PLoS ONE: Photoimmunotherapy van maagkanker peritonitis carcinomatosa in een muis Model

Abstract

Photoimmunotherapy (PIT) is een nieuwe behandeling van kanker die de specificiteit van antilichamen combineert voor het richten van tumoren met de toxiciteit geïnduceerd door fotogevoelige na blootstelling aan nabij-infrarood (NIR) licht. We voerden PIT in een model van uitgezaaide maagkanker peritoneale carcinomatosa en bewaakt de werkzaamheid met In vivo
GFP fluorescentie beeldvorming. In vitro Kopen en In vivo
experimenten werden uitgevoerd met een HER2-uitdrukken, GFP tot expressie, maagkanker cellijn (N87-GFP). Conjugaat omvattende een fotosensibilisator, IR-700, geconjugeerd met trastuzumab (tra-IR700), gevolgd door NIR licht gebruikt voor PIT. In vitro
PIT werd geëvalueerd door het meten van cytotoxiciteit met dode vlekken en een afname in GFP fluorescentie. In vivo
PIT werd geëvalueerd in een verspreide peritoneale carcinomatosa model en een flank xenograft met behulp van de tumor volume metingen en GFP fluorescentie-intensiteit. In vivo
antitumoreffecten van PIT werden bevestigd door significante dalingen in tumorvolume (op dag 15, p < 0,0001 versus controle) en GFP-fluorescentie-intensiteit (flank model: op dag 3, PIT behandelde vs. controle p < 0,01 en peritoneale uitgezaaide model: op dag 3 PIT behandeld vs. control, p < 0,05). Cytotoxische effecten in vitro
bleken afhankelijk van de dosis licht te zijn en veroorzaakte necrotische een scheur waardoor GFP afgifte en een afname in fluorescentie-intensiteit in vitro.
Dus verlies van GFP fluorescentie gepresenteerd als een nuttig biomarker van de cel necrose na PIT

Visum:. Sato K, Choyke PL, Kobayashi H (2014) Photoimmunotherapy van maagkanker peritonitis carcinomatosa in een muismodel. PLoS ONE 9 (11): e113276. doi: 10.1371 /journal.pone.0113276

Editor: Irina V. Lebedeva, Columbia University, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 2 juli 2014; Aanvaard: 21 oktober 2014; Gepubliceerd: 17 november 2014

Dit is een open-access artikel, vrij van auteursrechten, en mag vrij worden gereproduceerd, gedistribueerd, verzonden, gewijzigd, gebouwd op, of anderszins gebruikt door iedereen voor elk rechtmatig doel. Het werk wordt onder de Creative Commons CC0 publieke domein toewijding ter beschikking gesteld

Data Availability:. De auteurs bevestigen dat alle gegevens waarop de bevindingen zijn volledig beschikbaar zonder beperking. Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door de NIH Intramurale programma en JSPS Research Fellowship. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagcarcinoom veroorzaakt meer dan 740.000 kankergerelateerde sterfgevallen per jaar wereldwijd vooral in Azië [1] - [3]. De meerderheid van de maagkanker patiënten aanwezig met lokaal gevorderd, recidiverend of gemetastaseerd ziekte zich verzetten tegen een curatieve operatie die meestal wordt beheerd door niet-genezende therapie [1]. Peritonitis carcinomatosa en de lever metastase komen vaak levensbedreigende uitingen van vergevorderd stadium maagkanker [1], [4]. Peritoneale metastasen komt ook bij eierstokkanker, appendiculair, colon, pancreas en maagkanker. Prognose is universeel slecht en lokale behandelingen zijn altijd succesvol met een hoge recidief en morbiditeit in verband met ascites en darmobstructie. Systemische therapie is meestal ook niet succesvol. Derhalve nieuwe werkwijzen voor het behandelen peritoneale carcinomatosis nodig.

Photoimmunotherapy (PIT) is een nieuw doelwit-celspecifieke behandeling van kanker die een antilichaam conjugaat fotosensibilisator (APSC) gevolgd door nabij infrarood (NIR) belichting werken. Een APSC bestaat uit een kankercel-specifiek monoklonaal antilichaam (mAb) en een fotosensibilisator, IR700, wat een silica-ftalocyanine covalent geconjugeerd met het antilichaam. De APSC doelmoleculen bindt aan het celmembraan en induceert bijna onmiddellijk celnecrose na blootstelling aan NIR licht bij 690 nm. In vitro studies hebben aangetoond
PIT tot zeer celspecifieke derhalve niet tot expressie brengende cellen direct naast doelcellen vertonen geen toxische effecten ervan [5]. Cellen behandeld met PIT ondergaan snelle volumevergroting leidt tot breuk van de celmembraan, extrusie van celinhoud in de extracellulaire ruimte en irreversibele necrose [6] - [8]. Onze resultaten en anderen laten zien dat cytotoxiciteit geïnduceerd door PIT niet volledig afhankelijk zijn van reactive oxygen species of het bestaan ​​van singlet zuurstof quenchers [9]. Bovendien cytotoxiciteit geïnduceerd door PIT heeft vooral in celmembraan plaats in de mitochondria zoals bij PDT.

Hoewel PIT resulteert in snelle cellulaire necrose, het totale volume van de tumor kan niet veranderen gedurende enkele dagen. Dit komt omdat het minstens enkele dagen macrofagen te voeren werkwijze en laat de behandelde tumor. Derhalve nieuwe methoden, voorbij omvangmetingen, nodig om de effecten van PIT controleren. Fluorescentie eiwit (FP) worden vaak gebruikt voor het visualiseren cellulaire processen [10], [11]. Terwijl de meeste apoptotische celdood leidt tot behoud van de celmembraan en het behoud van de FP maken fluorescentie ongevoelig celdood [12], [13], in PIT, de plotselinge breuk van celmembranen resulteert in extrusie van cytoplasmatische KP en dus een relatief snelle uitlezing van celdood. Een voordeel van POD In vivo
beeldvorming is dat ze geen extrinsieke injecties van middelen (zoals luciferine bij bioluminescentie), en kan in realtime [14] worden bewaakt - [18]. Omdat ze gentransfectie vereisen, zouden waarschijnlijk alleen bruikbaar in preklinische studies.

In dit onderzoek onderzochten we het effect van PIT in een muismodel van uitgezaaide peritoneale maagkanker gebruik in vivo GFP fluorescentie beeldvorming monitoren reactie.

Materialen en methoden

reagentia

Water oplosbaar, silicium-ftalocyanine derivaat, IRDye 700DX NHS ester en IRDye 800 CW NHS ester werden verkregen van LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA). Panitumumab, een volledig gehumaniseerd IgG _{2 mAb gericht tegen EGFR werd gekocht van Amgen (Thousand Oaks, CA, USA). Trastuzumab, 95% gehumaniseerde IgG 1 mAb gericht tegen HER2, werd gekocht bij Genentech (South San Francisco, CA, USA). Alle andere chemicaliën waren van reagenskwaliteit.}

Synthese van IR700-geconjugeerde trastuzumab of panitumumab en IR800-geconjugeerde trastuzumab

Conjugatie van kleurstoffen met mAb's werd uitgevoerd volgens een eerder rapport [19]. In het kort, panitumumab of trastuzumab (1 mg, 6,8 nmol) werd geïncubeerd met IR700 NHS ester (60,2 g, 30,8 nmol) of IRDye 800 CW NHS ester (35,9 g, 30,8 nmol) in 0,1 mol /l Na _{2HPO 4 (pH 8,6) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Het mengsel werd gezuiverd met een Sephadex G50-kolom (PD-10, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). De eiwitconcentratie werd bepaald met Coomassie Plus eiwitbepalingskit (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA) door meting van de absorptie bij 595 nm met spectroscopie (8453 waardesysteem, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). De concentratie van IR700 en IR800 werd respectievelijk gemeten door absorptie bij 689 nm of 774 nm spectroscopie om het aantal moleculen geconjugeerd fluorofoor elk mAb bevestigen. De synthese werd zo geregeld dat gemiddeld vier moleculen IR700 en IR800 twee moleculen gebonden aan een enkel antilichaam. We voerden SDS-PAGE als een kwaliteitscontrole voor elk conjugaat zoals eerder beschreven [19]. We korten IR700 geconjugeerd aan trastuzumab als tra-IR700, aan panitumumab als pan-IR700 en IR800 geconjugeerd aan trastuzumab als tra-IR800.}

Cell cultuur

N87-GFP-cellen stabiel tot expressie GFP werden gekocht van ANTI KANKER (San Diego, CA, USA). Hoge GFP expressie werd bevestigd in de afwezigheid van een selectiemiddel met 10 passages. Als u specifieke celdoding door PIT te evalueren, werden 3T3-cellen stabiel tot expressie DsRed (3T3 /DsRed) gebruikt als een negatieve controle [5]. Cellen werden gekweekt in RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline /streptomycine (Life Technologies) in weefselkweek kolven in een bevochtigde incubator bij 37 ° C in een atmosfeer van 95 % lucht en 5% kooldioxide

fluorescentiemicroscopie

de antigen-specifieke lokalisatie van IR700 conjugaten en de verandering in celmorfologie na PIT detecteren, werd fluorescentie microscopie uitgevoerd (IX61 of IX81.; Olympus America, Melville, NY, USA). Tienduizend cellen werden gezaaid op-cover met glazen bodem gerechten en gedurende 24 uur. Tra-IR700 werd vervolgens toegevoegd aan het kweekmedium (fenolrood vrij) bij 10 ug /ml en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 6 uur. De cellen werden vervolgens gewassen met PBS; Propidiumjodide (PI) (1:2000) of Cytox Blue (1:500) (Life Technologies) werd aan het medium 30 min toegevoegd voordat PIT om dode cellen te detecteren. De cellen werden vervolgens blootgesteld aan NIR licht en seriële beelden werden verkregen. Een dag na de PIT, werden de cellen gewassen en geïncubeerd met nieuw medium na PIT (0,5 J /cm ^{2) en PI werd opnieuw toegevoegd. Opdat de regio wordt belicht markeringen werden aan elke kweekschaal aan te geven waar de beeldvorming werd verkregen. Het filter werd ingesteld op IR700 fluorescentie met een 590-650 nm excitatie filter op te sporen, en een 665-740 nm band passeren emissie filter. Analyse van de beelden werd uitgevoerd met ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij/).}

Flowcytometrie

Fluorescence uit cellen na incubatie met pan-IR700 of tra-IR700 werd gemeten met een flow cytometer (FACS Calibur, BD BioSciences, San Jose, CA, USA) en CellQuest software (BD BioSciences). Cellen (1 x 10 ^{5) werden geïncubeerd met elk conjugaat gedurende 6 uur bij 37 ° C. Om de specifieke binding van de geconjugeerde antilichamen valideren, overmaat antilichaam (50 ug) werd gebruikt voor blokkeren 0,5 ug kleurstof-antilichaam conjugaten [8].}

In vitro PIT

honderdduizend cellen werden geënt in 24 putjes platen en geïncubeerd gedurende 24 uur. Kweekmedium werd vervangen door vers kweekmedium bevattende 10 ug /ml TRA-IR700 en de cellen werden gedurende 6 uur bij 37 ° C. Na wassen met PBS werd fenolrood kweekmedium toegevoegd. Vervolgens werden de cellen bestraald met NIR laserlicht nm 685-695 (BWF5-690-8-600-0.37; B &. W TEK Inc., Newark, DE, USA). De werkelijke vermogensdichtheid van mW /cm ^{2 werd gemeten met een optische vermogensmeter (PM 100, Thorlabs, Newton, NJ, USA).}

Cytotoxiciteitstest

De cytotoxische effecten van PIT met tra-IR700 werden bepaald door flowcytometrische PI kleuring, die gecompromitteerde celmembranen detecteert. Voor flowcytometrische analyse werden cellen getrypsiniseerd 1 uur na behandeling en gewassen met PBS. PI is in de celsuspensie (laatste 2 ug /ml) toegevoegd en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 30 min, gevolgd door flowcytometrie.

Schatting van GFP fluorescentie-intensiteit in vitro

honderdduizend -cellen werden gezaaid op-cover met glazen bodem gerechten en gedurende 12 uur. Tra-IR700 werd vervolgens toegevoegd aan het kweekmedium (fenolrood vrij) bij 10 ug /ml en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 6 uur. De cellen werden gewassen met PBS en vervangen door een nieuw, fenolrood kweekmedium en de onderzijde van het dekglas werd gemerkt (om de positie van waarneming te bepalen). Na PIT werden de cellen opnieuw geïncubeerd gedurende 1 dag. Een dag na PIT werden de cellen opnieuw waargenomen. Het GFP intensiteit werd geëvalueerd met beeldpunten met dezelfde drempelwaarde in hetzelfde gebied [20]. Analyse van de beeldvorming werd uitgevoerd met ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij/).

De fluorescentie van behandelde cellen werd eveneens gemeten met een flow cytometer (FACS Calibur).

Animal en tumor modellen

Alle in vivo
procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de gids voor de zorg en het gebruik van Laboratory Animal Resources (1996), US National Research Council, en goedgekeurd door de NIH Animal Care en gebruik Comite. Zes tot acht weken oude vrouwelijke homozygote athymische naakt muizen werden aangekocht bij Charles River (NCI-Frederick). Om alleen de directe tumorcel te doden effect van evalueren In vivo
PIT, immuungecompromitteerde naakt muizen werden gebruikt. Tijdens procedures werden muizen verdoofd met isofluraan. Tien miljoen N87-GFP-cellen werden subcutaan in de rechter dorsale gedeelte van de muizen. Om het tumorvolume te bepalen, de grootste lengte-diameter (lengte) en de grootste dwarse diameter (breedte) werd gemeten met een externe remklauw. Tumor volumes gebaseerd op calipermetingen werden berekend met de volgende formule; tumor volume = lengte x breedte ^{2 × 0,5. Tumoren bereiken van ongeveer 100 mm 3 in volume werden geselecteerd voor de studie. Om GFP fluorescentie na PIT te meten, werden tien miljoen N87-GFP-cellen subcutaan geïnjecteerd in zowel dorsi van de muizen. Voor de verspreide buikvlieskanker muismodel, werden vijftig miljoen N87-GFP cellen met PBS (totaal 300 pi) geïnjecteerd in de buikholte.}

In vivo fluorescentie beeldvorming

In vivo
fluorescentie-beelden werden verkregen met een Pearl Imager (LI-COR Bioscience) voor het detecteren van IR700 /IR800 fluorescentie, en een Maestro Imager (CRI, Woburn, MA, USA) voor GFP. Voor GFP, een banddoorlaatfilter 445-490 nm (excitatie) en een lange pas blauwfilter dan 515 nm (emissie) werden gebruikt. De instelbare emissie-filter werd automatisch stapte in stappen van 10 nm 500-600 nm voor de groene filter sets tegen constante blootstelling (500 msec). De spectrale fluorescentiebeelden bestaan ​​uit autofluorescentie spectra en de spectra van GFP (GFP N87-tumor), die vervolgens vermengd waren, gebaseerd op de spectrale karakteristiek patroon van GFP, met behulp Maestro software (CRi). Regio's van belang (ROI) werden met de hand getekend, hetzij op de flank tumor of over de buikstreek al naar gelang het model en de fluorescentie-intensiteit werd gemeten [19].

Analyse van verspreid peritoneale muismodel

Muizen met ofwel verspreid buikvlieskanker (6 weken na implantatie cel) of flank tumoren (7 dagen na cel implantatie) werden intraveneus geïnjecteerd met 100 ug van tra-IR700 en tra-IR800. Een dag na de injectie werden seriële beelden uitgevoerd met een Pearl Imager aan IR700 /IR800 fluorescentie, en de Maestro voor GFP te detecteren. Wit lichtbeelden van de muizen werden verkregen met een iphone5 (Apple Inc., Cupertino, CA, USA).

In vivo PIT

Om het effect van PIT in de flank model evalueren , N87-GFP-tumordragende muizen werden willekeurig verdeeld in 4 groepen van tenminste 10 dieren per groep als volgt: (1) geen behandeling (controle); (2) alleen NIR blootstelling aan licht bij 50 J /cm ^{2 op dag 1 en 100 J /cm 2 op dag 2; (3) 100 ug tra-IR700 i.v., geen NIR blootstelling aan licht; (4) 100 ug tra-IR700 intraveneus, NIR licht werd toegediend bij 50 J /cm 2 op dag 1 na injectie en 100 J /cm 2 op dag 2 na de injectie. Deze omstandigheden werden elke week gedurende maximaal 3 weken. De muizen werden dagelijks gecontroleerd en fluorescentiebeelden verkregen beginnend 1 dag vóór PIT en tumorvolumes werden drie keer per week gemeten totdat de tumordiameter 2 cm bereikte, waarna de muizen werden gedood met koolstofdioxide. Voor fluorescentie beeldvorming werden de muizen geïnjecteerd met 100 pg TRA-IR700 of bestraalde als volgt: (1) NIR licht werd toegediend met 50 J /cm 2 op dag 1 na injectie en 100 J /cm 2 op dag 2 naar rechts tumor (2) geen NIR licht toegediend aan de linkerkant tumor die diende als controle. Controles omvatten (1) Alleen NIR blootstelling aan licht bij 50 J /cm 2 op dag 1 en 100 J /cm 2 op dag 2 naar rechts tumor; (2) geen behandeling voor de linker tumor}

Om verspreid buikvlieskanker evalueren, werden muizen willekeurig verdeeld in 4 groepen van 5 dieren per groep voor de volgende behandelingen:. (1) geen behandeling (controle); (2) alleen NIR blootstelling aan licht bij 50 J /cm ^{2 op dag 1 en 100 J /cm 2 op dag 2; (3) 100 ug tra-IR700 i.v., geen NIR blootstelling aan licht; (4) 100 ug tra-IR700 iv, NIR licht werd toegediend bij 50 J /cm 2 op dag 1 en 100 J /cm 2 op dag 2 na de injectie.}

Statistische analyse

De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelden ± sem van een minimum van vier experimenten, tenzij anders aangegeven. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een statistisch programma (GraphPad Prism, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Voor meerdere vergelijkingen, een one-way variantie-analyse (ANOVA) met post-test (test Kruskal-Wallis met post-test) en test Tukey's werd gebruikt. De cumulatieve kans op overleving, hierin bepaald als de tumordiameter niet tot 2 cm te bereiken, werd geschat in elke groep met behulp van de Kaplan-Meier curve analyse en de resultaten werden vergeleken met de log-rank test en Wilcoxon-test. Student's t
test werd ook gebruikt om de twee In vitro
studie te vergelijken; p < 0,05 werd beschouwd als een statistisch significant verschil aan te geven

Resultaten

Bevestiging van de expressie profiel van de N87-GFP cellen als doelwit voor PIT

We hebben gekeken naar de fluorescentie signalen. van pan-IR700 en tra-IR700 gebonden aan N87-GFP cellen door FACS. Na 6 uur incubatie met ofwel pan-IR700 of tra-IR700, N87-GFP cellen consequent toonde hogere helderheid met tra-IR700 dan pan-IR700 (Fig. 1A). Deze signalen werden bijna volledig geblokkeerd door de toevoeging van overmaat trastuzumab of panitumumab specifieke binding voorstellen en de hogere expressie van HER2 dan EGFR [21] bevestigd. Deze gegevens suggereerden dat HER2 was de voorkeur doelwit voor PIT in N87-GFP cellen als gevolg van de hogere expressie.

Microscopie van in vitro PIT

Serial fluorescentie microscopie van N87-GFP-cellen werd uitgevoerd voordat en na de PIT. Na blootstelling aan licht NIR (2 J /cm ^{2) cellulaire zwelling, bleb vorming en breuk van de lysosoom waargenomen, resulterend in de extrusie van extracellulair cytoplasma (fig. 1B). PI kleuring toonde acute cytotoxische membraan schade veroorzaakt door PIT. De meeste van deze cellulaire veranderingen werden waargenomen binnen 30 minuten van de blootstelling aan licht (Ondersteunende informatie video S1 en S2). Geen significante veranderingen werden in de EGFR-negatieve gedetecteerd 3T3-cellen bestraald met NIR licht, wat suggereert PIT veroorzaakte geen schade in non-target cellen (Fig. S1).}

Evaluatie van de in vitro PIT effect

om het effect van in vitro
PIT kwantificeren hebben we een cytotoxiciteit assay gebaseerd op opname van PI, konden aantonen dat celdood nam toe met toenemende dosis licht (Fig. 1C). Geen significante cytotoxiciteit werd gedetecteerd met NIR blootstelling aan licht of tra-IR700 alleen.

Evaluatie met GFP-fluorescentie in vitro na PIT

Een dag na blootstelling aan NIR licht van 0,5 J /cm ^{2, ongeveer 50% van de cellen vertoonden acute cytotoxiciteit (Fig. 1C), en de GFP fluorescentie intensiteit werd sterk verminderd in dode cellen (gekleurd positief PI), terwijl GFP fluorescentie werd bewaard in overlevende cellen (Fig. 1D). Deze studies suggereren dat GFP werd geëxtrudeerd uit de cel na membraanscheurdruk. Om de verandering van GFP fluorescentie te onderzoeken, hebben we de totale GFP pixels in hetzelfde gebied voor en één dag na de PIT (afb. S2). De GFP-fluorescentie ratio daalde direct met lichte dosis, terwijl er geen daling werd gedetecteerd met NIR blootstelling aan licht of tra-IR700 alleen (Fig. 1E). Deze resultaten werden bevestigd door FACS-analyse (Fig. 1F en fig. S3) en suggereren dat PIT leidt tot een afname van GFP fluorescentie volgende necrotische celdood op dag 1 na PIT op een wijze afhankelijk van de dosis licht.}

in vivo PIT vermindert tumorvolume in flank xenotransplantaatmodel

Vervolgens hebben we het effect van PIT in vivo
flank tumordragende muizen onderzocht (Fig. 2A). PIT induceerde significante verminderingen in tumor volume (n = 10 in elke groep, * p = 0,0456 < 0,05, Tukey's test). Vier muizen op de tien in PIT groep werden volledig genezen door de behandeling (Fig. 2B). Overleving was significant verlengd in de PIT-groep in vergelijking met de controlegroep (n = 10 in elke groep, ** p < 0,0001, long-rank test en Wilcoxon test) (Fig 2C.). Deze gegevens suggereren dat PIT veroorzaakte aanzienlijke tumor reductie en verlengde overleving In vivo
.

GFP Fluorescentie beeldvorming na In vivo PIT in flank xenotransplantaatmodel

Om te controleren in vivo
PIT, real-time beeldvorming GFP werd uitgevoerd in muizen met N87-GFP bilaterale flank tumoren (Fig. 3A). GFP-fluorescentie toonde tumor lasten en de respons op PIT. GFP-fluorescentie werd gecorreleerd met IR700 fluorescentie, die snel af na PIT (fig. 3C). Totaal fluorescentiebeeldvorming (TFI) van GFP in onbehandelde tumoren (controle) en in tumoren ontvangen van licht alleen maar toegenomen als gevolg van de groei van tumoren. In tumoren behandeld met PIT, TFI van GFP geleidelijk af in de behandelde tumor, terwijl het omgekeerde tumor in dezelfde muis (enkel iv, geen licht) aangetoond van GFP fluorescentie (Fig. 3B).

Kwantificering van totaal GFP fluorescentie-intensiteit gebleken dat er een significante afname na PIT (n = 5 muizen in elke groep, * p = 0,0118 < 0,05, ** p = 0,0010 < 0,01, *** p = 0,0049 < 0,01, Tukey's test met ANOVA) (fig. 3C). Door tumor hergroei, de GFP verhouding weer toe vanaf dag 4 na PIT, hoewel lager dan andere controlegroepen was. De real-time GFP fluorescentie beeldvorming en de kwantificering enabled real-time vergelijking van de groepen en liet een sterke correlatie tussen hoger GFP fluorescentie en progressie van de tumor in elke groep.

Om dit effect te bevestigen, ex vivo
analyse werd uitgevoerd (fig. 4A). De PIT effect werd bevestigd met een afname in fluorescentie IR700 (Fig. 4B). Onder deze voorwaarde, GFP intensiteit van de ex vivo
tumoren af ​​na PIT (Fig. 4B). Deze gegevens suggereren dat real-time GFP levende beeldvorming is met ex vivo beeldvorming
.

Wanneer PIT wekelijks werd herhaald, GFP fluorescentie activiteit uiteindelijk verdwenen (fig. 4C en D), wijst op een volledige doden van de tumor.

Analyse van de verspreide peritoneale model met fluorescentiebeeldvorming

met het oog op de natuurlijke geschiedenis van de verspreide peritoneale model te bepalen, werd serieel fluorescentie beeldvorming uitgevoerd. De geïmplanteerde tumoren aangetoond hoog fluorescentiesignaal met IR700, IR800 en GFP, die co-gelokaliseerd met elkaar (IR800 werd gebruikt om intestinale autofluorescentie voorkomen) (fig. 5). Deze gegevens suggereren dat dit model van gedissemineerde peritoneale kanker in levende muizen kunnen gemonitord worden met GFP-fluorescentie.

GFP fluorescentie beeldvorming in vivo na PIT verspreid in peritoneale model

Realtime GFP fluorescentie beeldvorming was uitgevoerd in de verspreide peritoneale model voor en na de PIT (afb. 6A). IR700 fluorescentie af na PIT (afb. S4). GFP TFI geleidelijk in de niet-PIT groepen vanwege tumorgroei. In de PIT behandelde groep GFP TFI gedaald van 1 dag tot 3 dagen na PIT (Fig. 6B). Kwantificering van de totale GFP fluorescentie-intensiteit onthulde een significante afname na PIT (n = 5 muizen in elke groep, * p = 0,0295 < 0,05, ** p = 0,0355 < 0,05, Kruskal-Wallis-test met post-test) (Fig. 6C). Door de tumor hergroei, de GFP verhouding weer verhoogd van 4 dagen na PIT, hoewel lager dan andere groepen behouden, zoals waargenomen met de flank tumormodel. Aldus PIT tot aanzienlijke gerichte tumor dodende werking in zowel de flank en verspreid peritoneale tumormodellen en dit kan worden gevolgd met GFP TFI.

Discussie

Deze studie toont aan dat het effect van PIT kan bewaakt met GFP fluorescentie imaging. In tegenstelling tot apoptose [12], [13], waarin GFP en de daarmee samenhangende fluorescerende eiwitten worden helderder als gevolg van de dalende cytoplasma volume, tijdens necrotische celdood met PIT, membraan schade leidt tot vrijgeven van cytoplasmatische inhoud waaronder GFP. Deze unieke eigenschap van GFP en de daarmee samenhangende fluorescerende eiwitten maakt ze nuttig biomerkers voor PIT.

In vivo
GFP fluorescentie beeldvorming maakt het volledige proces van het ontstaan ​​van tumoren, behandeling, regressie, metastase, of herhaling, tot gedetecteerd in hetzelfde dier zonder invasieve procedures [10], [11]. Door toepassing van cellen die cytoplasmatische GFP kan de antitumor effecten geïnduceerd door PIT gemakkelijk worden gecontroleerd door extrusie van GFP van behandelde cellen.

Het concept van gerichte lichttherapie is dan dertig jaar oude [22]. Vanwege de hydrofobiciteit van traditionele fotodynamische therapie (PDT) sensibilisatoren wordt de farmacokinetiek van antilichaam geconjugeerd PDT middelen zeer beperkt in zijn vermogen om conjugaten te leveren aan het doel. Daarom PDT sensibilisatoren doelgroep antilichamen slechts succesvol geweest in modellen waarbij het conjugaat direct in de tumor of het buikvlies [23] werd geïnjecteerd. Om een ​​antilichaam-conjugaat fotosensibilisator (APSC) systemisch moet de fotosensibilisator voorkeur hydrofiel. De hydrofiele-ftalocyanine gebaseerde fotosensibilisator, IR700DX wanneer geconjugeerd met een antilichaam wordt een APC die intraveneus kunnen worden toegediend. Deze vorm van therapie, genaamd PIT, verschillende voorbeelden van PDT niet alleen in de hydrofiliciteit van de fotosensibilisator, maar ook in de afhankelijkheid van NIR licht om fotosensibilisator te activeren. NIR licht heeft een betere penetratie dan de lagere golflengtelicht gebruikt in PDT. Deze nieuwe generatie APCs toont soortgelijke intraveneuze farmacokinetiek naakte antilichamen, wat resulteert in zeer gerichte tumorophoping met minimale niet-doelwit-bindingsgebied en kan worden toegepast op een breed spectrum van antilichamen, waardoor vele mogelijke toepassingen in het lichaam.

Ondanks cytotoxische chemotherapie, de uitkomst voor gevorderde stadium maagkanker blijft slecht. Omdat de meeste patiënten met peritoneale metastasen aanwezig met verraderlijk symptomen zoals slechte eetlust, gewichtsverlies, opgeblazen gevoel, pijn of anemie diagnose wordt vaak vertraagd en lokale therapieën niet meer mogelijk is [24]. PIT is een veelbelovende werkwijze voor het behandelen verspreid peritoneale kanker. Om effectieve PIT vervullen moeten de APSC systemisch afgeleverd en het licht selectief moet worden toegepast op het buikvlies. Onder deze omstandigheden is er voldoende afname van APSCs leiden tot vermindering van uitgezaaide tumoren na PIT. Dit proces kan worden bewaakt met real time In vivo
GFP fluorescentiebeeldvorming.

Er zijn verscheidene beperkingen aan deze studie. Opgemerkt zij dat niet alle maagkankers HER2 expressie en daarom kan tra-IR700 niet uniform effectief verspreid maagkanker is. Inderdaad, kan het nodig zijn het gebruik van een cocktail van APSCs effectief het grootste deel van de expressieprofielen in een bepaalde tumor [25]. Een ander nadeel van deze studie is dat licht transcutaan kunnen worden toegediend in kleine muizen, maar dit is niet mogelijk bij de mens. Om mensen met PIT effectief te behandelen, zal het nodig zijn om licht laparoscopically toepassing van absorptie door de huid te voorkomen. Een andere beperking is dat ons model alleen werd geëvalueerd bij immunogecompromitteerde muizen. De immunologische reactie van PIT zal worden geëvalueerd in de toekomst in immunocompetente muizen. Tenslotte op korte termijn GFP fluorescentie imaging beperkt tot dierproeven, zoals transfectie van de tumor met een endogeen eiwit vereist. Toch is dit een handig uitlezing voor preklinische studies.

Conclusies

PIT is effectief tegen HER2-positieve maagkanker peritoneale metastasen in een muismodel en GFP fluorescentie beeldvorming maakt monitoring van de PIT-effecten.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
Specifieke gerichte necrotische celdood werd waargenomen na PIT in vitro.
N87-GFP cellen werden samen gekweekt met 3T3 /DsRed (non-HER tot expressie) cellen. Ze werden met TRA-IR700 en waargenomen (voor en na bestraling van NIR licht). Gerichte specifieke necrotische celdood werd waargenomen bij excitatie met NIR licht (na 30 min). Geen schade werd aangetoond in 3T3 /DsRed cellen. . * 3T3 /DsRed cellen, Bar = 25 urn
doi: 10.1371 /journal.pone.0113276.s001
(TIFF)
Figuur S2.
Verminderen van GFP-fluorescentie in 1 dag na PIT waargenomen in vitro.
Afnemende GFP-fluorescentie-intensiteit op 1 dag na PIT waargenomen worden op een wijze afhankelijk van de dosis licht. Bar = 100 urn. De zwarte lijn op de hoek was de markering om de positie van de waarneming te bepalen
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113276.s002
(TIFF)
Figuur S3.
afname van GFP-fluorescentie bij 1 dag na de PIT geëvalueerd door flowcytometrie. Afnemende GFP-fluorescentie-intensiteit op 1 dag na de PIT was op een wijze die afhankelijk is van de dosis licht door flow cytometrische analyse
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113276.s003
(TIFF)
figuur S4.
In vivo
fluorescentiebeeldvorming in reactie op herhaald PIT in de peritoneale verspreid muismodel. In vivo
fluorescentiebeeldvorming in reactie op herhaald PIT. IR700 fluorescentie werd verlaagd in reactie op de PIT
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113276.s004
(TIFF)
Video S1.
Time-lapse DIC beelden van een N87-GFP cellen behandeld door PIT. Time-lapse opeenvolgende DIC beeld (video) van een N87-GFP cel geeft morfologische veranderingen van de cellen na NIR bestraling met licht in cellen behandeld met tra-IR700 (gedurende 25 min waarneming in totaal). Knipperlicht is NIR licht bestraling (2 J /cm ^{2)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113276.s005
(AVI)
Video S2.
Time-lapse PI fluorescentie beelden van een N87-GFP cellen behandeld door PIT. Time-lapse opeenvolgende PI fluorescentie beeld (video) vertoont een snelle membraan van de huid van een N87-GFP cellen na NIR bestraling met licht in cellen behandeld met tra-IR700 (gedurende 25 min waarneming in totaal). Knipperlicht is NIR licht bestraling (2 J /cm 2)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113276.s006
(AVI)}

Dankwoord

dit onderzoek werd ondersteund door de Intramurale Research Program van de National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research. Kazuhide Sato wordt ondersteund met JSPS Research Fellowship voor Japanse Biomedische en Behavioral Onderzoekers van NIH.

• PLoS ONE: MED30 Regelt de verspreiding en de beweeglijkheid van maagkanker Cells
• PLoS ONE: Vergelijkende Proteomics Analyse van maagkanker Stem Cells