PLoS ONE: Down-regulacija Claudin-18 je povezana s proliferativni i invazivni potencijal rak želuca na invazivne Front

Sažetak pregled

Pozadina pregled

Claudins su poznati kao čvrsti spoj proteina, i njihove ekspresije u karcinomu želuca još kontroverzna. Odnos između ekspresije obrazaca čvrsti spoj proteina i proliferacije tumora u ranom stadiju raka želuca je još uvijek daleko od jasno. Pregled

Ciljevi

Kako istražiti izraz uzoraka iz claudin-18 i Ki-67 u rani rak želuca na invazivne sprijeda i okolnim normalno sluznice želuca i istražiti biološku funkciju claudin-18 u proliferaciji i invazije stanica raka.

metode

sedamdeset i pet ranog raka želuca Procijenjeni su lezije uklonjeni pomoću endoskopske resekcije sluznice ili endoskopske submukozne resekcije. Sva oštećenja probavnog raka su dijagnosticirana kao diferencirani adenokarcinom pomoću japanske klasifikaciju karcinom želuca. Procijeniti epitela proliferaciju imunobojanje Ki-67 je izveden, i izračunata je indeks obilježavanja. Da bi se procijenio izraz epitelnih čvrsti spoj proteina, imunofluorescentni bojenje claudin-18 je izvedena. Imunoreaktivnost claudin-18 ocjenjuju prema broju obojenih stanica. korelacijska analiza provedena je koeficijent rang korelacije Spearmanov. Transformacija claudin-18 malih ometa RNA (siRNA) ostvaren je u MKN74, želučani karcinom stanične linije claudin-18-pozitivni, istražiti učinak claudin-18 na proliferaciju i invazije stanica raka. Pregled

Results pregled

Claudin-18 bio je značajno dolje regulirano karcinoma želuca u odnosu na okolne želučane normalnoj sluznici ili intestinalne metaplazije. Ki-67 indeks označavanje karcinoma želuca u invazivnom ispred obrnuto je korelaciji s razinom claudin-18, ali da je na sluznice lezije nisu u korelaciji. Claudin-18 obaranje značajno unaprijeđen proliferaciju MKN74 u usporedbi s kontrolnim siRNA-transfektiranim stanicama. MKN74 invazija značajno povećan claudin-18 siRNA transfekciju u usporedbi s kontrolnim siRNA transfekcije. Pregled

Zaključci

Podreguliranje claudin-18 je povezana s proliferativni potencijal kod invazivnog ispred raka želuca, sugerirajući da ima ključnu ulogu u želučanom progresiju raka pregled

Izvor. Oshima T, Shan J, Okugawa T, Chen X, Hori K, Tomita T, et al. (2013) Down-regulacija Claudin-18 je povezana s proliferativni i invazivni potencijal rak želuca na invazivne frontu. PLoS ONE 8 (9): e74757. doi: 10,1371 /journal.pone.0074757 pregled

Urednik: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Sjedinjene Američke Države pregled

Primljeno: 28. svibnja 2013; Prihvaćeno: 6. kolovoz 2013; Objavljeno: 20. rujna 2013 pregled

Copyright: © 2013 Oshima et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane Ministarstva obrazovanja, kulture, športa, znanosti i tehnologije Japana kroz dodjeljivanje pomoći za znanstvena istraživanja (C) 2010-2012 (br 22590691). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca (GC) je četvrti najčešće dijagnosticirana maligna bolest, a drugi najčešći uzrok smrtnosti od raka povezanih svijetu [1], [2]. Intramucosal GC može biti ljekovito liječiti endoskopskog liječenja. Osim toga, tehnika endoskopski submukozna disekcija (ESD) je proširio indikacije za endoskopskog liječenja i omogućio hr bloka resekcija intramucosal velike i malo submukozalnim invazivni rano GCS [3]. En bloka resekcija od ESD omogućuje preciznu dijagnozu dubini od raka [4]. Pregled

čvrstih veza (TJS) su specijalizirani membranske domene na većini apikalni regiji polarizirane epitelnim i endotelnim stanicama [5]. Claudins su glavni TJ proteina; se sastoje od barem 27 proteina država i izraženi su na način tkivno specifični [6], [7]. Oni reguliraju propusnost paracellular i uspostaviti epitelnih stanica polaritet po svojoj ograde funkcijom [6], [8]. Sve veći broj noviji dokazi sugeriraju claudins su ključne strukturne i funkcionalne komponente TJ nitima [6], [9], i oni mogu igrati ključnu ulogu u nastanku tumora i upale [10], [11]. Pregled

želučana epitel pokazuje niz promjena u claudin izražavanja od normalne sluznice do intestinalne metaplazije i adenokarcinoma. Iako GCS je nedavno klasificiran od strane mucin se temelji na izrazu [12], [13], A claudin bazi GC klasifikacija je također bio predložen [14]. Također smo izvijestili da je down-regulacija claudin-3 bio je povezan s proliferacijom intramucosal GC [15]. Nedavno, claudin-18 knock out miševi su pokazali da imaju želučane sluznice atrofije i paracellular H ^{+ ion propuštanje [16]. Claudin-18a2 pokazalo se da je često dolje regulirano GC od crijevne fenotipa, sugerirajući da claudin-18a2 će biti dobar marker za GC [17]. Međutim, biološka funkcija claudin-18, što bi moglo biti uključeni u ponašanju stanica raka, nikad nije bio ispitan. Osim toga, nije jasno koji karakteristika GC stanicama na invazivne prednje odnosi se na brzi rast, agresivnost invazije. Pregled}

U ovom istraživanju, što je razina ekspresija claudin-18 u GC na invazivne sprijeda i okolne želučane sluznice ispitan je po prvi put, a korelacija između razine claudin-18 i Ki-67 indeks označavanje (LI) u GC procijenjena. Učinak claudin-18 na proliferaciju i invazivnosti In vitro pregled je također ispitan. Pregled

Materijali i metode

Pacijenti

uzastopni niz od 74 pacijenata s početkom GC su proučavali (tablica 1). Procijenjeni su GC lezije (n = 75) koji su prošli kroz ljekovito EMR ili OOR. GCS s submukozne invazije (n = 31) su uključene u ovu studiju. Dvostruke raka su otkrivene u samo jednom pacijenta. Sve GC su klasificirani kao diferencirani adenokarcinom uz pomoć japanske klasifikaciju karcinom želuca [18]. Pacijent anonimnost je očuvana. Ova studija je provedena u skladu sa deklaracijom Helsinkija i odobren od strane Etičkog povjerenstva /Institutional Review Board of Hyogo College of Medicine. Predmet dala pisani pristanak. Pregled

Imunohistokem pregled

Uzorci su fiksirani s 10% -tnom formalinu i uklopljene u parafin. Rezovi 3 um debljine, a obojeni su hematoksilinom i eozinom (Nj). Procijeniti epitela proliferaciju, uzorci su inkubirani s Ki-67 monoklonskih antitijela (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), nakon čega slijedi inkubacija sa biotiniliranim konjski anti-mišjim sekundarnim antitijelom (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Streptavidin-biotin kompleks metoda (Vector Laboratories) je korišten za vizualizaciju imunoreaktivnost. Jezgre su prebrojane s hematoksilinom. Pregled

imunofluoroscentih spojnog proteini

zec anti-claudin-18 poliklonskim protutijelom (Invitrogen) i Cy3-kozjim anti-zečji IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove , PA, USA) sekundarno antitijelo upotrijebljeni su za vizualizaciju imunoreaktivnost. Specifičnost reakcije testirana inkubiranjem s neimunim zečjim serumom (Dako, Glostrup, Danska). Pregled

bodovanje imunološko Claudin-18 i Ki-67 pregled

Imunoreaktivnost procijenjena dva neovisni promatrači (T.Ok., XC), a oboje su bili slijepi na kliničkopatološkim značajke i kliničkih ishoda povezanih sa svakom uzorku. Non neoplastični želučane sluznice bez intestinalne metaplazije (non-IM) i intestinalne metaplazije (IM) i regija raka su određeni. Imunoreaktivnost claudin-18 bila je ocijenjena prema sljedećim kriterijima: 0, odsutnost membranskog bojanja; 1+, manje od 10% tumorskih stanica s potpunom membrane mrlja; 2+, 10% do 50% tumorskih stanica potpunom obojenje membrane; 3+, više od 50% do 75% tumorskih stanica s potpunom, jaka obojenje membrane; i 4+, više od 75% stanica s potpunom, vrlo jaka obojenost membrane. Pet polja visoke snage su analizirani u svakoj regiji slučajevima i izračunata je srednja ocjena. Sve Sekcije su dva puta kako pokazuju reproducibilnost rezultata. Ki-67 LI je izračunata nakon prebrojavanja 1000 stanica raka. Pregled

Mali ometa RNA (siRNA) obaranje Pokusi pregled

Za siRNA odsutnost ljudskog claudin-18, U-TARGET plus SMARTpool i koja nije specifičnih kontrola siRNA je kupljen od Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, USA). Stanična linija MKN74 (japanski Zbirka istraživanja Bioresources Cell Bank, Osaka, Japan), što je CLDN18 pregled pozitivne, izabran je za proučavanje učinaka claudin-18 obaranje na proliferaciju i invazije svojstva GC stanicama , Stanice su transficirane s 25 nM siRNA koristeći DharmaFECTTM3 (Dharmacon, Inc.). Kontrole i kontrole siRNA su skupine tretirane sa reagensima transfekcije bez siRNA i reagenasa transfekcije s nespecifično kontrolne siRNA, respektivno. Testovi su provedeni 3 dana nakon MKN74 stanica bilo transfektirano. Pregled

stanične proliferacije pregled

proliferacija stanica određena je kolorimetrijski stanične vijabilnosti na temelju odcjepljenja tetrazolijeve soli WST-1 u odnosu na mitohondrijima dehidrogenaze (Takara Bio Inc., Otsu, Japan). Apsorbancija nastala boja formazana koji korelira s brojem metabolički aktivne stanice u kulturi, izmjerena je na 450 nm, 1 h nakon dodavanja reagensa. Pregled

Test invazije pregled

invazije stanica MKN74 ispitano je u 24-jažičnim Biocoat Matrigelove invazije komore (8 um; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) prema protokolu proizvođača. Donje komore bile ispunjene RPMI1640 s 10% FBS, a stanice (2 x 10 ^{5) su smješteni u komore za umetanje, koji su sadržavali RPMI1640 bez FBS. Nakon 24 sata inkubacije, neinvazivna stanice su uklonjene pamučnom krpom. Stanice koje su migrirale kroz membranu i zaglavi na donje površine membrane, su fiksirane s 10% formalinu i obojeni hematoksilinom. Za kvantifikaciju, stanice su izbrojene pod mikroskopom u pet slučajnih polja visoke snage. Testovi su izvedeni u triplikatu. Izračunat je omjer invazija za kontrolu medija. pregled}

Statistička analiza pregled

Statistička procjena je provedena korištenjem SPSS13.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). korelacijska analiza provedena je Kopljanik rang korelacije koeficijent (RS). Višestruke usporedbe su izvedene primjenom Kruskal-Wallis potom Scheffeov testom. Pojedinačne usporedbe su izvedene primjenom Mann-Whitney testom. P pregled. ≪ 0.05 je smatrana značajnom pregled

Rezultati

Izražavanje Claudin-18 u sluznici želuca i karcinom pregled

Ukupno 75 diferenciranih GC slučajevima su analizirani u ovoj studiji. Sekcije su označene s claudin-18, a razina bojenja je ocijenjena. Claudin-18 je otkriven u visokim razinama u želučanog epitela na vršku i bočnih granica u ne-IM, ali ne u IM ili diferenciranih stanica adenokarcinoma (Sl. 1). Razine claudin-18 bile su značajno niže u stanicama raka nego u ne-IM i IM, kao i znatno niža u IM u odnosu na ne-IM (Sl. 1b). Pregled

Detekcija Claudin-18 u GCS s submukozne invazija pregled

Reprezentativni slučajevima GC sa submukozne invazije pokazali da gusta claudin-18 bojenje je vidljivo na invazivne ispred stanice submukozna napao-karcinoma, i Ki-67 LI je nizak lezije (Sl. 2A ). U slučaju s niskom claudin-18 bojenja na invazivne ispred stanice submukozna napao raka, Ki-67 LI bio visoko na lezije (Sl. 2). Pregled

Korelacija razine Claudin-18 i K -67 LI pregled

Ki-67 LI GC u mukozi i submukozi se odredi postotak Ki-67-pozitivne jezgre. Da bi se odredila povezanost između Ki-67 LI i na razini claudin-18, korelacijska analiza je provedena. Razina ekspresije za sluznicu od claudin-18 nije značajno povezana s Ki-67 LI (rs = 0,07, P = pregled 0,60). S druge strane, submukozna claudin-18 razina ekspresije bila je značajno obrnutoj su korelaciji s submukozne Ki-67 Li (rs = -0,550, P pregled = 0,0010) (Sl. 2B). Pregled

Utjecaj claudin-18 siRNA na proliferaciju i invazija GC stanica pregled

stanična linija GC, MKN74, konstitutivno izrazio claudin-18, a razina mRNA od claudin-18 bila je značajno smanjen siRNA protiv claudin- 18 (Sl. 3A). Imunofluorescencija bojanje claudin-18 također je smanjen nakon transfekcije (sl. 3b). U claudin-18 podregulirani MKN74, rast stanica je bila značajno povećana (Sl. 4a), a invazija stanica značajno je povećana (Sl. 4B). Pregled

Rasprava pregled

promijenjena ekspresija od claudins na submukozalnim invazivna front može biti povezano s napredovanjem GC. Nedavne studije pokazuju da čak i malo submukozalnim invazivni GC bez limfnog i krvožilnog invazije, ESD može biti izvedivo kao ljekovito operacije [19]. Međutim, to još uvijek nije jasno što slučajevi lagano submukozalnim invazivni GC može pratiti bez daljnje operacije nakon OOR. U ovom istraživanju, nađeno je da postoji inverzna korelacija između razine claudin-18 i Ki-67 pozitivnosti na invazivne ispred submukozne invazivne GC, te claudin-18 regulirana GC invazija stanica i proliferacije. Ki-67 imunohistokemija je zamijeniti mitoze brojenje procjenu proliferacije tumorskih stanica. Studije su pokazale da Ki-67 u korelaciji sa nediferenciranih i metastatskih stanica u maligne bolesti [20]. U ovom istraživanju, samo EMZ /ESD-reseciran GC u kojima je indikacija ograničen na diferenciranim tipu GC proučavana. Stoga, ovi podaci pokazuju da je razina Ki-67 u invazivnom ispred je povezana s metastatskim stanicama u zloćudne bolesti, te da gubitak claudin-18 bio je jedan od biljega GC agresivnosti i može biti povezana s razvojem metastaza, što zahtijeva dodatna operacija nakon tretmana ESD pregled

Claudins su nenormalno regulirana u različitih malignih bolesti kao što su GC, hepatocelularni karcinom, karcinom žučnog trakta, karcinom dojke, karcinom bubrežnih stanica, te mezoteliom [15], [21] -. [ ,,,0],25]. Promjena claudins na raskrižjima je povezana s gubitkom zbijeno adhezije i polaritet u epitela. Gubitak polariteta je povezana s povećanom staničnom proliferacijom i epitela za mczcnhimnog tranziciji, a poremećaji u uskim razvodne kompleksa mijenjati interakcije stanica-stanica, koje se odnose na invaziju i metastaziranje [23], [26], [27]. U opservacijskih studija, smanjuje claudin-3 i -4 su iskazane u GC stanicama u invazivnom sprijeda i nađeno je da su u korelaciji s napredovanjem raka i metastaza [14]. Podreguliranje claudins također je objavljeno u drugim epitelnim tumorima, uključujući gubitak claudin-1 u karcinom dojke [28] i rak debelog crijeva [29], kao i gubitak claudin-7 karcinom dojke [30] i raka glave i vrata [31]. S obzirom na invaziju tumorskih stanica, smanjuje ekspresiju claudin-7 na invazivne ispred je utvrđeno da je u korelaciji s dubinom invazije i limfnog uključenost u karcinom pločastih stanica jednjaka [32]. Iako claudin-3 i claudin-7 izrazi bile su niže u submukozne invazivne ispred nego oštećenja sluznice u našem prethodnom istraživanju, claudin-3 i claudin-7 razina na invazivne ispred nisu bili povezani s Ki-67 LI [15]. S druge strane, claudin-18 invazivnog prednje obrnuto je korelaciji s Ki-67, LI u ovom istraživanju. Ti podaci mogu biti povezane s nalazima koji claudin-3 i claudin-4 nisu vezane za limfnih čvorova metastaze [33]. Nadalje, ovi opservacijskih studija ne može objasniti da li su te promjene izravno utječu na tumorske invazije i metastaziranja. Pregled

Claudin-18 uglavnom se izražava u želucu i epitelnih stanica pluća. Claudin-18a2 je forma za želudac, a izoformi su malo drugačiji. U prethodnom izvješću, želuca tipa claudin-18 je izgubio u GCS [17]. Međutim, u intestinalne metaplazije je ekspresije claudins već se razlikuje od uobičajenih želučanih epitela. Nestanak claudin-18 nađeno je da je povezan s intestinalne metaplazije u želucu [17]. Dakle, gubitak claudin-18 ekspresije u naprednoj GC [17] može se jednostavno ne pokazuju karakter raka. I u procesu GC napredovanja, razina ekspresije može se promijeniti. Kako bi istražili funkciju ovih ciljnih molekula, mislili smo da je važno ispitati tumora na istoj pozornici, a mi smo ocijenili razinu claudin-18, koji bi mogli utjecati na invaziju i metastaziranje, u ponešto submukozalnim invazivnih GC lezije. Nadalje, želučane sluznice claudin-18 ne može raditi samo na TJ, jer se izražava lokalizacija na površini stanice nije samo na TJ. Daljnja istraživanja su potrebna za ispitivanje fizioloških i patofizioloških TJ proteina izraze na bočnoj membrane. Pregled

Kako bi se ispitala jesu li promjene u claudin-18 razina u submukozne invazivne ispred pridonijeli širenju i invazije stanica raka, siRNA pristup korišten je za obaranje proteina u staničnoj liniji MKN74 GC, koji je pozitivan na claudin-18. Dakle, ova studija je pokazala po prvi put na funkciju claudin-18 u GC uz gensku pristup, a gubitak claudin-18 uključen u proliferacije i invazije GC stanicama. Zajedno s ovim podacima, gubitak claudin-18 na submukozne invazivne ispred navedeno stjecanje više agresivnih svojstava i mogu dopustiti stanica-stanica disocijacija tijekom invazije. Međutim, ograničenje ovog istraživanja bio je da se samo MKN74 mogao biti ispitan, jer je to bio jedini diferencirani rak želuca stanična linija koja izrazio claudin-18 koliko smo ispitali. Dakle, slično kao i pojave ne mogu se reproducirati s drugim želučanih staničnim linijama karcinoma. Pregled

Oba up-regulaciji i down-regulacije claudins su prijavili da se uključe u proces protiv raka [34], [35]. Za analizu funkcije claudins u stanicama raka, genetički pristupi claudins također su zabilježene u raznim stanicama raka. Obaranje claudin-1 pomoću siRNA rezultat inhibiciju migracije u stanicama raka kolona [36]. Hiperekspresija claudin-6, claudin-7 ili claudin-9 poboljšana u invazivni potencijal želučane linijske stanice adenokarcinoma [37]. Takvo širenje claudin izazvanu i invazija može izgledati paradoksalno, jer su claudins poznato da se uključe u brtvljenje epitelne raskrižja. Ovi kontroverzni podaci ukazuju na to da su funkcije claudins su oba subtype- i stanični tip-specifični. Pregled

Kao ograničenje ove studije, još uvijek nije jasno da je ova pala claudin-18 razina u submukozalnim invazivne front je zapravo su uključeni u metastaziranje raka, jer je teško pratiti prirodni tijek ranog GCS. Međutim, podaci u ovom istraživanju pokazuju da niža razina claudin-18 u invazivnom ispred bio povezan s većim proliferativna sklonosti. Potrebno je prospektivno ispitati da li taj pad u razini claudin-18 se može koristiti kao prognostički metastazama i biomarkera nakon endoskopske resekcije u buduće studije. Pregled

Ukratko, to je pokazano po prvi puta da je claudin-18 heterogeno izražava na submukozne invazivne ispred rane GC i podreguliranje claudin-18 je povezana s proliferativni i invazivni potencijal GC. Ovi rezultati pokazuju da claudin-18 ima značajnu ulogu u napredovanju GC i može biti kandidat biomarkera progresije bolesti. Claudin-18 obaranje eksperiment potvrdio da potiskivanje spojnog claudin-18 promovirala proliferaciju i invaziju GC stanicama. Pregled

Izvori pregled

Zahvaljujemo gospođi Noriko Kamiya za tehničku pomoć. Pregled