PLoS Genetics: linea germinale mutazioni nel MAP3K6 sono associati con Familial cancro gastrico

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cancro gastrico è tra le principali cause di decessi correlati al cancro in tutto il mondo. Mentre le forme ereditarie di cancro gastrico sono relativamente rari, identificando i geni responsabili di tali casi può informare diagnosi e il trattamento per entrambi i casi ereditari e sporadici di cancro gastrico. Le mutazioni nel gene E-caderina, CDH1
, rappresentano il 40% della forma più comune di cancro gastrico familiare (FGC), cancro gastrico ereditario diffusa (HDGC). I geni responsabili per le rimanenti forme di FGC sono attualmente sconosciute. Qui abbiamo esaminato una grande famiglia da Maritime Canada con FGC senza CDH1
mutazioni, e ha individuato una linea germinale codifica delle varianti (p.P946L) in mitogeno-activated protein chinasi chinasi chinasi 6 ( MAP3K6
) . Sulla base di conservazione, previsto patogenicità e un ruolo nota del gene in predisposizione cancro, MAP3K6
era considerato un candidato forte ed è stato ulteriormente analizzato. Lo screening di ulteriori 115 individui non imparentati con non CDH1
FGC ha identificato la p.P946L MAP3K6
variante, così come quattro varianti di codifica aggiuntivi in ​​ MAP3K6
(p. F849Sfs * 142, p.P958T, p.D200Y e p.V207G). Un somatica secondo-hit variante (p.H506Y) era presente in DNA ottenuto da uno dei campioni tumorali, e la prova di ipermetilazione del DNA all'interno del MAP3K6
gene è stata osservata nel DNA del tumore di un altro individuo affetto. Questi risultati, insieme con la prova precedente di modelli murini che MAP3K6
agisce come un soppressore del tumore, e studi che dimostrano la presenza di mutazioni somatiche nel MAP3K6
nei tumori gastrici non ereditarie e delle cellule del cancro gastrico linee, il punto verso il MAP3K6
varianti come un fattore predisponente per FGC.

Autore Sommario

Le mutazioni genetiche sottostanti coinvolti nel 60% dei casi di cancro gastrico ereditarie rimangono sconosciute. Qui vi presentiamo un grande pedigree esteso con cancro gastrico familiare e un'associazione nella parte della famiglia con una mutazione nel MAP3K6
. La conservazione, previsto patogenicità della variante, distribuzione tissutale, e la funzione nota di MAP3K6
reso questo un candidato forte che giustificato ulteriori indagini. L'esame di ulteriori 115 non imparentati probandi identificato ulteriori mutazioni in MAP3K6
, tra cui una mutazione troncando

Visto:. Gaston D, Hansford S, Oliveira C, Nightingale M, H Pinheiro, Macgillivray C, et al. (2014) germinale mutazioni in MAP3K6
sono associati con famigliare cancro gastrico. PLoS Genet 10 (10): e1004669. doi: 10.1371 /journal.pgen.1004669

Editor: Marshall S. Horwitz, Università di Washington, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 3 Marzo 2014; Accettato: 14 agosto 2014; Pubblicato: 23 ottobre 2014

Copyright: © 2014 Gaston et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. La seguente agenzie fornito finanziamenti per questo progetto: Genome Canada, Genoma Atlantico, Fondazione per la ricerca Nuova Scozia Salute, Nuova Scozia ricerca e Innovazione trust, Dalhousie Facoltà di Medicina, Dalhousie Dipartimento di Oftalmologia, Health Canada, il Centro per la ricerca e sviluppo di farmaci, Capitale Distretto Sanitario Autorità, IWK Health Centre Foundation, Fondo di ricerca Salute Capital, e il compito /FEDER Fondazione portoghese per la scienza e la tecnologia (FCT), Progetti Ref. FCT PTDC /SAU-GMG /110785/2009 e Post-doc concessione SFRH //79499/2011 di HP "financiados nessun ambito do Programa Operacional Temático Factores de Competitividade (COMPETE) e comparticipado pelo fundo Comunitário Europeu FEDER." È supportato BPD MES dal CHU Sainte-Justine Centre de Recherche. Gli autori vorrebbero riconoscere il contributo di: la piattaforma Sequencing Genoma Quebec High Throughput; e Sonia Sousa e José Carlos Machado dall'unità IPATIMUP Diagnostics, Porto, Portogallo. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

cancro gastrico è la seconda causa di morte per cancro in tutto il mondo con 738.000 decessi all'anno [1]. Il trattamento primario consiste nella resezione chirurgica del tumore e può essere seguito da chemioterapia e /o radioterapia. I tassi di sopravvivenza a 5 anni dopo resezione chirurgica sono alti se la malattia è diagnosi precoce (71% per lo stadio 1A), tuttavia, scendere rapidamente quando la diagnosi è fatta in fasi successive (46% stadio IIA, il 20% in stadio IIIA, 4% stadio IV) (database SEER del National Cancer Institute, ottobre 2013). Purtroppo, a causa sintomi precoci di cancro gastrico assomigliano da vicino altre malattie, la diagnosi spesso non si verifica fino a stadi avanzati sono già stati [2] raggiunto

Classicamente, cancro gastrico è stato diviso in due tipi:. Intestinale e diffusa [ ,,,0],3]. La forma intestinale avviene spontaneamente ed è più spesso trovato nei soggetti anziani, mentre la forma diffusa spesso si verifica negli individui più giovani e può essere associato con una storia familiare di cancro gastrico. Popolazioni con più alta prevalenza di Helicobacter pylori
infezione cronica tendono ad avere più elevati oneri di cancro gastrico [4]. La maggior parte dei tumori gastrici (90%) sono sporadici, ma circa il 10% mostrano il clustering familiare [5]. Solo 1% al 3% sono causati da una sindrome ereditaria, in contrapposizione a fattori ambientali quali pratiche alimentari condivisi [5]. La forma familiare più consolidata del cancro gastrico è il cancro gastrico ereditario diffusa (HDGC [MIM ​​137215]), dove circa il 40% dei casi sono attribuiti a mutazioni germinali nel gene codifica E-caderina, CDH1
[6 ] - [9].

Abbiamo accertato una grande famiglia da Maritime Canada con una storia di cancro gastrico familiare (FGC) la visualizzazione di un autosomica dominante modello apparente di eredità, ma privi di varianti nella regione codificante del CDH1
gene. Mentre la famiglia mostra molte caratteristiche tipiche di HDGC, c'era la diversità nella presentazione clinica all'interno della famiglia, così come l'età avanzata di insorgenza, quindi abbiamo scelto di fare riferimento semplicemente alla condizione di FGC nel HDGC più rigorosamente definito. mappatura genomica delle regioni ereditati condivisi tra i membri della famiglia affetti, seguiti da tutto il sequenziamento, ha portato all'identificazione di una linea germinale un'unica variante nucleotide (SNV) in mitogeno-activated protein chinasi chinasi chinasi 6 ( MAP3K6
, ASK2
, MAPKKK6
, MEKK6
, ENSG00000142733), un gene che codifica un membro della famiglia di proteine ​​chinasi serina /treonina. Diversi in silico
metodi predetto l'SNV in MAP3K6 di essere dannoso per la proteina, e gli studi precedenti con MAP3K6
topi deficienti [10], così come la presenza di mutazioni in questo gene in entrambi i principali tumori del cancro gastrico e linee cellulari di cancro gastrico [11], sono stati coerenti con mutazioni nel MAP3K6
gene essendo la mutazione causativa. Il sequenziamento del DNA isolata direttamente da un campione tumorali fissate su un individuo dimostrato la presenza di un de novo
variante del secondo colpo in MAP3K6
. Lo screening di ulteriori 115 campioni FGC non collegati, anche negativa per CDH1
mutazioni, ha rivelato cinque individui con quattro SNVs aggiuntivi in ​​ MAP3K6
che sono stati anche previsto per essere patogeni, così come un individuo estraneo con il SNV identificato nella famiglia dal Maritime Canada. L'età di insorgenza varia tra i MAP3K6
vettori SNV nei cinque famiglie, e non aveva sviluppato il cancro anche in fase avanzata della vita, suggerendo penetranza incompleta. Questo è il primo rapporto di un cancro ereditario risultante da SNVs in MAP3K6
.

Risultati

clinica e patologica valutazione

accertato una grande marittimo canadese famiglia di origine europea nel corso della valutazione clinica di routine nel ereditario Cancer Clinic come parte del Maritime Genetica medica servizio presso il Centro di salute IWK a Halifax, Nova Scotia, Canada (Figura 1). Saliva, sangue, o campioni (FFPE) inclusi in paraffina fissati in formalina sono stati ottenuti da 6 membri della famiglia con cancro gastrico, così come 27 parenti non affetti, e un individuo sposato-in. No consanguineità era sospettato in questo pedigree.

Il probando, colpito individuale 1884 è stato diagnosticato un carcinoma gastrico metastatico e ha subito una gastrectomia totale all'età di 51. esame patologico ha rivelato un adenocarcinoma scarsamente differenziato derivante nel antro dello stomaco in uno sfondo di metaplasia intestinale e gastrite cronica. Il tumore era composto da un foglio di cellule ad anello con castone (Figura 2C e D). Il carcinoma penetrato attraverso l'intero spessore della muscolare propria coinvolge lo strato sieroso. Nessuna evidenza di H. pylori
è stato visto.

zia materna del probando, individuale 1826, è stato diagnosticato un carcinoma gastrico all'età di 80 anni e ha subito una gastrectomia parziale. esame patologico ha rivelato un adenocarcinoma moderatamente a scarsamente differenziato invadere in muscolare propria (Figura 2A). Il tumore era prevalentemente composta da nidi coesivi di cellule neoplastiche con formazione ghiandolare occasionale. Le cellule tumorali con forme di cellule ad anello con castone sono stati osservati nelle aree piene (Figura 2b). La mucosa gastrica adiacente al tumore mostrato metaplasia intestinale focale senza evidenza di H. pylori
.

A 76 una biopsia allo stomaco di un altro zia materna al probando, individuale 1841 anni, è stato segnalato per avere un adenocarcinoma moderatamente differenziato con formazione ghiandolare. H. pylori
è stato identificato in background mucosa gastrica. Una piccola sezione biopsia era disponibile per un nuovo esame. Anche se questo campione era troppo piccola per una classificazione completa, ha mostrato nidi coesivi di cellule neoplastiche con piccoli focolai di formazione ghiandolare in linea con un adenocarcinoma scarsamente differenziato. Ci sono state alcune cellule tumorali nel campione che mostrano citoplasma chiaro, ma questi non potevano essere definitivamente classificata come cellule ad anello con castone.

Una biopsia allo stomaco a 82 l'età del paziente 1844, la madre del probando, ha mostrato un adenocarcinoma scarsamente differenziato con caratteristiche anello con sigillo. La mucosa fondo ha mostrato evidenza di H. pylori
e metaplasia intestinale di leopardo.

Paziente 1845, un primo cugino-once-rimosso per probandi, è stato diagnosticato all'età di 59 con un carcinoma indifferenziato senza le funzioni ad anello con castone. Il tumore è stato associato con denso infiltrato linfoide ed è stato meglio classificato come il carcinoma linfoepiteliale. H. pylori
non è stato visto nella mucosa normale adiacente. Il tumore è stato positivo per due varianti intronic in CDH1
entrambi i quali sono tenuti a essere benigna (NM_004360.3: c.688-83G > A e c.2439 + 52G > A)
<. p> paziente 2447, un cugino di terzo grado, è stata diagnosticata a 44 anni con un adenocarcinoma scarsamente differenziato senza caratteristiche di cellule ad anello con castone. La mucosa gastrica adiacente mostrato estesa metaplasia intestinale. Non c'è stata evidenza di H. pylori
.

A seguito di controlli su di un panel di 115 probandi con CDH1
cancro gastrico non familiare, una famiglia non correlata dal Portogallo è stato aggiunto al nostro studio (Figura 3A). Individuale II-6 è stato diagnosticato un cancro gastrico a 62 anni, avendo adenocarcinoma scarsamente differenziato dello stomaco e la presenza di cellule ad anello con castone. analisi immunoistochimica ha mostrato colorazione membranosa positivo di E-caderina nelle cellule neoplastiche (Figura 3C), comprese le cellule ad anello con castone (figura 3b). Gli individui legati I-4, II-1 e II-7 sono stati diagnosticati con cancro gastrico (dettagli istologici sconosciuti) in età di 53, 62 e 52, rispettivamente. Tutti e quattro gli individui nel pedigree portoghese sono morti a causa della malattia entro 5 anni dalla diagnosi in questa famiglia. Nella famiglia canadese Maritime 1884, 1844 e 1841 morti per la malattia entro un anno dalla diagnosi.

Il cancro gastrico descritto per i pazienti 1845 e 2447 non aveva anelli con sigillo osservate ed è stato diagnosticato in età media in precedenza ( 52 contro 72, anche se il probando è stato diagnosticato all'età di 51 anni). Sulla base di differenze di istologia, in particolare la mancanza di cellule sigillo nel 1845 e 2447 rispetto agli altri individui affetti, è possibile che la malattia in questi due individui rappresenta una condizione distinta. In alternativa è possibile che la famiglia è la visualizzazione di un modello più complesso fenotipica essere guidato da due (o più) dei geni.

Mapping molecolare ed esclusione di geni noti e candidati

Anche se il 30-40% dei casi hdgc sono attribuibili a mutazioni in CDH1
, non mutazioni in esoni codificanti proteine ​​di CDH1
sono stati trovati in individui affetti dalla famiglia canadese Maritime. Per identificare i loci patogenicità in questa famiglia, ad alta densità di SNP-genotipizzazione utilizzando le matrici Illumina è stata effettuata su cinque individui affetti: la madre del probando (1844), due zie materne interessate (1826 e 1841), e due lontani cugini (1845 e 2447) così come molti individui imparentati senza incidenza di cancro il cui stato affetto è stata trattata come sconosciuto (1907, 1924, 1821 e 1822). Per tutti gli individui ad eccezione di 1845 dati di genotipizzazione era disponibile a 2,5 milioni di marcatori. Individual 1845 era stato precedentemente genotipizzazione ad una densità di 660K, e non era in grado di essere ri-genotipizzati alla maggiore densità. Nessun DNA adatto per SNP genotipizzazione è stata ottenuta dal campione FFPE del probando (1884). Utilizzando questi dati, abbiamo eseguito entrambi non parametrica e analisi di linkage parametrica utilizzando Merlin [12]. Data la tarda età di insorgenza di molti membri della famiglia affetti, la penetranza nel pedigree marittimo è sconosciuta. Al fine di essere conservatori per identificare regioni genomiche di interesse, due modelli dominanti penetranza (50% e il 99% penetranza) utilizzando gli individui affetti 1826, 1841, 1844 e 2447 (e gli individui 1907, 1924, 1821, e 1822 con lo status di affetto sconosciuto ) erano abituati. regioni genomiche identificate sotto linkage analisi parametrica erano generalmente coerenti tra loro indipendentemente dal parametro penetranza prescelto (Tabella 1). L'analisi è stata ripetuta con i singoli 2.447 trattati come sconosciuto di analizzare solo il pedigree ridotta dove 2447 e il 1845 sono stati trattati come potenziali fenocopie (Tabella 2). Ciò ha provocato più bassi punteggi lod complessivi per tutte le regioni individuate, così come più e più grandi regioni, in media, che comprende una porzione più ampia del genoma.

Abbiamo anche effettuato il collegamento non parametrica (NPL), un metodo con minor numero di ipotesi sottostanti circa il modello di ereditarietà sottostante, utilizzando individui affetti 1826, 1841, 1844, e 2447 (pedigree-wide) o con la rimozione di 2447 come un potenziale phenocopy specificando loro di essere di stato sconosciuto (sub-pedigree). intervalli genomici in tutto il pedigree erano per lo più in linea con quelli individuati utilizzando i due modelli parametrici (Tabella 3). Esclusione di 2447 ha provocato un punteggio più basso massimo complessivo (1.204), che è stato trovato in diversi intervalli di tutto il genoma (Tabella 3).

intervalli genomiche identificate in questo modo sono stati utilizzati per filtrare i dati sequenziamento per identificare potenziali mutazioni causali. Per essere ampio per identificare possibili mutazioni causative, sia nel caso pedigree-wide e sub-pedigree gli intervalli dei rispettivi parametrica e le analisi non parametrici sono stati combinati. Per pedigree livello analizza questo era l'unione di intervalli descritti in Tabella 1 insieme a intervalli appropriati nella tabella 3 (compreso 2447) e per l'analisi sub-pedigree l'unione di intervalli riportati nella Tabella 2 con intervalli adeguati in Tabella 3 ( escluso 2447).

intero sequenziamento

Abbiamo poi eseguito tutto il sequenziamento su due delle zie materne colpite per probandi (1826 e 1841) e il terzo cugino interessata (2447). Abbiamo dato la priorità e filtrata varianti in base alla loro frequenza tra le popolazioni europee-discesa (< 2% e un filtro più rigoroso al < 1%) dai set di dati 1000 genomi e exome progetto di sequenziamento, nonché altri exomes sequenziato allo stesso fornitore di sequenziamento, posizione all'interno di una regione genomica di interesse, e la conseguenza funzionale della mutazione (alterare la proteina sequenza codificante o sito di splice di almeno una proteina codificante trascrizione). Varianti di interesse sono stati poi sequenziato dal sequenziamento Sanger in altri individui affetti. filtrazione Variante sulla base di intervalli di genomica è stata effettuata separatamente per ogni ipotesi (con tutto il pedigree e ridotto pedigree) (Tabelle S1 e S2). Oltre alla identificazione e filtrazione di varianti genetiche, abbiamo valutato la profondità sequenziamento di copertura esoni (definite dal set Consensus CDS) entro regioni genomiche di interesse e di tutti i singoli risultati sequenziamento. Inoltre, abbiamo cercato per le varianti potenzialmente condivise che sono state "mascherati" da problemi di copertura. Per tutte le varianti osservati in uno o più exomes, se nessuna variante è stata osservata nel exome rimanente (s), abbiamo valutato se era causa di bassi copertura o copertura lacune all'interno esone. Per le varianti in cui questo era vero che filtrati utilizzando criteri standard (come sopra). L'utilizzo di questi criteri di filtro, diverse varianti a basso MAF e potenzialmente avere un effetto a livello di proteina-codificanti sono stati osservati nel livello di pedigree regioni genomiche di interesse che erano stati identificati da analisi di linkage parametrica; tuttavia, nessuno era presente in tutti gli individui affetti. Inoltre non varianti candidati "mascherati" sono stati identificati con gli stessi criteri.

Abbiamo considerato la possibilità che gli individui 1845 e 2447 hanno una condizione clinica distinta, ed ha esaminato le varianti condivise tra i probandi e famiglia. Utilizzando gli stessi criteri di filtro come sopra, ma utilizzando solo i exomes da individui 1826 e 1841, sono stati identificati un totale di 127 varianti. Più severa di filtraggio per le varianti rare (MAF < 1%) ha ridotto questo numero a 85 (Tabella S2). Un sottoinsieme di queste varianti, sulla base di una combinazione di fattori (mutazioni in COSMIC [13], effetto della mutazione predetto, la conservazione del aminoacido codificato, revisione della letteratura, noti modelli di espressione nei tessuti normali e tumorali, fenotipi malattia associata con la gene) sono stati sequenziati per il follow-up nei probandi e la loro madre. Una variante in MAP3K6
(Chr1, NM_004672) è stato di particolare interesse. Una mutazione identificata in MAP3K6
(c. [2837C > T]; [=], p.P946L) è stato considerato un candidato forte in base alle associazioni note di altri MAP chinasi con il cancro, e diverse pubblicazioni chiarire un ruolo MAP3K6 nella tumorigenesi [10], [11], [14], [15]. Questa variante è stata riportata in precedenza (rs141787524) con una frequenza minore allele del 0,7% nel genoma Progetto 1000 (gruppo origine europea) e una frequenza di 0,4% nella popolazione europea-americana (exome Variante Server (NHLBI GO sequenziamento del progetto ( ESP):. http://evs.gs.washington.edu/EVS [Accessed ottobre 2013]) E 'stato visto come una variante eterozigote a 11 (su 1532) altre exomes sequenziati presso il Centro di Innovazione Genoma Quebec, corrispondente ad una MAF del 0,36%.

Questa SNV era presente in quattro individui affetti nella famiglia Maritime (1884, 1826, 1844, 1841), di cui tre ha mostrato chiaramente la presenza di cellule ad anello con castone. Solo una piccola biopsia pugno era disponibile per la zia materna 1841, quindi non siamo stati in grado di confermare definitivamente la presenza o l'assenza di cellule ad anello con castone. il MAP3K6
SNV era presente anche in cinque dei 27 parenti attualmente affetti campionati, ed è non era presente nella sposati-in relativa. Uno dei vettori era omozigote per l'SNV ed è stato più di 80 anni senza cancro segnalati. Anche se non la consanguineità è stato segnalato nella famiglia, ed è stata osservata alcuna evidenza di variazione del numero di copie dei dati genotipo SNP, questo individuo era anche omozigote per una regione che comprende 10 Mb locus. I restanti vettori in età variava 33-51, e come l'età di insorgenza del tumore è stata generalmente più tardi, il suo stato era considerato "sconosciuto". Entrambi gli individui, il 1845 e il 2447, con il cancro gastrico fenotipicamente distinte sono risultati negativi per la MAP3K6
SNV.

Somatic varianti all'interno del tumore

Abbiamo poi usato il DNA isolato da una sezione tumorale del campione FFPE dei colpiti MAP3K6
SNV vettore 1884 (probandi) per lo screening SNVs somatici aggiuntivi o perdita di eterozigosi (LOH) all'interno del tumore stesso. Oltre alla variante p.P946L, abbiamo identificato un romanzo SNV nel MAP3K6
gene alla posizione c [1516C > T]. Portando ad un cambiamento p.H506Y aminoacido (Tabella 4), e sono stati in grado a dedurre che il SNV è stata somatically acquisita sulla base di dati di sequenza del coniuge e dei figli.

verifica in casi non collegati FGC

Sono stati esaminati campioni di DNA da un ulteriore 115 individui non imparentati FGC usando un multiplex di mira test di sequenziamento di nuova generazione. I campioni provenivano da famiglie non imparentate che hanno incontrato i criteri internazionali gastrico consorzio cancro linkage (IGCLC) per ereditaria diffusa cancro gastrico (106), ma aveva precedentemente risultato negativo per mutazione del CDH1
locus, o cancro gastrico familiare intestinale. All'interno di questa coorte, abbiamo identificato cinque SNVs eterozigoti aggiuntivi nel MAP3K6
gene (Tabella 4):. Un troncamento SNV (. C [2544delC], p.F849Sfs * 142), tre SNVs missense (c [2872C > A], p.P958T;. c [598G > T], p.D200Y e c [620T >. G], p.V207G), e un altro individuo con la p.P946L (c [2837C >. T] ) variante, precedentemente trovato nella famiglia marittima (Figura 4). Le mutazioni in MAP3K6
sono stati scoperti solo negli individui che soddisfano i criteri per il cancro gastrico diffuso (106). L'individuo in questo romanzo coorte di pazienti che trasportano la variante p.P946L è pensato per essere estranei alla famiglia Maritime.

L'SNV troncando è stato osservato in un individuo portoghese con una storia familiare di cancro gastrico (Figura 3A). Mentre questo SNV ha un identificatore dbSNP (rs34008139), nessuna frequenza popolazione è stata associata con esso da entrambi i 1000 Genomi o progetti exome Variante Server. Questo SNV è stato segnalato anche nel database COSMIC (stato somatico /germinali non specificato) [13] in un campione di carcinoma del grosso intestino. L'esame istologico del tumore del probando ha mostrato un cancro gastrico scarsamente differenziato con cellule ad anello con castone, conservando l'espressione della proteina E-caderina alla membrana cellulare (Figura 3B e 3C).

La variante p.D200Y è stato trovato in probandi da due famiglie non correlate, ed è stata osservata all'interno del genoma di coorte 1000 (rs41291098), ma è anche rara con una frequenza minore allele (MAF) dello 0,4% in entrambe le 1000 genomi e sequenziamento progetto europeo gruppi discesa. La variante p.P958T (rs75893867) non ha MAF riportato sia nel 1000 Genomi o sequenziamento dataset discesa progetto europeo, ed è stato identificato solo nel 1000 Genomi tra la coorte giapponese ad una frequenza di 2,2%. Tuttavia, è stato identificato in COSMIC (COSM99077) come una mutazione somatica di un paziente carcinoma gastrico. La variante p.V207G è stato identificato nel sequenziamento del progetto insieme di dati europea-americana con un MAF del 0,01%. Non è stato identificato tra i gruppi discendenza europea o europei nel 1000 Genomi, ma è stata osservata all'interno di altri gruppi di popolazione a una gamma di frequenze alleliche minori.

Con MAP3K6
, 50 altri geni precedentemente suggerito di essere coinvolto in rischio di malattie del tratto gastrointestinale superiore sono stati sequenziati per questa coorte usando un test personalizzato pannello a base (manoscritto sottomesso). I geni della schermata personalizzata MiSeq-based sono stati selezionati sulla base di revisione della letteratura, così come geni di interesse in progetti di collaborazione. Nei casi in cui MAP3K6
varianti missenso sono stati identificati, altre varianti candidati sono stati trovati.

seconda Hit Analisi nel tumore dalla famiglia portoghese

tessuto FFPE tumore era disponibile per i probandi dalla famiglia portoghese che trasporta i p.F849Sfs * 142 germinale troncando mutazione. mutazioni somatiche sono stati esclusi nella codifica sequenza e introne-esone completi confini del MAP3K6
nel tumore del probando. La mancanza di LOH al MAP3K6
gene potrebbe anche essere dedotto in questo tumore, sia come wild-type e mutante alleli potrebbe essere identificato nel sito mutazione germinale (supplementare figura S2). Abbiamo cercato quindi di meccanismi alternativi inattivazione putativi. Ipermetilazione di isole CpG all'interno promotori dei geni e le regioni regolatorie è un fenomeno comune che porta a una diminuzione dell'espressione genica nel cancro [16]. MAP3K6
regolamentazione da ipermetilazione del promotore è stato descritto per cellule staminali del midollo osseo mesenchimali umane [17], anche se non è stata stabilita una correlazione di ipermetilazione e l'espressione genica. Abbiamo cercato per MAP3K6
isole CpG [18] e ha trovato due isole CpG, uno alla regione del promotore e un altro che comprende esone 10 e parte del introne a valle (Figura 5 e Figura supplementare S1). La valle isola CpG (isola CpG 2) è in prossimità di un sito ipersensibile DNasi previsto per il porto promotore associato caratteristiche (Ensembl funzione regolamentare ID ENSR00000533270, Figura 5). Abbiamo DNA bisolfito-trattati da: linfociti del sangue periferico del probando (PBL); tumore del probando; quattro diversi normali campioni di controllo allo stomaco, e; sette linee di cellule di cancro gastrico. Per il promotore isola CpG (CpG isola 1), non ipermetilazione è stato rilevato utilizzando due diversi set di primer (Figura 5 e Suppl. Figura S1). Per quanto riguarda CpG isola 2, abbiamo osservato completa la metilazione del DNA tumorale e non metilazione del DNA per il PBL. È interessante notare che l'analisi di metilazione in CpG Island 2 in normale mucosa dello stomaco dai controlli visualizzato un modello di metilazione parziale. In linea con il risultato ottenuto per il DNA del tumore, tutte le sette linee di cellule di cancro gastrico visualizzati pieno metilazione (Figura 5 e Suppl. Figura S1).

La patogenicità di SNVs in MAP3K6

Abbiamo applicato una varietà di in silico
metodi per prevedere la patogenicità del SNVs missense osservati. Anche se non c'era pieno consenso attraverso programmi (Tabella 5), ​​tutti i SNVs sono stati considerati deleteri per almeno un programma, e ad eccezione p.V207G e p.P958T, gli altri quattro varianti descritte nella presente relazione sono stati previsti per essere deleterio per almeno 3 dei 7 metodi. Inoltre, il EvoD [19] consenso previsione (basata su una combinazione equilibrata del EvoD, PolyPhen2 [20], e SIFT [21] punteggi) ha riferito che tre delle varianti (p.D200Y, p.V207G, p.H506Y ) erano nocivi o rischia di essere deleterio. Le due varianti rimanenti, p.P946L e p.P958T, sono stati previsti per essere probabili cambiamenti neutrali anche se erano evolutivamente ultra-conservati e ben conservato (secondo la classificazione EvoD tasso evolutivo), rispettivamente; mentre solo uno degli altri tre varianti (p.D200Y) è ritenuto ben conservati e gli altri due erano meno conservati. Come (i) un MAP3K6
troncando variante è stato trovato, (ii) c'era un secondo-hit variante identificata nella persona per la quale è stato esaminato il tessuto FFPE, e (iii) tutti i programmi esaminati sono stati progettati per prevedere patogenicità sulla base di perdita di funzione, è probabile che le varianti descritte rispettivamente, o una diminuzione della funzione o dominante fenotipo negativo.

Discussione

Ecco a voi la prima prova che mutazioni germinali in MAP3K6
sono collegati al cancro ereditario. Quattro individui con cancro gastrico da una famiglia canadese marittimo sono stati trovati a portare una variante eterozigote nel MAP3K6
gene, portando ad un cambiamento aminoacido p.P946L. Questa variante della linea germinale, localizzato sul cromosoma 1, è stato identificato in due dei tre campioni exome ed era situato all'interno di una regione identificata da analisi parametrica e non parametrica collegamento all'interno del sub-pedigree (il 1845 e il 2447 trattati come "sconosciuto" stato di malattia) . Il significato del MAP3K6
variante è stato sostenuto dalla identificazione di un somatica secondo-hit mutazione nel MAP3K6
genica a p.H506Y presente nel DNA isolati direttamente da una sezione tumorale di un paziente campione FFPE. Due individui dal pedigree con cancro gastrico, ma con alcune differenze fenotipiche non ha effettuato la mutazione; tuttavia, non sono stati individuati varianti candidati condivisi tra tutti gli individui affetti all'interno di ogni regione identificata, per il collegamento parametrico condotti a livello di razza.

Proiezione di famiglie aggiuntive FGC rivelato cinque altri MAP3K6
mutazioni, tra cui un p.F849Sfs * 142 mutazione germinale osservata nei probandi portoghese, che dovrebbe portare a troncamento della proteina. Dopo aver escluso mutazioni somatiche e LOH, un potenziale meccanismo di secondo colpo è stato trovato via
hypermethylation ad un intragenica CpG isola nei pressi di un elemento promotore-associata predetto normativo (DNAsi I sito ipersensibile). La rilevanza di metilazione in questo MAP3K6
regione genica potrebbe non essere accertato in termini di impatto genica, tuttavia la possibilità di agire come una possibile seconda colpito inattivazione (parziale o totale) meccanismo è sollevato, a causa i risultati ottenuti in normali linee di stomaco e di cellule di cancro. Se è così, questo potrebbe rappresentare un altro esempio del concetto sempre più riconosciuto che la metilazione del DNA nel corpo gene non è solo un testimone passivo della trascrizione genica, ma è attivamente coinvolta in molteplici processi di regolazione genica [22], che giustificano ulteriori indagini. analisi istopatologia del individuo dalla famiglia portoghese portando questa mutazione troncando ha caratterizzato le cellule ad anello con castone come parte del fenotipo tumorale, come ha fatto la maggior parte degli individui dal Maritime sub-pedigree (tranne 1841 in cui lo stato sigillo è stato inconcludente a causa della mancanza di materiale sufficiente).

Anche se MAP3K6
mutazioni non sono stati precedentemente identificato nel cancro ereditario, vi è un crescente corpo di prove che MAP3K6
ha un ruolo importante nella patogenesi del cancro . Nei topi, dove MAP3K6
è normalmente espresso in tessuto gastrico e la pelle, la perdita di MAP3K6
in topi knockout omozigoti è stato trovato per aumentare la suscettibilità al cancro della pelle indotto [10]. I topi non hanno sviluppato il cancro spontaneamente; Tuttavia, l'induzione chimica effettuata in presenza di uno stimolo infiammatorio portato ad un maggior numero di tumori cutanei nella MAP3K6
topi deficienti che negli animali di controllo. Il numero di tumori in eterozigoti ( MAP3K6
^{+/-) i topi, così come le loro dimensioni, è stato intermedio tra la wild-type e topi knock-out, suggerendo un ruolo per MAP3K6
dosaggio nei suoi effetti [10].}

• PLoS ONE: comparativa Proteomica Analisi del cancro gastrico Stelo Cells
• PLoS ONE: Diminuzione core-fucosilazione contribuisce alla malignità in gastrico Cancer