PLoS One: Photoimmunotherapy gyomorrák peritoneális carcinomatosis egy egérmodellben

absztrakt

Photoimmunotherapy (PIT) egy új rák kezelésére, amely egyesíti a specificitását ellenanyagok célzáshoz tumorok a toxicitás által indukált fényérzékenyítő expozíció után a közeli infravörös (NIR) fény. Végeztünk PIT modell disszeminált gyomorrák peritoneális carcinomatosis és nyomon hatásossága in vivo katalógusa GFP fluoreszcencia képalkotás. In vitro
és a in vivo
kísérleteket végeztünk egy HER2-t expresszáló, GFP-t expresszáló, gyomorrák sejtvonal (N87-GFP). A konjugátum amely egy fényérzékenyítő, IR-700, konjugált trastuzumab (TRA-IR700), majd a NIR fény használtunk gödörbe. Az in vitro katalógusa PIT mértük a citotoxicitás halott festéssel és csökken a GFP fluoreszcencia. Az in vivo katalógusa PIT értékeltük terjeszteni peritoneális carcinomatosis modell és a lágyék xenograft segítségével tumor térfogat mérésének és GFP fluoreszcencia intenzitását. in vivo
tumorellenes hatásait PIT is megerősítették jelentős csökkentést tumor térfogat (a 15. napon, p < 0,0001 vs. kontroll) és GFP fluoreszcencia intenzitását (lágyék modell: A 3. napon, PIT kezelt vs. kontroll p < 0,01 és a peritoneális disszeminált modell: a 3. napon PIT-kezelt vs. kontroll, p < 0,05). Citotoxikus hatásait in vitro
során kimutatták, hogy függ a fény dózis és okozott nekrotikus sejt törés vezető GFP felszabadulását és csökkenti a fluoreszcencia intenzitás in vitro.
Így elvesztése GFP fluoreszcencia szolgált mint hasznos biomarker sejtelhalás után PIT. katalógusa

Citation: Sato K, Choyke PL, Kobayashi H (2014) Photoimmunotherapy gyomorrák peritoneális carcinomatosis egér modellen. PLoS ONE 9 (11): e113276. doi: 10,1371 /journal.pone.0113276 katalógusa

Szerkesztő: Irina V. Lebedeva, Columbia University, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: július 2, 2014; Elfogadva: október 21, 2014; Megjelent: november 17, 2014 katalógusa

Ez egy nyílt hozzáférésű cikk, mentesen minden szerzői jogot, és szabadon másolható, terjeszthető, továbbított, módosított, épül, vagy más módon bárki felhasználhatja bármilyen törvényes célra. A munka legyen elérhető a Creative Commons CC0 közkincs elkötelezettség. Katalógusa

Az adatok elérhetősége: A szerzők megerősítik, hogy az összes adatot a megállapításokat alátámasztó teljes mértékben hozzáférhető, korlátozás nélkül. Minden lényeges adat a papír és az azt támogató információs fájlokat. Katalógusa

Forrás: Ezt a munkát segítette a NIH Intramural program JSPS Kutatási Ösztöndíj. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

gyomorrák okozza több mint 740.000 rákkal kapcsolatos haláleset évente világszerte, különösen Ázsiában [1] - [3]. A legtöbb gyomorrákos betegek jelenlegi lokálisan előrehaladott, recidiváló vagy metasztatikus betegség ellentétes kuratív műtét, ami többnyire sikerült a nem gyógyító terápia [1]. A hashártya carcinomatosis és a máj metasztázis gyakori életveszélyes megnyilvánulásai előrehaladott stádiumú gyomorrák [1], [4]. Peritoneális carcinomatosis is előfordul petefészek-, appendix, vastagbél, hasnyálmirigy és a gyomor rák. Prognózis általánosan gyenge és a helyi kezelések mindig sikertelen magas recidívák és morbiditására ascites és bélelzáródás. Szisztémás terápia is általában sikertelen. Így az új kezelési eljárásaira peritoneális carcinomatosis van szükség.

Photoimmunotherapy (PIT) egy új cél-sejt-specifikus rák kezelésére alkalmaz egy antitest fényérzékenyítő konjugátummal (APSC), majd a közeli infravörös (NIR) fénytől. Egy APSC áll egy rákos sejt-specifikus monoklonális antitest (mAb), és egy fényérzékenyítő, IR700, amely egy szilícium-dioxid-ftalocianin-származék kovalensen konjugáljuk az antitestet. A APSC kötődik célmolekulák a sejtmembránon, majd indukál majdnem azonnali sejt nekrózis expozíció után a NIR fényt 690 nm-en. In vitro
vizsgálatok kimutatták PIT, hogy nagymértékben sejt-specifikus, ezért, nem-expresszáló sejtek közvetlenül szomszédos megcélzott sejtek nem mutatnak toxikus hatást [5]. A sejteket kezeltük PIT mennek keresztül gyors volumenpótlással vezető törés a sejtmembrán, extrudálása cella tartalmát az extracelluláris térbe, és visszafordíthatatlan nekrózis [6] - [8]. Eredményeink és mások azt mutatják, hogy a citotoxicitás által indukált PIT nem teljesen támaszkodnak reaktív oxigéngyökök vagy a létező szingulett oxigén kvencserekre [9]. Továbbá citotoxicitást indukált PIT elsősorban a sejtmembránon inkább a mitokondriumok előfordul PDT. Katalógusa

A PIT eredmények gyors sejtnekrózisra egységek teljes mennyiségét a tumor nem változik néhány napig. Ez azért van, mert még legalább néhány napig makrofágok be, a folyamat és hagyja a kezelt daganat. Ezért új módszereket, túl méretmeghatározásnál, van szükség, hogy figyelemmel kíséri a hatását PIT. Fluoreszcens fehérjék (FPS) általánosan használják vizualizálására celluláris folyamatok [10], [11]. Míg a legtöbb apoptotikus sejthalált eredményez megőrzése a sejtmembrán és megtartását az FP így fluoreszcencia érzéketlen sejthalálhoz [12], [13], a PIT, a hirtelen törés a sejtmembránok eredményezi extrudálása citoplazmatikus keretprogramok, és ezért egy viszonylag gyors kiolvasását sejthalál. Egyik előnye, fps in vivo
képalkotás az, hogy nem igényelnek külső injekciót szerek (például luciferin abban az esetben, biolumineszcencia), és lehet ellenőrizni, valós időben [14] - [18]. Mivel ezek géntranszfekciós, hogy valószínűleg csak hasznos lehet a pre-klinikai vizsgálatok során. Katalógusa

Ebben a tanulmányban megvizsgáltuk a hatékonyságát PIT egérmodell- terjesztett peritoneális gyomorrák segítségével in vivo GFP fluoreszcencia képalkotó válasz monitorozására. katalógusa

anyagok és módszerek katalógusa

Reagensek katalógusa

Vízben oldódó, szilícium-phthalocyanine származék, IRDye 700DX NHS-észter és IRDye 800 CW NHS-észtert kaptuk LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA). Panitumumab, egy teljesen humanizált IgG _{2 mAb ellen irányul EGFR, vásároltunk a Amgen (Thousand Oaks, CA, USA). Trastuzumab, 95% humanizált IgG 1 monoklonális ellen HER2-ben vásárolt a Genentech (South San Francisco, CA, USA). Minden más vegyszer reagens minőségű. Katalógusa}

szintézise IR700 konjugált trastuzumab vagy panitumumabot és IR800 konjugált trastuzumab katalógusa

A konjugáció tartalmazó színezékek monoklonális ellenanyagok szerint végeztük egy korábbi jelentés [19]. Röviden, a panitumumab vagy trasztuzumab (1 mg, 6,8 nmol) inkubálunk IR700 NHS-észter (60,2 ng, 30,8 nmol), vagy IRDye 800 CW NHS-észter (35,9 ng, 30,8 nmol) 0,1 mol /l Na _{2HPO 4 (pH = 8,6) szobahőmérsékleten 1 órán át. Az elegyet tisztítottuk Sephadex G50 oszlopon (PD-10; a GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). A fehérje koncentráció meghatározása Coomassie Plus fehérje esszé kit (Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford, IL, USA) mérjük az abszorpció 595 nm-en spektroszkópiával (8453 értékrendszerét; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). A koncentráció IR700 vagy IR800 külön mértük az abszorpciót 689 nm vagy 774 nm-spektroszkópia megerősíteni száma fluorofór molekulák konjugált monoklonális minden. A szintézist úgy szabályoztuk, hogy átlagosan négy IR700 molekulák és két IR800 molekulákat kötve egyetlen antitest. Végeztünk SDS-PAGE, mint a minőség-ellenőrzés minden egyes konjugátum korábban jeleztük [19]. Úgy rövidítjük IR700 konjugált trastuzumab tra-IR700, hogy panitumumab pán-IR700 és IR800 konjugált trastuzumab tra-IR800. Katalógusa}

Sejtkultúra katalógusa

N87-GFP sejtek stabilan expresszáló GFP vásároltunk anti Rák (San Diego, CA, USA). Nagy GFP expresszió is megerősítették hiányában a szelekciós ágens, 10 részeket. Hogy értékelje specifikus sejt leölése által PIT, 3T3 sejtek stabilan expresszáló DsRed (3T3 /DsRed) használtunk negatív kontrollként. [5] A sejteket RPMI 1640-ben (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal és 1% penicillin /sztreptomicint (Life Technologies) szövettenyésztő lombikokban, nedvesített inkubátorban 37 ° C-on atmoszférában 95 % levegőt és 5% szén-dioxidban.

fluoreszcens mikroszkópia

detektálásához az antigén-specifikus lokalizációja IR700 konjugátumok és a változás a sejtek morfológiai után PIT, fluoreszcens mikroszkópia végeztünk (IX61 vagy IX81; Olympus America, Melville, NY, USA). Tízezer sejteket oltottunk fedél-üveg fenekű edények, és inkubáltuk 24 órán át. TRA-IR700 adtunk a tápközeghez (fenol vörös mentes) 10 ng /ml, és inkubáljuk 37 ° C-on 6 óra hosszat keverjük. A sejteket ezután PBS-sel mostuk; Propidium-jodid (PI) (1:2000) vagy Cytox Blue (1:500) (Life Technologies) adtunk, hogy a média előtt 30 perccel PIT kimutatására elhalt sejteket. A sejteket ezután kitettük NIR fény és a soros képeket kaptunk. Egy nap után PIT, a sejteket mostuk és inkubáltuk új médium után PIT (0,5 J /cm ^{2), és a PI-t ismét hozzá. Annak érdekében, hogy az ugyanahhoz a régióhoz leképezett jegyekkel történt az egyes Petri-csészére, hogy jelezze, ha a képalkotó szerezték. A szűrőt állítva kimutatására IR700 fluoreszcencia egy 590-650 nm gerjesztési szűrő, és egy 665-740 nm-es sáváteresztő emissziós szűrő. A képek elemzése végeztük ImageJ szoftver (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Katalógusa}

Flow citometria katalógusa

A fluoreszcencia a sejtekből történő inkubáció után pán-IR700 vagy TRA-IR700 mértük áramlási citométerrel (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) és CellQuest szoftvert (BD Biosciences). A sejteket (1 × 10 ^{5) inkubáltunk mindegyik konjugátum 6 órán át 37 ° C-on. Hogy érvényesítse a specifikus kötődését a konjugált antitest, a felesleges ellenanyagot (50 ng) alkalmaztunk, hogy blokkolja a 0,5 ng festék-antitest konjugátumok [8].}

In vitro PIT

Száz ezer sejt oltottunk 24 lyukú lemezekre, és inkubáltuk 24 órán át. Táptalajok helyettesítettük friss tápközegen, amely 10 ug /ml TRA-IR700 és a sejteket 6 órán át 37 ° C-on. Mosás után PBS-sel, fenolvörös-mentes táptalajt adunk hozzá. Ezután a sejteket besugároztuk NIR lézerfény 685-695 nm hullámhossz (BWF5-690-8-600-0.37; B & W TEK INC., Newark, DE, USA). A tényleges teljesítmény sűrűségét mW /cm ^{2 mértük az optikai teljesítmény mérő (PM 100, THORLABS, Newton, NJ, USA). Katalógusa}

citotoxicitási assay katalógusa

A citotoxikus hatásai PIT TRA-IR700 határoztuk meg áramlási citometriás PI festés, amely érzékeli beszűkült sejtmembránon. Az áramlási citometriás vizsgálathoz a sejteket tripszinnel kezeltük 1 órán kezelés után, és PBS-sel mostuk. PI-t adtunk a sejtszuszpenzióhoz (végső 2 ng /ml), és szobahőmérsékleten inkubáltuk 30 percig, majd áramlási citometriával.

becslése GFP fluoreszcencia intenzitás in vitro

Egy százezer sejteket oltottunk fedél-üveg fenekű edények, és inkubáltuk 12 órán át. TRA-IR700 adtunk a tápközeghez (fenol vörös mentes) 10 ng /ml, és inkubáljuk 37 ° C-on 6 óra hosszat keverjük. A sejteket PBS-sel mostuk, és helyére egy új, fenolvörös-mentes tápközegben, és a alatt oldalán a fedél üveg volt jelölve (helyzetének meghatározására a megfigyelés). Miután PIT, a sejteket ismét inkubáljuk 1 napon át. Egy nap után PIT, a sejteket ismét megfigyelhető. A GFP intenzitást értékeltük teljes pixel ugyanazzal küszöb az azonos területen [20]. Elemzés a képek végeztük ImageJ szoftver (http://rsb.info.nih.gov/ij/).

fluoreszcenciát kezelt sejtek is mértük áramlási citométerrel (FACS Calibur).

Állat és tumor modellekben katalógusa

Minden in vivo katalógusa eljárásokat végeztek megfelel az útmutató a Care and Use of Laboratory Animal Resources (1996), az Egyesült Államok Nemzeti Kutatási Tanács és a által jóváhagyott NIH Animal Care and Use Committee. Hat-nyolc hetes nőstény homozigóta csecsemőmirigy nélküli csupasz egereket szereztünk be a Charles River (NCI-Frederick). Annak érdekében, hogy értékelni csak a közvetlen tumorsejt ölő hatása az in vivo katalógusa PIT, immunitású csupasz egereket használtunk. Az eljárások során az egereket elaltattuk izoflurán. Tíz millió N87-GFP sejtet injektáltunk szubkután a jobb dorsum az egerek. Annak meghatározása érdekében, a tumor térfogatát, a legnagyobb hosszanti átmérő (hosszúság), és a legnagyobb keresztirányú átmérő (szélesség) mértük egy külső tolómércével. A tumorok térfogatát alapul kaliper mérések számoltuk a következő képlettel; tumor térfogata = hossz x szélesség ^{2 × 0.5. Daganatok a körülbelül 100 mm 3 térfogat választottak ki a vizsgálat. Mérésére GFP fluoreszcencia után PIT, tízmillió N87-GFP sejtet szubkután injektált mind hátizomhoz az egerek. A disszeminált peritoneális rák egérmodellben ötvenmillió N87-GFP sejtek PBS-sel (összesen 300 pl) injektáltuk a hasüregbe.}

In vivo fluoreszcencia képalkotó

in vivo
fluoreszcencia képek kaptunk gyöngy Imager (LI-COR Bioscience) detektálására IR700 /IR800 fluoreszcencia, és egy Maestro Imager (CRI, Woburn, MA, USA) a GFP. GFP, a sávszűrő 445-490 nm (gerjesztés) és egy hosszú-pass kék szűrőt 515 nm (emisszió) használtunk. A hangolható emissziós szűrőt automatikusan belépett 10 nm lépésekben 500-600 nm-en a zöld szűrő készlet állandó expozíció (500 ms). A spektrális fluoreszcencia képek állnak autofluoreszcencia spektrumok és a Spectra származó GFP-t (N87-GFP tumor), amelyeket aztán nem kevert, amely a jellegzetes spektrális mintázatát GFP, a Maestro szoftver (CRI). Region of interest (ROI) manuálisan elkészíteni akár a lágyék tumor vagy az alhasi régió, az adott modell és a fluoreszcencia intenzitását mértük. [19] katalógusa

jellemzése terjesztett peritoneális egér modellben katalógusa

Mice akár disszeminált peritoneális rák (6 hét után sejt implantáció) vagy lágyéki tumorok (aT után 7 nappal sejt implantáció) intravénásán 100 ug TRA-IR700 és TRA-IR800. Egy nap az injekció után, a soros képek végeztük gyöngy Imager kimutatására IR700 /IR800 fluoreszcencia, és a Maestro a GFP-t. Fehér fény képek a egereket egy iphone5 (Apple Inc., Cupertino, CA, USA). Katalógusa

In vivo PIT katalógusa

Annak érdekében, hogy értékelje a hatása PIT oldalról modell , N87-GFP tumort hordozó egereket véletlenszerűen 4 csoportra legalább 10 állat per csoport a következők szerint: (1) nincs kezelés (kontroll); (2) csak a NIR fénykezelés 50 J /cm ^{2 az 1. napon és 100 J /cm 2 a 2. napon; (3) 100 ug tra-IR700 intravénás, nem NIR megvilágítás; (4) 100 ug tra-IR700 intravénás, NIR fény adtuk 50 J /cm 2 1. napon injekció után, 100 J /cm 2 a 2. napon az injekció beadása után. Ezeket a körülményeket alkalmaztuk minden héten, legfeljebb 3 hétig. Az egereket naponta ellenőrizzük, és a fluoreszcencia képek kaptuk kezdődő előtt 1 nappal PIT, és a tumor térfogatát mértük hetente háromszor, amíg a daganat átmérője elérte a 2 cm-es, mire az egereket leöltük szén-dioxiddal. A fluoreszcencia képalkotás, egereket 100 ug TRA-IR700 vagy besugárzott a következők szerint: (1) NIR fény adagoltuk 50 J /cm 2 az 1. napon az injekció beadása után, és a 100 J /cm 2 on 2. napon a jobb tumor (2) nem NIR fény adtuk be a bal oldali tumor arra szolgált, mint a kontroll. A kontrollok között (1) csak NIR fénykezelés 50 J /cm 2 az 1. napon és 100 J /cm 2 a 2. napon a jobb tumor; (2) nincs kezelés a bal tumor.}

kiértékelésére disszeminált peritoneális rák, egereket véletlenszerűen 4 csoportra 5 állat csoportonként az alábbi kezelések: (1) nincs kezelés (kontroll); (2) csak a NIR fénykezelés 50 J /cm ^{2 az 1. napon és 100 J /cm 2 a 2. napon; (3) 100 ug tra-IR700 intravénás, nem NIR megvilágítás; (4) 100 ug tra-IR700 iv, NIR fény adtuk 50 J /cm 2 az 1. napon és 100 J /cm 2 a 2. napon az injekció beadása után. Katalógusa}

Statisztikai elemzés

az adatokat átlag ± sEM minimum négy kísérlet, hacsak másképpen nem jelezzük. A statisztikai elemzéseket végeztünk egy statisztikai programot (GraphPad Prism, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Többszörös összehasonlítások, egy egyirányú varianciaanalízis (ANOVA) post teszt (Kruskal-Wallis teszt utáni teszt) és Tukey-féle tesztet alkalmaztunk. A kumulatív túlélési valószínűség, itt meghatározott, mint a tumor átmérője nem éri 2 cm, a becslések minden csoportban a használata a Kaplan-Meier túlélési görbe elemzése, és az eredményeket összehasonlítottuk a log-rank teszt és Wilcoxon teszt. Student t katalógusa tesztet is használják összehasonlítani a két in vitro katalógusa vizsgálat; p < 0,05 volt hivatva jelezni, statisztikailag szignifikáns különbség. katalógusa

Eredmények katalógusa

visszaigazolása expressziós profiljának N87-GFP sejtek célpontjaként PIT katalógusa

Megvizsgáltuk a fluoreszcens jeleket a pán-IR700 és tra-IR700 kötődik N87-GFP sejtek FACS. 6 órás inkubáció vagy pán-IR700 vagy tra-IR700, N87-GFP sejtek következetesen azt mutatták, nagyobb fényerő TRA-IR700 mint pán-IR700 (1A.). Ezek a jelek szinte teljesen blokkolta a feleslegének hozzáadásával trastuzumab vagy panitumumab, ami arra utal specifikus kötődés, és megerősítve a magasabb expressziós HER2 mint EGFR [21]. Ezek az adatok azt javasolta, hogy a HER2 volt az előnyös cél PIT N87-GFP sejtek miatt magasabb kifejezést. Katalógusa

Mikroszkóp in vitro szja katalógusa

Serial fluoreszcens mikroszkópos N87-GFP sejtek előtt történt és miután PIT. A besugárzás után a NIR fény (2 J /cm ^{2) cellás duzzanat, légbuborék képződés és törés a lizoszóma észleltek, ami a sajtolt citoplazma extracellulárisan (ábra. 1B). PI festés kimutatta akut citotoxikus membrán által okozott PIT. A legtöbb ilyen celluláris változásokat észleltünk 30 percen belül a fény expozíció (alátámasztó információk videó S1 és S2). Nincs jelentős változás volt kimutatható EGFR-negatív 3T3 sejteket besugárzott NIR fény, ami arra utal, PIT indukált semmilyen sérülés nem célsejtek (ábra. S1).}

Az in vitro PIT hatás

Annak érdekében, hogy mennyiségileg a hatás in vitro
PIT, végeztünk egy citotoxicitási vizsgálattal alapuló beépítése PI, ami bizonyította, hogy a sejthalál növekedésével emelkedett fénydózis (ábra. 1C). Nem jelentős citotoxikus mutattuk NIR fényhatás vagy tra-IR700 egyedül. Katalógusa

Szervíz GFP fluoreszcencia in vitro után PIT katalógusa

Egy nap az expozíció után a NIR fényében 0,5 J /cm ^{2, körülbelül 50% -a sejtek mutattak akut citotoxicitást (ábra. 1C), és a GFP fluoreszcencia intenzitást jelentősen csökkentette a holt sejtek (foltos pozitív PI), míg a GFP fluoreszcenciát tartósított túlélő sejteket (ábra. 1D). Ezek a tanulmányok azt sugallják, hogy a GFP extrudáltuk a sejtből után membrán szakadás. Annak érdekében, hogy vizsgálja meg a változás GFP fluoreszcencia, összehasonlítottuk a teljes GFP pixel az azonos területen előtt és után egy nappal PIT (ábra. S2). A GFP fluoreszcencia aránya csökkent közvetlenül fénydózissal, miközben nem csökken mutattuk NIR fényhatás vagy tra-IR700 egyedül (ábra. 1E). Ezeket az eredményeket megerősítették FACS analízis (ábra. 1F és ábra. S3), és arra utalnak, hogy PIT csökkenéséhez vezet a GFP fluoreszcencia következő nekrotikus sejt halál utáni 1 nap PIT módon függ a fény dózist.}

in vivo PIT csökkenti a daganat térfogata oldalba xenograftmodellben katalógusa

Ezután megvizsgáltuk a hatását PIT in vivo katalógusa a szárnyon tumoros egerek (2A.). PIT indukált jelentős csökkentést tumor térfogat (n = 10 minden csoportban, * p = 0,0456 < 0,05, Tukey-féle teszt). Négy egerek tízből szja csoport teljesen gyógyítható a kezelés (ábra. 2B). A túlélést jelentősen megnyúlt az SZJA csoportban, mint a kontroll csoportban (n = 10 minden csoportban, ** p < 0,0001, hosszú-rank teszt és Wilcoxon teszt) (ábra. 2C). Ezek az adatok arra utalnak, hogy PIT okozott jelentős tumor csökkentése és a hosszabb túlélés in vivo katalógusa.

GFP fluoreszcencia képalkotás után In vivo PIT oldalról xenograftmodellben katalógusa

Annak érdekében, hogy nyomon in vivo
PIT, a valós idejű GFP képalkotás végeztünk egerekben N87-GFP-kétoldalú szárnyon daganatok (3A.). GFP fluoreszcencia igazolták tumor terhet és a válasz PIT. GFP fluoreszcencia korrelált IR700 fluoreszcencia, mely gyorsan csökkent, miután PIT (3C.). Összesen fluoreszcencia képalkotás (TFI) a GFP kezeletlen tumorok (kontroll) és a daganatokban fogadó fény csak miatt nőtt a tumor növekedését. A tumorokban kezelt PIT, TFI GFP fokozatosan csökkent a kezelt daganat, míg az ellenkező tumor ugyanazon egér (csak IV esetén, nincs fény) mutatott megnövekedett GFP fluoreszcencia (ábra. 3B).

számszerűsítése teljes GFP fluoreszcencia intenzitás kiderült, hogy nem volt szignifikáns csökkenés után PIT (n = 5 egér minden csoportban, * p = 0,0118 < 0,05, ** p = 0,0010 < 0,01; *** p = 0,0049 < 0,01, Tukey-féle teszt ANOVA) (3C.). Mivel a tumor újra növekedést, a GFP aránya emelkedett ismét a 4. naptól után PIT, bár alacsonyabb volt, mint a többi kontroll csoportban. A valós idejű GFP fluoreszcencia képalkotás és számszerűsítése engedélyezve valós idejű összehasonlítás a csoportok és a mutatott erős korrelációt magasabb GFP fluoreszcencia és a tumor progresszióját az egyes csoportokban. Katalógusa

-t ebben az értelemben a ex vivo
analízist (4A.). A PIT hatás megerősítették a csökkenés IR700 fluoreszcencia (ábra. 4B). Ilyen feltételek mellett a GFP intenzitása ex vivo katalógusa daganatok száma csökkent, miután PIT (ábra. 4B). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a valós idejű GFP élő képalkotó összhangban van ex vivo katalógusa képalkotás.

Amikor PIT megismételjük heti GFP fluoreszcencia aktivitást végül eltűnt (ábra. 4C és D), jelezve a teljes megöli a tumor. katalógusa

jellemzése terjesztett peritoneális modell fluoreszcens képalkotó katalógusa

Annak érdekében, hogy meghatározzák a természettudományi, a disszeminált peritoneális modell, soros fluoreszcens képalkotó végeztünk. A beültetett tumorok bizonyította magas fluoreszcencia jel IR700, IR800, és GFP, amelyek mindegyike közösen lokalizált egymással (IR800-t használjuk, hogy elkerüljük a bél autofluoreszcencia) (ábra. 5). Ezek az adatok arra utalnak, hogy ez a modell a disszeminált hasnyálmirigyrák követhető az élő egereken végzett GFP fluoreszcencia. Katalógusa

GFP fluoreszcencia képalkotás után In vivo PIT terjeszteni peritoneális modell katalógusa

Valós idejű GFP fluoreszcencia képalkotás volt fellépett a disszeminált peritoneális modell előtt és után PIT (ábra. 6a). IR700 fluoreszcencia csökkent, miután PIT (ábra. S4). GFP TFI fokozatosan nőtt a nem-PIT csoportok miatt a tumor növekedését. A PIT kezelt csoportban GFP TFI csökkent 1 nap és 3 nap után PIT (6B.). Számszerűsítése teljes GFP fluoreszcencia intenzitás mutatott szignifikáns csökkenés után PIT (n = 5 egér minden csoportban, * p = 0,0295 < 0,05, ** p = 0,0355 < 0,05, Kruskal-Wallis-teszt utáni teszt) (ábra. 6C). Mivel a tumor újra növekedési, a GFP aránya emelkedett ismét a 4 nap után PIT, bár fenntartotta alacsonyabb, mint más csoportok, mint ahogyan azt a szárnyat tumor modellben. Így PIT okozott jelentős célzott tumor ölő hatása mind a lágyék és terjeszteni peritoneális tumor modell, és ez lehetett ellenőrizni GFP TFI. Katalógusa

Vita katalógusa

A vizsgálat azt mutatta, hogy a hatás a PIT lehet ellenőrizni GFP fluoreszcencia képalkotás. Ellentétben az apoptózist [12], [13], amelyben GFP és a kapcsolódó fluoreszcens fehérjék világosabbá válnak a csökkenő citoplazmatikus térfogat alatt nekrotikus sejthalált PIT, membrán károsodásra, majd engedje el a citoplazma tartalmát, beleértve a GFP-t. Ez az egyedülálló jellemzője GFP és a kapcsolódó fluoreszcens fehérje teszi őket hasznos biomarkerek PIT. Katalógusa

In vivo katalógusa GFP fluoreszcencia képalkotás lehetővé teszi a teljes folyamat tumorigenezis, kezelés, regressziós, metasztázis, vagy kiújulás, hogy kimutatható az azonos állati nélkül invazív eljárások [10], [11]. Alkalmazásával expresszáló sejtek citoplazma GFP, a tumorellenes hatások által indukált PIT lehetne könnyen nyomon miatt extrudálása GFP kezelt sejtekben.

A koncepció a célzott fényterápia több mint három évtizede régi [22]. Mivel a hidrofób jelleg a hagyományos fotodinámiás terápia (PDT) érzékenyítő, farmakokinetikáját antitest konjugált PDT-ágensek erősen korlátozott, hogy képes konjugátumok a cél. Ezért PDT érzékenyítő célzott antitestekkel még csak sikeres modellek, ahol a konjugátumot injektálunk közvetlenül a tumorba, vagy hashártya [23]. Annak érdekében, hogy egy antitest-fényérzékenyítő konjugátumot (APSC) szisztémásán, a fotoszenzitív kell preferenciálisan hidrofil. A hidrofil ftalocianin alapú fényérzékenyítő, IR700DX amikor konjugált ellenanyag válik egy APC beadható intravénásán. Ez a forma a terápia nevezett PIT, különbözik a hagyományos PDT nem csak a hidrofilitása a fényérzékenyítő, hanem a támaszkodás NIR fény, hogy aktiválja a fényérzékenyítő. NIR fény jobb szöveti penetráció, mint az alacsonyabb hullámhosszúságú fényt használnak PDT. Ez az új generációs APC-k demonstrálja hasonló intravénás farmakokinetikája a meztelen antitestek, így a célzott tumor felhalmozódás minimális nem célzott kötelező érvényű, és lehet alkalmazni, hogy egy antitestek széles spektrumával, amely lehetővé teszi sok lehetséges alkalmazás az egész szervezetben.

Annak ellenére, citotoxikus kemoterápia, az eredmény az előrehaladott stádiumban gyomorrák továbbra is gyenge. Mivel a betegek többsége peritoneális áttétek jelen alattomos tünetek, mint étvágytalanság, fogyás, puffadás érzés, fájdalom vagy anémia diagnózis gyakran késik, és a helyi kezelések már nem valósítható meg [24]. Gödör egy ígéretes kezelési eljárást disszeminált peritoneális rák. Annak érdekében, hogy végre hatékony PIT, a APSC kell szállítani a szervezetben és a fényt célzottan kell alkalmazni a hashártya. Ilyen körülmények között elegendő szállítási APSCs eredményezi csökkenését disszeminált tumorok után gödörbe. Ezt a folyamatot követhetjük valós időben in vivo katalógusa GFP fluoreszcencia képalkotás. Katalógusa

Van számos korlátja ennek a tanulmánynak. Meg kell jegyezni, hogy nem minden gyomor rák kifejezni HER2, és ezért, a TRA-IR700 nem lehet egységesen hatásosak disszeminált gyomorrák. Valóban, szükség lehet használni egy koktél APSCs hatékonyan fedezze a legtöbb expressziós profilok egy adott tumor [25]. Egy másik kikötés ebben a vizsgálatban, hogy fényt lehetne beadni transzkután kis egerekben, de ez nem lehetséges az emberekben. Annak érdekében, hogy hatékonyan emberek kezelésére PIT, akkor szükséges alkalmazni fény laparoszkópos hogy megakadályozzák felszívódását a bőrön. További korlát, hogy a modell csak akkor kerül kiértékelésre legyengült immunrendszerű egerek. Az immunológiai reakció szja fogják értékelni a jövőben immunrendszerű egerek. Végül, a közeljövőben GFP fluoreszcencia képalkotó korlátozott lesz Állatkísérletekben, mivel nem igényel transzfekciója a tumor egy endogén fehérje. Mindazonáltal ez egy hasznos leolvasás preklinikai vizsgálatok. Katalógusa

Következtetések katalógusa

PIT ellen hatékony a HER2-pozitív gyomorrák peritoneális carcinomatosis egér modellben és GFP fluoreszcencia képalkotó ellenőrzést lehetővé teszi a PIT hatásokat.

alátámasztó információk
ábra S1.
egyedi célzott nekrotikus sejthalált figyeltünk után PIT in vitro.
N87-GFP-sejteket együtt tenyésztettünk 3T3 /DsRed (nem HER expresszáló) sejtekben. Kezeltük őket TRA-IR700 és a megfigyelt (besugárzás előtt és után a NIR fény). Célzott specifikus nekrotikus sejthalált volt megfigyelhető gerjesztés NIR fény (30 perc) után. Kárt nem bizonyították 3T3 /DsRed sejteket. * 3T3 /DsRed sejtek, bár = 25 nm. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0113276.s001 katalógusa (TIFF) hotelben ábra S2.
csökkenő GFP fluoreszcencia után 1 nappal PIT figyeltek in vitro.
Csökkenő GFP-fluoreszcencia intenzitását után 1 nappal PIT volt megfigyelhető, hogy olyan módon függ a fény adagot. Bár = 100 jim. A fekete vonal szélén volt a marker pozíciójának meghatározására a megfigyelés. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0113276.s002 katalógusa (TIFF) hotelben ábra S3.
Csökkenti a GFP-fluoreszcencia után 1 nappal PIT értékelte áramlási citometriával. Csökkenő GFP-fluoreszcencia intenzitását utáni 1 nap PIT volt olyan módon függ a fénydózis áramlásos citometriás analízissel.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0113276.s003 katalógusa (TIFF) katalógusa ábra S4.
In vivo katalógusa fluoreszcencia képalkotó válaszul megismételte PIT peritoneális terjesztett egérmodellben. In vivo katalógusa fluoreszcencia képalkotó válaszul ismételt PIT. IR700 fluoreszcencia csökkent válaszul szja. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0113276.s004 katalógusa (TIFF) hotelben Videó S1.
Time-lapse DIC képek egy N87-GFP sejt által kezelt PIT. Időzített szekvenciális DIC képek (videó) egy N87-GFP sejt mutat morfológiai változások a sejt után NIR fény besugárzás-val kezelt sejtekben a TRA-IR700 (25 percig megfigyelés összesen). Villogó fény NIR fény besugárzás (2 J /cm ^{2). Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0113276.s005 katalógusa (AVI) hotelben Videó S2.
Time-lapse PI fluoreszcencia képek egy N87-GFP sejt által kezelt PIT. Időzített szekvenciális PI fluoreszcenciát képek (videó) azt mutatja, gyors membrán károsodása egy N87-GFP sejt után NIR fény besugárzás-val kezelt sejtekben a TRA-IR700 (25 percig megfigyelés összesen). Villogó fény NIR fény besugárzás (2 J /cm 2). Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0113276.s006 katalógusa (AVI) hotelben}

Köszönetnyilvánítás katalógusa

Ez a kutatás által támogatott Intramural Research Program a National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research. Kazuhide Sato támogatja JSPS Kutatási Ösztöndíj japán Biomedical and Behavioral kutatói NIH. Katalógusa

• PLoS One: MED30 Szabályozza a és -motilitást gyomorrák Cells
• PLoS One: Összehasonlító proteomikai analízise Gyomorrák Stem Cells