим заболеванием, исключающее хирургическое лечение, которое в основном управляется без лечебной терапии [1]. Перитонеальный карциноматоз и метастазирование печени являются общими угрожающие жизни проявления продвинутой стадии рака желудка [1], [4]. Перитонеальный карциноматоз также происходит в яичника, аппендикса, толстой кишки, поджелудочной железы и рака желудка. Прогноз повсеместно бедных и местные процедуры неизменно неудачными с высокими показателями рецидивов и осложнений, связанных с асцитом и кишечной непроходимости. Системная терапия также обычно неудачны. Таким образом, необходимы новые способы лечения перитонеального карциноматоза.
<Р> Photoimmunotherapy (ИПН) представляет собой специфический новый клеток-мишеней для лечения рака, который использует конъюгат антитело фотосенсибилизатора (APSC) с последующим ближней инфракрасной (NIR) освещенности. APSC состоит из клеток-специфических моноклональных антител рака (MAB) и фотосенсибилизатора, IR700, который является производным кремнезем-фталоцианина, ковалентно конъюгированный с антителом. APSC связывает молекулы-мишени на мембране клетки, а затем вызывает почти немедленное некроз клеток после воздействия NIR света при 690 нм. В пробирке
исследования показали, питы к весьма специфичное соте, следовательно, не-экспрессирующие клетки непосредственно примыкающие к адресным клеток не обнаруживают никаких токсических эффектов [5]. Клетки, обработанные PIT подвергаются быстрому объемному расширению, ведущий к разрыву клеточных мембран, выдавливание содержимого ячейки во внеклеточное пространство, и необратимый некроз [6] - [8]. Наши результаты и другие показывают, что цитотоксичность, индуцированный PIT не полностью полагаться на активных форм кислорода или существование синглетного кислорода гасителей [9]. Кроме того, цитотоксичность, индуцированный ИПН в первую очередь в клеточной мембране, а в митохондриях, как это происходит с PDT.
<Р> В то время как ИПН приводит к быстрому клеточного некроза, общий объем опухоли не может изменяться в течение нескольких дней. Это происходит потому, что требуется по крайней мере несколько дней для того, чтобы ввести макрофаги, процесс и оставить обработанной опухоли. Таким образом, новые методы, помимо измерения размеров, необходимы для мониторинга последствий PIT. Флуоресцентные белки (ФПС) обычно используются для визуализации клеточных процессов [10], [11]. В то время как большинство результатов апоптотической гибели клеток в сохранении клеточной мембраны и удерживание FP делает флуоресценция нечувствительным к гибели клеток [12], [13], в PIT, внезапный разрыв клеточных мембран приводит к экструзии цитоплазматической FPs и следовательно, относительно быстрое считывание гибели клеток. Преимущество РЗУ для В естественных условиях
визуализации является то, что они не требуют примесные инъекции агенты (такие как люциферин в случае биолюминесценции) и может контролироваться в режиме реального времени [14] - [18]. Так как они требуют трансфекции гена, они, вероятно, будет полезно только в доклинических исследованиях.
<Р> В этом исследовании мы изучали эффективность ИПН в мышиной модели диссеминированного перитонеального рака желудка с использованием в естественных условиях GFP флуоресценции изображений для контролировать реакцию.

материалы и методы

Реактивы
<р> растворимый в воде, производное кремний фталоцианина, IRDye 700DX NHS эфира и IRDye 800 CW NHS эфира были получены из LI-COR Bioscience (Линкольн, Небраска, США). Panitumumab, полностью гуманизированное IgG <югу> 2 мАт направлено против EGFR, был куплен у Amgen (Thousand Oaks, CA, USA). Трастузумаб, 95% гуманизированное IgG <югу> 1 мАт направленное против HER2, был приобретен у компании Genentech (Южная Сан-Франциско, штат Калифорния, США). Все другие химические вещества были реагента класса.

Синтез IR700-конъюгированного трастузумаба или панитумумаба и IR800-конъюгированного трастузумаба
<р> Сопряжение красителей с мАт была выполнена в соответствии с предыдущим докладом [19]. Короче говоря, панитумумабу или трастузумаб (1 мг, 6,8 нмоль) инкубировали с IR700 NHS сложного эфира (60,2 мкг, 30,8 нмоль) или IRDye 800 CW NHS сложный эфир (35,9 мкг, 30,8 нмоль) в 0,1 моль /л Na <суб> 2HPO <суб> 4 (рН 8,6) при комнатной температуре в течение 1 часа. Смесь очищают на колонке с Sephadex G50 (PD-10; GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Концентрацию белка определяли с помощью набора Кумасси Плюс белка анализа (Thermo Fisher Scientific Inc., Рокфорд, Иллинойс, США) путем измерения поглощения при 595 нм с помощью спектроскопии (8453 Value System; Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). Концентрация IR700 или IR800 измеряли соответственно по поглощению при 689 нм или 774 нм с помощью спектроскопии, чтобы подтвердить количество молекул флуорофора конъюгированных с каждой мАт. Синтез регулировали таким образом, что среднее из четырех молекул IR700 и IR800 двух молекул были привязаны к одному антителом. Мы выполнили SDS-PAGE в качестве контроля качества для каждого конъюгата, как сообщалось ранее [19]. Мы сокращаем IR700, конъюгированный с трастузумаба как тра-IR700, чтобы панитумумаба, как пан-IR700 и IR800, конъюгированный с трастузумаб, как тра-IR800.

Клеточная культура

N87-GFP клетки, стабильно экспрессирующие GFP были приобретены от ANTI РАК (Сан-Диего, штат Калифорния, США). Высокая экспрессия GFP была подтверждена в отсутствии селективного агента с 10 пассажей. Для оценки конкретных гибель клеток путем PIT, 3T3, стабильно экспрессирующие DsRed (3Т3 /DsRed) использовали в качестве отрицательного контроля [5]. Клетки выращивали в среде RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки и 1% пенициллина /стрептомицина (Life Technologies) в тканевой культуре колб в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С в атмосфере 95 % воздуха и 5% диоксида углерода

люминесцентной микроскопии
<р> Для того, чтобы обнаружить антиген-специфическую локализацию IR700 конъюгатов и изменение морфологии клеток после PIT, флуоресцентная микроскопия проводили (IX61 или IX81. Olympus America, Мелвилл, Нью-Йорк, США). Десять тысяч клеток высевали на покрытие-стеклянным дном посуды, и инкубировали в течение 24 часов. TRA-IR700 затем добавляли к культуральной среде (фенол красный свободный) в количестве 10 мкг /мл и инкубировали при 37 ° С в течение 6 часов. Затем клетки промывали PBS; Пропидиум йодид (PI) (1:2000) или Cytox синий (1:500) (Life Technologies) был добавлен в средствах массовой информации 30 минут, прежде чем ИПН для обнаружения мертвых клеток. Клетки затем подвергали воздействию NIR света и были получены последовательные изображения. Через один день после PIT, клетки промывали и инкубировали с новой средой после питы (0,5 Дж /см ^{2) и ПИ снова добавляли. Для того, чтобы убедиться, что та же область была отображена маркировка были сделаны на каждой чашке для культивирования, чтобы указать, где визуализация была приобретена. Фильтр был установлен для обнаружения IR700 флуоресцентного анализа с использованием фильтра возбуждения 590-650 нм и 665-740 нм полосовой фильтр излучения. Анализ изображений осуществляли с помощью ImageJ программного обеспечения (http://rsb.info.nih.gov/ij/).}

проточная цитометрия
<р> флуоресценция из клеток после инкубации с пан-IR700 или тра-IR700 измеряли с использованием проточного цитометра (FACS Calibur, BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США) и CellQuest программное обеспечение (BD Biosciences). Клетки (1 × 10 5) инкубировали с каждого конъюгата в течение 6 ч при 37 ° С. Для проверки специфического связывания конъюгированного антитела, избыток антител (50 мкг) используется для блокирования 0,5 мкг красителя антитела конъюгатов [8].

В пробирке PIT

Сто тысяч клеток высевали в 24-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 ч. Питательные среды заменяли свежей культуральной средой, содержащей 10 мкг /мл прозрачн-IR700 и клетки инкубировали в течение 6 ч при 37 ° С. После промывания PBS, добавляли фенол красный свободный культуральной среды. Затем клетки облучают лазерным светом NIR при 685 до 695 нм (BWF5-690-8-600-0.37; B &Amp;. Вт ТЕК Inc., Ньюарк, штат Делавэр, США). Фактическая плотность мощности мВт /см ^{2 была измерена с помощью измерителя оптической мощности (PM 100, Thorlabs, Ньютон, штат Нью-Джерси, США).}

цитотоксичности
<р> цитотоксическое действие PIT с тра-IR700 определяли с помощью проточной цитометрии PI окрашивания, который детектирует скомпрометированы клеточные мембраны. Для анализа методом проточной цитометрии, клетки обрабатывали трипсином через 1 час после обработки и промывали PBS. ПИ был добавлен в клеточной суспензии (конечная 2 мкг /мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, а затем с помощью проточной цитометрии.

Оценка интенсивности флуоресценции GFP в пробирке
<р> Сто тысяч клетки высевали на покрытие-стеклянным дном посуды, и инкубировали в течение 12 часов. TRA-IR700 затем добавляли к культуральной среде (фенол красный свободный) в количестве 10 мкг /мл и инкубировали при 37 ° С в течение 6 часов. Клетки промывали ФСБ и заменен новым, фенол красный свободный культуральной среды и нижней стороны покровного стекла был отмечен (для определения положения наблюдения). После того, как PIT, клетки снова инкубировали в течение 1 дня. Однажды после того, как PIT, снова наблюдали клетки. Интенсивность GFP, оценивали с общим объемом пикселей с тем же порогом в том же поле [20]. Анализ изображений осуществляли с помощью ImageJ программного обеспечения (http://rsb.info.nih.gov/ij/).
<Р> Флуоресцентный из обработанных клеток также измеряли с использованием проточного цитометра (FACS Calibur).

Животные и опухолевые модели
<р> Все в естественных условиях
процедуры были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных ресурсов (1996 г.), Национальный исследовательский совет США, и утвержден по уходу и использованию комитета NIH животного происхождения. От шести до восьми недельных самок гомозиготных бестимусных голых мышей были приобретены у Charles River (NCI-Frederick). Для того чтобы оценить только прямой опухолевых клеток убивает эффект В естественных условиях
ИПН, использовали иммунодефицитом голых мышей. Во время процедуры, мышей анестезировали изофлуран. Десять миллионов N87-GFP клетки вводили подкожно в правую спинке мышей. Для определения объема опухоли, наибольший продольный диаметр (длина), а наибольший поперечный диаметр (ширина) измерялись с внешним суппортом. Объемы опухоли, основанные на измерении штангенциркулем были рассчитаны по следующей формуле; объем опухоли = длина × ширина ^{2 × 0,5. Опухоли достигают приблизительно 100 мм 3 в объеме были отобраны для исследования. Для измерения флуоресценции GFP после PIT, десять миллионов N87-GFP клетки вводили подкожно в оба мышцы спины мышей. Для распространяемой перитонеального мышиной модели рака, пятьдесят миллионов N87-GFP клетки с PBS (всего 300 мкл) вводили в брюшную полость.}

В естественных условиях флуоресцентной визуализации

В естественных условиях
флуоресцентные изображения были получены с жемчужной Imager (LI-COR Bioscience) для обнаружения IR700 /IR800 флуоресценцию, и Maestro Imager (CRI, Woburn, MA, USA) для GFP. Для GFP, были использованы полосовой фильтр от 445 до 490 нм (возбуждение) и длительный проход синий фильтр по 515 нм (эмиссии). Фильтр перестраиваемый излучение автоматически шагнула с шагом 10 нм от 500 до 600 нм для зеленого наборов фильтров при постоянной экспозиции (500 мс). Спектральные Флуоресцентные изображения состоят из спектров автофлуоресцентной и спектров с GFP (N87-GFP, опухоли), которые были затем несмешанные, основанный на характеристике спектральной структуре GFP, с помощью программного обеспечения Maestro (CRI). Интересующие регионы (трансформирования) были нарисованных вручную либо на опухоль боковой поверхности или над брюшной области в соответствующей модели и интенсивности флуоресценции измеряли [19].

Характеристика вкрапленных перитонеального модели мыши
<р> Мыши с либо диссеминированного перитонеального рака (через 6 недель после имплантации клеток) или опухолей фланговых (через 7 дней после имплантации клеток) вводили внутривенно 100 мкг тра-IR700 и тра-IR800. Через день после инъекции, последовательные изображения были выполнены с жемчужной Imager для обнаружения IR700 /IR800 флуоресценцию, и Maestro для GFP. Белые светлые образы мышей были получены с iPhone5 (Apple Inc., Купертино, штат Калифорния, США).

В естественных условиях ПИТ
<р> Для того, чтобы оценить влияние ИПН в модели фланговой , N87-GFP опухоль мышей были рандомизированы на 4 группы по крайней мере, 10 животных в каждой группе, как не следует: (1) никакого лечения (контроль); (2) только NIR воздействие света на 50 Дж /см 2 на 1 день и 100 Дж /см 2 на 2-й день; (3) 100 мкг TRA-IR700 в.в., не БИК освещенности; (4) 100 мкг TRA-IR700 в.в., БИК свет вводили при 50 Дж /см 2 на 1-й день после инъекции и 100 Дж /см 2 на 2-й день после инъекции. Эти условия были применены каждую неделю в течение 3 недель. Мышей наблюдали ежедневно, и флуоресцентные изображения были получены, начиная за 1 день до рва и объемы опухоли измеряли три раза в неделю до тех пор, диаметр опухоли не достигала 2 см, после чего мышей подвергали эвтаназии с диоксидом углерода. Для визуализации флуоресценции, мышам вводили 100 мкг тра-IR700 или облученный следующим образом: (1) БИК свет вводили при 50 Дж /см 2 на 1-й день после инъекции и 100 Дж /см 2 на 2-й день к правой опухоли (2) не NIR света не вводили в левую опухоль, которая служила в качестве контроля. Контроль включает (1) только NIR освещенность на 50 Дж /см 2 на 1 день и 100 Дж /см 2 на 2-й день к правой опухоли; (2) отсутствие лечения для левого опухоли
<р> Для оценки диссеминированный перитонеальный рак, мыши были рандомизированы на 4 группы по 5 животных в каждой группе для следующих процедур:. (1) отсутствием лечения (контроль); (2) только NIR воздействие света на 50 Дж /см 2 на 1 день и 100 Дж /см 2 на 2-й день; (3) 100 мкг TRA-IR700 в.в., не БИК освещенности; (4) 100 мкг TRA-IR700 IV, NIR света вводили в 50 Дж /см 2 на 1 день и 100 Дж /см 2 на 2-й день после инъекции.

Статистический анализ
<р> Данные выражены в виде средних значений ± СЭМ от минимум четырех экспериментов, если не указано иное. Статистический анализ проводили с использованием статистической программы (GraphPad Prism, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Для множественных сравнений был использован один путь анализа расхождений (ANOVA) с пост тест (тест Крускала-Уоллиса с пост-тест) и тест Тьюки. Кумулятивная вероятность выживания, определяется здесь как диаметр опухоли не достигают 2 см, по оценкам, в каждой группе с использованием анализа кривой выживаемости Каплана-Мейера, и результаты сравнивали с тестом логарифмического рангового и теста Вилкоксона. Студенческая T
тест также используется для сравнения в пробирке
исследование двух; р &л; 0,05 рассматривалось как указать статистически значимую разницу

Результаты

Подтверждение профиля экспрессии клеток N87-GFP в качестве мишени для ямочного

Мы исследовали сигналов флуоресценции. пан-IR700 и тра-IR700 связанного с клетками N87-GFP с помощью FACS. Через 6 часов инкубации либо с пан-IR700 или тра-IR700, N87-GFP клетки последовательно показали более высокую яркость с тра-IR700, чем пан-IR700 (рис. 1А). Эти сигналы были почти полностью блокировали добавлением избытка трастузумаб или панитумумабу, предлагая специфическое связывание и подтверждающие более высокую экспрессию HER2, чем EGFR [21]. Эти данные свидетельствуют о том, что HER2 была предпочтительной мишенью для ИПН в N87-GFP клеток из-за его более высокой экспрессии.

Микроскопия экстракорпорального PIT
<р> Последовательные флуоресцентной микроскопии N87-GFP клеток проводили до и после того, как ИПН. После воздействия NIR света (/см 2 2 J) клеточный отек, образование пузырьке и разрыв лизосом наблюдались, в результате чего при экструзии цитоплазме внеклеточно (рис. 1, б). PI окрашивание показало острое поражение цитотоксических мембраны, вызванное PIT. Большинство из этих клеточных изменений наблюдались в течение 30 мин освещенности (подтверждающей информации, видео S1 и S2). Никаких существенных изменений не было обнаружено в EGFR-отрицательными 3Т3 облучают светом NIR, предполагая PIT не индуцируется никаких повреждений в нецелевых клетках (рис. S1).

Оценка экстракорпорального PIT эффекта
<р> для количественного определения эффекта в пробирке
PIT, мы провели анализ цитотоксичности на основе включения PI, который показал, что гибель клеток возрастала с повышением дозы света (рис. 1в). Никаких существенных цитотоксичность не было обнаружено с NIR воздействие света или тра-IR700 в одиночку.

Оценка с помощью GFP флуоресценции в пробирке после PIT
<р> На следующий день после контакта с БИК светом 0.5 Дж /см 2, приблизительно 50% клеток показали острый цитотоксичность (рис. 1в), и интенсивность флуоресценции GFP, был значительно снижается в мертвых клеток (окрашена позитивно с PI), в то время как флуоресценция GFP сохранялась в живых клетках (рис. 1D). Эти исследования показали, что GFP, выдавливали из клетки после разрыва мембраны. Для того чтобы исследовать изменение флуоресценции GFP, мы сравнили общее число пикселей GFP в том же поле до и через один день после PIT (рис. S2). Соотношение флуоресценции GFP снизился непосредственно с легкой дозы, в то время как никакого снижения не было обнаружено при воздействии света NIR или тра-IR700 в покое (рис. 1д). Эти результаты были подтверждены с помощью анализа FACS (рис. 1F и рис. S3) и предполагают, что ИПН приводит к уменьшению флуоресценции GFP следующей некротической смерти клеток на 1 день после того, как PIT таким образом, зависит от дозы света.
<Н3> в естественных условиях ПИТ уменьшает объем опухоли в модели ксенотрансплантата фланговой
<р> Далее, мы исследовали влияние ИПН в естественных условиях на боковой поверхности
опухоли мышей, несущих (рис. 2А). PIT индуцируется значительное сокращение объема опухоли (п = 10 в каждой группе * р = 0,0456 &л; 0,05, тест Тьюки). Четырех мышей из десяти в подложечной группы были полностью вылечены лечения (рис. 2В). Выживаемость была значительно увеличена в группе ИПН по сравнению с контрольной группой (п = 10 в каждой группе, ** р &ЛТ; 0,0001, тест долго ранга и тест Вилкоксона) (рис 2С.). Эти данные свидетельствуют о том, что PIT вызвало значительное сокращение опухоли и длительной выживаемости В естественных условиях
.

GFP флуоресцентных изображений после того, как в естественных условиях ПИТ в боковой поверхности модели ксенотрансплантата
<р> Для того, чтобы контролировать в естественных условиях
ИПН, в реальном масштабе времени изображений GFP проводили на мышах с N87-GFP двусторонний фланговых опухолей (фиг. 3A). GFP флуоресценции продемонстрировали опухолевой и ответ на PIT. GFP флуоресценции коррелирует с IR700 флуоресценции, которая быстро уменьшается после питы (рис. 3в). Общая флуоресцентных изображений (ИВП) из GFP в необработанных опухолей (контроль) и в опухолях, получающих свет только увеличивается за счет роста опухоли. В опухолях, обработанных PIT, TFI из GFP постепенно снижалась в обработанной опухоли, в то время как противоположная опухоль в той же мыши (IV только, отсутствие света) продемонстрировали увеличение флуоресценции GFP (рис. 3б).

квантификации от общего числа интенсивность флуоресценции GFP показал, что наблюдалось значительное снижение после PIT (п = 5 мышей в каждой группе, * р = 0,0118 &ЛТ; 0,05, ** р = 0,0010 &л; 0,01, *** р = 0,0049 &л; 0,01, тест Тьюки с ANOVA) (рис. 3C). Из-за опухоли повторного роста, соотношение GFP снова увеличилось с 4-й день после того, как PIT, хотя она была ниже, чем в других контрольных группах. В режиме реального времени флуоресценции GFP его визуализация и количественное сравнение позволило в режиме реального времени групп и показал сильную корреляцию между более высоким уровнем флуоресценции GFP и прогрессии опухоли в каждой группе
. <Р> Чтобы подтвердить этот эффект, ех естественных условиях
анализ проводили (рис. 4, а). Эффект ИПН был подтвержден с уменьшением IR700 флуоресценции (рис. 4, б). При выполнении этого условия, интенсивность GFP из Экс естественных
опухоли уменьшились после того, как PIT (рис. 4б). Эти данные свидетельствуют о том, что в режиме реального времени GFP живой визуализации согласуется с ех естественных условиях
визуализации.
<Р> При PIT повторялся еженедельно, GFP флуоресценции активность в конечном итоге исчезли (рис. 4C и D), что указывает на полное убийство опухоли.

Характеристика распространяемой перитонеального модели с флуоресцентной томографии

для того чтобы определить естественную историю распространяемой перитонеального модели, серийный флуоресцентных изображений была выполнена. В имплантированных опухолей продемонстрировали высокий сигнал флуоресценции с IR700, IR800 и GFP, все из которых колокализуются друг с другом (IR800 был использован, чтобы избежать кишечной аутофлуоресценцию) (рис. 5). Эти данные свидетельствуют о том, что эта модель диссеминированного перитонеального рака можно наблюдать в живых мышей с помощью GFP флуоресценции.

GFP флуоресцентных изображений после того как в естественных условиях ПИТ в распространяемой перитонеального модели
<р> в реальном времени визуализации GFP флюоресценции выполняется в рассеянном перитонеального модели до и после PIT (рис. 6А). IR700 флуоресценции уменьшается после PIT (рис. S4). GFP TFI постепенно увеличивается в не-PIT групп из-за роста опухоли. В группе, получавшей PIT, GFP TFI снизилась с 1 дня до 3 дня после того, как PIT (рис. 6Б). Количественное определение суммарной интенсивности GFP флуоресценции показало значительное снижение после ИПН (п = 5 мышей в каждой группе, * р = 0,0295 ≪ 0,05, ** р = 0,0355 ≪ 0,05, критерий Крускала-Уоллиса с послетестовом) (рис. 6C). Из-за опухоли повторного роста, отношение GFP снова увеличилась с 4 дня после того, как PIT, хотя она поддерживается ниже, чем в других группах, как это наблюдается с моделью опухоли задней поверхности. Таким образом, PIT привело к значительному целенаправленную опухоль Летальный эффект в обоих фланг и распространяемой модели перитонеального опухоли и это может контролироваться с помощью GFP ТФИ.

Обсуждение
<р> Это исследование показывает, что эффект ИПН может быть мониторинг с отображением GFP флуоресценции. В отличие от апоптоза [12], [13], в которой GFP, и связанные с ними флуоресцентные белки становятся ярче из-за уменьшения объема цитоплазмы, во время некротической смерти клеток с PIT, повреждения мембраны приводит к высвобождению цитоплазматического содержимого, включая GFP. Эта уникальная характеристика GFP и связанных с ними флуоресцентных белков делает их полезными биомаркеров для ИПН.

В естественных условиях
GFP флуоресцентных изображений позволяет полный процесс онкогенеза, лечения, регрессии, метастазирования или рецидива, чтобы быть обнаружены в том же животном без инвазивных процедур [10], [11]. Используя клетки, экспрессирующие цитоплазматический GFP, противоопухолевые эффекты, вызванные PIT можно легко контролировать за счет экструзии из GFP обработанных клеток.
<Р> Концепция использования целевой светотерапии составляет более трех десятков лет [22]. Из-за гидрофобности традиционной фотодинамической терапии (ФДТ) сенсибилизаторов, фармакокинетика антитела, конъюгированного агентов PDT сильно ограничен в своей способности обеспечивать конъюгаты к цели. Поэтому PDT сенсибилизаторов отбирались с помощью антител только был успешным в моделях, где конъюгат вводили непосредственно в опухоль или брюшины [23]. Для того, чтобы поставить конъюгат антитело-фотосенсибилизатора (APSC) системно, фотосенсибилизатор должен быть преимущественно гидрофильными. Гидрофильный основе фталоцианина фотосенсибилизатора, IR700DX когда конъюгируют с антителом становится АРС, которые можно вводить внутривенно. Эта форма терапии, называемая ИПН, отличается от традиционного ФДТ не только в гидрофильностью фотосенсибилизатора, но и в его опоре на NIR света, чтобы активировать фотосенсибилизатора. NIR свет имеет лучшее проникновение тканей, чем нижний свет длины волны, используемой в фотодинамической терапии. Это новое поколение АРС демонстрирует подобные внутривенные фармакокинетики невооруженным антител, что приводит к высокой целевой накопления в опухоли с обязательным минимальным нецелевых и может быть применен к широкому спектру антител, что позволяет множество потенциальных применений по всему телу.
<Р> Несмотря на цитотоксические химиотерапии, исход распространенного рака желудка стадии остается на низком уровне. Потому что, у большинства пациентов с перитонеального метастазов, присутствующих с коварными такими симптомами, как плохой аппетит, потеря веса, вздутие живота, ощущения боли или диагноз анемия часто задерживается и местной терапии уже не представляется возможным [24]. PIT является перспективным методом лечения распространяемой перитонеальный рак. Для осуществления эффективного PIT, то APSC должны быть доставлены системно, и свет должен быть выборочно применен к брюшине. В этих условиях достаточно поставка APSCs привести к снижению диссеминированных опухолей после ИПН. Этот процесс можно контролировать с реальным временем В естественных условиях
GFP флуоресцентных изображений.
<Р> Есть несколько ограничений данного исследования. Следует отметить, что не все виды рака желудка выражают HER2 и, следовательно, TRA-IR700 не может быть равномерно эффективным в диссеминированного рака желудка. В самом деле, может возникнуть необходимость в использовании коктейля из APSCs эффективно охватить большинство профилей экспрессии в данной опухоли [25]. Еще один нюанс в данном исследовании, является то, что свет можно вводить чрескожно в маленьких мышей, но это невозможно в организме человека. Для эффективного лечения людей с PIT, будет необходимо применять свет лапароскопии, чтобы предотвратить поглощение кожей. Другим ограничением является то, что наша модель была оценена только в ослабленным иммунитетом мышей. Иммунологическая реакция ИПН будет оцениваться в будущем у иммунокомпетентных мышей. И, наконец, в ближайшем будущем GFP флуоресцентных изображений будет ограничено исследований на животных, так как он требует трансфекцию опухоли с эндогенным белком. Тем не менее, это полезно для считывания доклинических исследований.

Выводы
<р> PIT эффективен против HER2-положительным раком желудка перитонеального карциноматозом в мышиной модели и GFP флуоресценции визуализации позволяет осуществлять мониторинг PIT эффектов.

поддержка информации Рисунок S1 изображения.
Специальные целевые некротической смерти клеток наблюдалась после ИПН в пробирке.
N87-GFP клетки культивировали совместно с 3Т3 /DsRed (Non-HER, экспрессирующих) клеток. Они были обработаны тра-IR700 и наблюдали (до и после облучения NIR света). Целевая удельная смерть некротических клеток наблюдалась при возбуждении БИК светом (через 30 мин). Никаких повреждений не было продемонстрировано в 3Т3 /Dsred клеток. . * 3Т3 /DsRed клетки, Бар = 25 мкм
DOI: 10.1371 /journal.pone.0113276.s001
(TIFF) Рисунок S2
.
оскудение GFP-флуоресценции в 1 день после PIT наблюдалась <ЕМ> в пробирке.
Уменьшая интенсивности флуоресценции GFP-через 1 день после того, как котлован наблюдалось, таким образом, в зависимости от световой дозы. Бар = 100 мкм. Черная линия на краю был маркером для определения положения наблюдения
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s002
(TIFF)
Рисунок S3.
Уменьшение GFP-флуоресценции в 1 день после того, как ИПН оценивали с помощью проточной цитометрии. Уменьшая интенсивность флуоресценции GFP-через 1 день после того, как котлован таким образом, зависит от дозы света с помощью проточной цитометрии анализа
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s003
(TIFF) Рисунок S4
.
В естественных условиях
флуоресцентных изображений в ответ на неоднократные PIT в брюшную распространены модели мышей. В естественных условиях
флуоресцентных изображений в ответ на повторное PIT. IR700 флуоресценции снизился в ответ на PIT
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s004
(TIFF)
Video S1.
Покадровый DIC изображения ячейки N87-GFP, обработанной PIT. ЗАМЕДЛЕННАЯ последовательных изображений DIC (видео) клетки N87-GFP показывает морфологические изменения клетки после NIR облучения светом в клетках, обработанных тра-IR700 (за 25 мин наблюдения в общей сложности). Мигающий свет NIR облучение светом (2 Дж /см ^{2)
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s005
(AVI)
Видео S2.
Покадровый PI флуоресцентных изображения ячейки N87-GFP, обработанной PIT. ЗАМЕДЛЕННАЯ последовательные PI флуоресцентных изображений (видео) показывает быстрое повреждение мембраны клетки N87-GFP после NIR светового облучения в клетках, обработанных тра-IR700 (за 25 мин наблюдения в общей сложности). Мигающий свет NIR облучение светом (2 Дж /см 2)
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s006
(AVI)}

Выражение признательности
<р> Это исследование было поддержано исследовательской программой Intramural национальных институтов здравоохранения, Национальный институт рака, центр по исследованию рака. Kazuhide Сато поддерживается JSPS Research Fellowship для японской биомедицины и анализа поведения в NIH.

• PLoS ONE: MED30 Регламентирует пролиферации и моторики желудочных клеток рака
• PLoS ONE: Сравнительный анализ Протеомика рака желудка стволовых клеток