PLoS ONE: verminderde expressie van AZGP1 wordt geassocieerd met een slechte prognose in het jeugdwerk MaagKanker

De abstracte

Achtergrond

2-zink-glycoproteïne 1 (AZGP1) is een multidisciplinaire eiwit dat deelneemt bij veel belangrijke functies in het menselijk lichaam, zoals bemesting, immuunregulatie en vetmobilisatie. Recentelijk is aangetoond dat AZGP1 ook betrokken is bij carcinogenese en tumordifferentiatie. In deze studie onderzochten we de expressie niveaus en prognostische waarde van AZGP1 in het primair maagkanker.

Methoden en Resultaten

We hebben gekeken naar de expressie van AZGP1 in 35 gepaarde kankercellen en afgestemd aangrenzende noncancerous maagslijmvlies weefsels door real-time kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR) en western blotting. Verder analyseerden we AZGP1 expressie in 248 patiënten die resectie procedures tussen 2005 en 2007 onderging het gebruik van immunohistochemie. De relaties tussen de AZGP1 expressie niveaus, de klinisch-pathologische factoren, en de overleving van de patiënten werden onderzocht. AZGP1 expressie was significant verminderd bij zowel het mRNA ( P
= 0,023) en eiwit niveaus ( P
= 0,019) in tumorweefsel monsters, vergeleken met expressie in gelijke naburige niet-tumorweefsel samples . De immunohistochemische kleuring gegevens bleek dat AZGP1 expressie was significant verminderd bij 52,8% (131/248) van adenocarcinoom van de maag gevallen. Clinicopathologische analyse toonde aan dat de verminderde expressie van AZGP1 was significant gecorreleerd met tumor locatie ( P
= 0,011), histologische graad ( P
= 0,005) en T-stadium ( P
= 0,008). Kaplan-Meier blijkt dat de verminderde expressie van AZGP1 was geassocieerd met een slechte prognose bij adenocarcinoom patiënten ( P
= 0,009). Multivariate Cox-analyse geïdentificeerd AZGP1 expressie was een onafhankelijke prognostische factor voor de algehele overleving van adenocarcinoom van de maag patiënten (HR = 1,681, 95% CI = 1,134-2,494, P
= 0,011).

Conclusies

Onze studie suggereert dat AZGP1 zou kunnen dienen als een kandidaat tumor suppressor en een potentiële prognostische biomarker in de maag carcinogenese

Visum:. Huang Cy, Zhao Jj, Lv L, Chen Yb, Li Yf, Jiang ss, et al. (2013) verminderde expressie van AZGP1 wordt geassocieerd met een slechte prognose in het jeugdwerk maagkanker. PLoS ONE 8 (7): e69155. doi: 10.1371 /journal.pone.0069155

Editor: Alfons Navarro, Universiteit van Barcelona, ​​Spanje

Ontvangen: 5 maart 2013; Aanvaard: 5 juni 2013; Gepubliceerd: 23 juli 2013

Copyright: © 2013 Huang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door Doctoral Fonds van het ministerie van Onderwijs van China (20100171110084). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte over de hele wereld, met 988.000 nieuwe gevallen en 736.000 doden per jaar [1] - [2]. In China werd maagkanker voorspeld dat de derde meest voorkomende kanker in 2005 met 0,4 miljoen nieuwe gevallen en 0,3 miljoen doden gemeld [3]. De behandeling van maagkanker omvat een combinatie van chirurgie, chemotherapie en radiotherapie. Maar bijna 60% van de getroffen patiënten bezwijken aan maagkanker na curatieve resectie alleen of na curatieve resectie volgende adjuvante therapie [4]. Maagkanker is een heterogene ziekte bij zowel histologie en genetica; vandaar dat de patiënt uitkomst is moeilijk te voorspellen met behulp van klassieke histologische classificaties. Gastric carcinogenese is een multifactoriële en werkwijze van meerdere stappen die inhoudt dat het activeren van oncogenen en het inactiveren van tumor suppressor genen in verschillende stadia van maagkanker progressie. Onlangs hebben diverse nieuwe oncogenen en tumor suppressor genen geassocieerd met maagkanker geïdentificeerd. Daarom klinisch belangrijk efficiënte nieuwe doelstellingen voor de vroege diagnose en effectieve behandeling van maagkanker.

AZGP1 (2-zink-glycoproteïne 1, Zn-alpha 2-glycoproteïne) is een 41 kDa eiwit oplosbaar een major histocompatibility complex-1 (MHC-1) -achtige vouwen in de structuur, en werd aanvankelijk geïdentificeerd en gezuiverd humaan serum in 1961 [5]. Het gen voor AZGP1, toegewezen aan het chromosoom 7q22.1 tot fluorescentiehybridisatieprobes karyotypering, bestaat uit vier exons en drie introns [6], [7]. Middels immunohistochemische studies is gebleken dat AZGP1 voornamelijk tot expressie in epitheelcellen van de borst, de prostaat, de lever en diverse andere gastro-intestinale organen [8]. Overeenkomstig de productie van secretoire epitheliale cellen wordt AZGP1 gevonden in verschillende lichaamsvloeistoffen [9], [10], [11].

AZGP1 een multidisciplinair eiwit dat deelneemt bij veel belangrijke functies in het menselijk lichaam, zoals bevruchting [11], immunoregulatie [12] en vetmobilisatie [13], [14], [15]. AZGP1 wordt ook geassocieerd met kanker cachexie. AZGP1 heeft een hoog niveau van aminozuursequentie homologie met tumor afgeleide lipide mobiliseren factor [14], en in een muismodel van AZGP1 producerende tumoren, AZGP1 gestimuleerde lipolyse in adipocyten leidt tot cachexie [16]. Recentelijk is aangetoond dat AZGP1 ook betrokken is bij carcinogenese en tumordifferentiatie. Eiwit en mRNA expressie assays een relatie tussen de AZGP1 niveaus en de histologische graad van borstkanker tumoren [17], [18] getoond. Bovendien zijn veel studies suggereren dat AZGP1 een potentiële serum marker van prostaatkanker [9], [19]. Bovendien is aangetoond dat AZGP1 werkt als een nieuw tumor suppressor in pancreaskanker [20]. Echter, tot nu toe de expressie status van AZGP1 en prognostische waarde van dit eiwit in primaire maagkanker niet gemeld.

In deze studie hebben we het AZGP1 expressieniveau in maagkanker geanalyseerd door real-time kwantitatieve RT -PCR (qRT-PCR), western blotting en immunohistochemie. Verder hebben we gewezen op de relatie tussen AZGP1 meningsuiting en het clinicopathologische kenmerken van maagkanker, en we evalueerde de prognostische waarde van AZGP1 uitdrukking voor de post-resectie overleving van maagkankerpatiënten.

Resultaten

AZGP1 mRNA expressie geanalyseerd met qRT-PCR

De transcriptionele niveaus van AZGP1 werden bepaald met qRT-PCR assays gebruikt 35 paren resectiepreparaten (samples tumorweefsel en naburige niet-tumorweefselmonsters voldoen) aan maag- kankerpatiënten. De AZGP1 mRNA niveaus waren significant verlaagd in 28 (80%) tumorweefselmonsters ten opzichte van de afgedekte naburige niet-tumorweefsel monsters ( P
= 0,023, figuur 1).

AZGP1 Expression geanalyseerd door Western blotting

de AZGP1 eiwitgehalten in de weggesneden maagkanker monsters werden bepaald door western blotting. De resultaten toonden een band AZGP1 bij 41 kDa, en de hoeveelheid eiwit aanwezig AZGP1 werd gemeten door densitometrie en hoogte. Consistent met qRT-PCR resultaten, een afname in AZGP1 expressie werd waargenomen bij 25 (71,4%) van de maag tumorweefsels in vergelijking met de afgedekte naburige niet-tumorweefsels ( P = 0,019
figuur 2A). Acht paren van representatieve maag tumor weefsel en de bijbehorende naburige niet-tumorweefsels werden getoond in figuur 2B.

immunohistochemische analyse van AZGP1 Expression bij maagkanker Tissue Monsters en de relatie met de klinische en pathologische kenmerken

om de moleculaire biologische bevindingen te bevestigen en onderzoeken de klinische en prognostische rol van AZGP1 expressie voerden we immunohistochemische analyse in 248-paraffine ingebedde secties maagkanker. De positieve expressie van AZGP1 werd gelokaliseerd in het cytoplasma (figuur S1). Onder de 248 maagkanker monsters, 117 (47,2%) vertoonden een hoge AZGP1 expressie (AZGP1 ++ of AZGP1 +++), terwijl de overige 131 gevallen (52,8%) weergegeven laag AZGP1 expressie (AZGP1- of AZGP1 +) (Figuur 3, tabel 1). Normale gastrische weefsels het sterkst AZGP1 positieve kleuring (Figuur 3A).

Op basis van de categorieën die we omschreven in de eerder genoemde methoden, toonden de gegevens dat de lage expressie van AZGP1 was significant gecorreleerd met tumor locatie ( P
= 0,011), histologische graad ( P
= 0,005) en T-stadium ( P
= 0,008), maar niet met de leeftijd, geslacht, tumorgrootte, radicale resectie , klierstatus (N-stadium) of metastase-status (M fase). De microfoto zijn weergegeven in figuur 3.

Correlatie tussen AZGP1 Uitdrukking basis van immunohistochemie en overleving van patiënten

De mediane overlevingstijd van de 248 patiënten met maagkanker was 45 maanden (2-89 maanden) . De totale overleving en 5-jaars overleving waren significant verbeterd in hoge AZGP1 expressie groep dan de lage expressie groep [64,2% versus 49,5% (totale overleving) en 65,1% versus 50,4% (5-jaarsoverleving), respectievelijk P
= 0,009, Figuur 4].

Univariate en multivariate analyses

Univariate en multivariate analyses werden uitgevoerd om de impact van AZGP1 meningsuiting en andere clinicopathologische parameters op vergelijken prognose. Op basis van een univariate analyse dat alle 248 patiënten opgenomen, werden 8 factoren gevonden om statistisch significante associaties met de algehele overleving hebben. Deze analyse nam volgende factoren in overweging: tumor locatie, tumorgrootte, histologische graad, AZGP1 expressie levels, TNM stadium (7e editie TNM classificatie) en het al dan niet een radicale resectie werd uitgevoerd (tabel 2). Alle 8 factoren in een multivariate Cox proportional hazards model voor aanpassing aan de effecten van de covariaten. Op basis van dit model, de tumor locatie, AZGP1 expressie niveaus, T podium en N-stadium van de tumor werden bevestigd als onafhankelijke prognostische factoren (tabel 2).

Discussie

Maagkanker blijft één van de meest dodelijke menselijke maligniteiten. Zelfs met de vooruitgang in de diagnose en therapie, de prognose van maagkanker nog natte [1], [21]. De klinische resultaten van maagkanker is afhankelijk van een reeks tumorkarakteristieken, zoals tumorgroei, differentiatie, invasie en metastasen op afstand, welke door een verscheidenheid van verwante genen. Daarom wordt algemeen aangenomen dat genetische veranderingen die leiden tot de activering van oncogenen en de inactivatie van tumor suppressors de onderliggende oorzaken van kanker pathogenese. De sequentiële winst van oncogenen en verlies van tumor suppressors de nodige basis voor de stapsgewijze progressie van vaste tumoren van initiatie tot transformatie en tumorprogressie [22], [23], [24]. Eerder heeft AZGP1 gemeld tumor onderdrukkende eigenschappen bezitten borstkanker, prostaatkanker, pancreaskanker en andere kwaadaardige tumoren [17], [20], [25]; maar de rol van AZGP1 primaire maagkanker nog niet geëvalueerd. Ons onderzoek liet zien dat AZGP1 expressie was significant verlaagd bij zowel het mRNA en eiwitniveaus in tumorweefselmonsters, vergeleken met expressie in overeenkomstige naburige niet-tumorweefsel samples. In overeenstemming met onze studie, Brysk MM et al. ook aangetoond dat de AZGP1 niveaus hoger in normale orale weefsels dan bij orale tumoren [26]. Gagnon S et al. ook bewezen dat AZGP1 aanwezig in goedaardige hyperplastische klieren was 91,1% van de gevallen, maar slechts 40,7% (slecht gedifferentieerde component) tot 48,5% (goed gedifferentieerd component) van adenocarcinomen van de prostaat en slechts 8% van metastasen [27]. Deze studie resultaten ondersteunen de hypothese dat AZGP1 als tumor suppressor in sommige kankers kunnen dienen.

Om deze vermindering van AZGP1 expressie in primaire maagkanker verder te valideren, voerden we immunohistochemische analyse met een anti-konijn antilichaam hAZGP1. We zagen lagere expressie van AZGP1 immunokleuring in proximale of totaal maagkanker in vergelijking met verre maagkanker weefsels. Sommige studies hebben aangetoond dat de proximale maag kankerpatiënten een slechtere overleving dan verre maagkankerpatienten [28]. Deze gegevens suggereerden dat de lage expressie van AZGP1 bij maagkanker wordt geassocieerd met kwaadaardige fenotypes. Bovendien hebben we ontdekt dat verminderde expressie van AZGP1 geassocieerd met slecht gedifferentieerde adenocarcinomen (G3 vs. G1 /G2), wat aangeeft dat AZGP1 de differentiatie van maagkanker kan veroorzaken. Deze resultaten komen overeen met de bevindingen van Diez et al. [17], [18] die een associatie beschreven tussen hoge AZGP1 expressie en een hoog niveau van differentiatie bij borstkanker. Soortgelijke bevindingen zijn ook gemeld voor prostaatkanker [19], borstkanker en pancreaskanker [26]. Verder hebben we geconstateerd dat de lage expressie van AZGP1 werd geassocieerd met geavanceerde T-stadium. Deze resultaten impliceerde dat de lage expressie van AZGP1 tumorgroei kunnen bevorderen. In overeenstemming met onze studie, Irmak S et al. suggereerde dat AZGP1 houdt verband met de ontwikkeling van oppervlakkige blaaskanker en de omzetting ervan in een invasief fenotype [29]. Deze bevindingen geven samen een belangrijke rol AZGP1 bij de differentiatie en groei van maagkanker.

De Kaplan-Meier overlevingsanalyse patiënten in onze studie met lage AZGP1 expressie hadden een significant kortere overleving dan die met een hoge expressieniveaus. Univariate analyses toonden aan dat de verminderde expressie van AZGP1 bij maagkanker weefsels was significant geassocieerd met de algemene overleving en de 5-jaarsoverleving. Multivariate analyse toonde aan dat AZGP1 expressie, samen met een aantal traditionele prognostische factoren zoals tumor locatie, T en N stadium stadium waren onafhankelijke risicofactoren de prognose voor patiënten met maagkanker. Deze resultaten suggereren dat AZGP1 zou kunnen dienen als een nieuwe voorspeller van de prognose bij maagkanker patiënten na chirurgische resectie.

De moleculaire mechanismen van tumor onderdrukkende eigenschappen AZGP1 zijn nog onduidelijk. AZGP1 behoort tot de macroglobuline familie, een oude en evolutionair behoudende schakel van het immuunsysteem. Zorin NA et al. gesuggereerd dat de capaciteit van macroglobulinen voor binding hydrolasen maakt de remming van enzym gemedieerde tumor invasie mogelijk [30]. Tegelijkertijd, kan een overmaat macroglobuline /hydrolase complexen apoptose [31] te activeren. Hij N et al. gemeld dat AZGP1 ook down-reguleert cycline-afhankelijke kinase, die verantwoordelijk is voor het reguleren van de G2-M transitie een snelheidsbeperkende stap in de celcyclus. Dit suggereert dat AZGP1 een rol ter verhindering tumorprogressie [32] indirect speelt. AZGP1 werd voorgesteld als een tumor suppressor bij alvleesklierkanker door Kong B. et al. Hun studie suggereerde dat de AZGP1 gen induceert mesenchymale naar epitheliale transdifferentiatie door remming van TGF-b ERK gemedieerde signalering [20]. De functionele rol en mechanismen van AZGP1 bij maagkanker nodig verder onderzoek.

Tenslotte onderzochten we eerst de expressieniveaus en prognostische waarde van AZGP1 in primaire maagkanker in deze studie. Onze studie resultaten suggereerden dat AZGP1 kunnen dienen als een kandidaat tumor suppressor en prognostische biomarker in primaire maagkanker en zijn een mogelijk doelwit voor therapeutische interventie; Echter, de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de regulatie van AZGP1 bij maagkanker warrants verder onderzoek.

Verklaring Ethiek Materialen en methoden

Dit onderzoek werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Sun Yat-sen University Cancer Center, en schriftelijke toestemming is verkregen van elke patiënt die betrokken zijn bij het onderzoek.

Human Tissue Sample s

Een totaal van 35 gepaarde kankercellen en afgestemd aangrenzende noncancerous maagslijmvlies weefsels werden verzameld van maagkanker patiënten die gastrectomie bij Sun Yat-sen University Cancer Center van 2010 tot 2011. Na de chirurgische resectie werden de verse weefsels onmiddellijk ondergedompeld in RNAlater (Ambion, Inc., USA) om te voorkomen dat RNA degradatie, bewaard bij 4 ° C gedurende de nacht grondige penetratie van RNAlater penetratie in het weefsel en vervolgens ingevroren bij -80 ° C tot de RNA en eiwit extractie werd uitgevoerd. Een andere 248 in paraffine ingebedde primaire maagcarcinoom monsters die verzameld waren tussen 2005 en 2007 werden verkregen van de Sun Yat-sen University Cancer Center. Geen van deze patiënten had radiotherapie of chemotherapie kregen voorafgaande aan operatie. De histopathologische type en het stadium van de maagkanker werden bepaald op basis van de criteria van de World Health Organization classificatie en de TNM stadium door de Unie voor Internationale Kanker Controle.

Extraction van Total RNA en real-time kwantitatieve RT-PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) volgens het protocol van de fabrikant. Het totale RNA-concentratie werd bepaald door het meten van absorptie bij 260 nm met een spectrofotometer NANO DROP (ND-1000, Thermo Scientific, USA). Reverse transcriptie (RT) het synthetiseren van de eerste streng van cDNA werd uitgevoerd onder toepassing van 2 pg totaal RNA behandeld met M-MLV reverse transcriptase (Promega, USA) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Het resulterende cDNA werd daarna onderworpen aan real-time kwantitatieve RT-PCR voor de evaluatie van de relatieve niveaus van mRNA AZGP1 en GAPDH (glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase, als interne controle) met de volgende primers: AZGP1 forward: 5'-GGAAGCAGGACAGCCAACTT -3 'en reverse: 5'-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3'; GAPDH forward: 5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ', en reverse: 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'. Genspecifieke amplificatie werd uitgevoerd met een ABI 7900HT real-time PCR systeem (Life Technologies, Carlsbad, California, USA) met een 15 pl PCR-mengsel dat 0,5 pi cDNA, 7,5 ul 2 x SYBR Green master mix (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) en 200 nM van de geschikte oligonucleotideprimers. Het mengsel werd voorverwarmd tot 95 ° C (10 min) en vervolgens versterkt bij 95 ° C (30 sec) en 60 ° C (1 min) gedurende 45 cycli. De resolutie curve gemeten bij 95 ° C gedurende 15 sec, 60 ° C gedurende 15 sec en 95 ° C gedurende 15 sec. De Ct (cyclus drempelwaarde) van elk monster werd berekend uit de drempel cycli met het instrument software (SDS 2,3) en de relatieve expressie van mRNA AZGP1 werd genormaliseerd tot de waarde GAPDH. De gegevens werden geanalyseerd met de vergelijkende drempelcyclus (2 ^{-ΔCt) werkwijze de volgende formule: relatieve expressieniveau = 2 -ΔCt = 2 -CT (GAPDH) - 2 -CT (AZGP1), waarin Ct (GAPDH): de Ct-waarde van GAPDH en Ct (AZGP1): de Ct-waarde van AZGP1.}

Western vlekanalyse

de gehomogeniseerde maagkanker monsters, waaronder tumor en nontumor weefsels werden gelyseerd in RIPA lysisbuffer, en de lysaten werden gedurende 30 minuten geoogst door centrifugatie (12.000 rpm) bij 4 ° C. Ongeveer 20 ug eiwit werden vervolgens gescheiden door elektroforese in een 12% natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel en overgebracht op een polyvinylideenfluoride membranen. Na het blokkeren van de niet-specifieke bindingsplaatsen voor 60 min met 5% magere melk werden de membranen gedurende de nacht geïncubeerd bij 4 ° C met een monoklonaal antilichaam tegen konijn AZGP1 (PTG Company, USA, op 1:200 verdunning). De membranen werden vervolgens drie keer gewassen met TBST (Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween-20) gedurende 10 min en geprobed met het mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerde geit anti-konijn IgG antilichaam (Immunology Consultants Laboratory, USA, op 1: 2000 verdunning) bij 37 ° C gedurende 1 uur. Na drie wassen werden de membranen ontwikkeld door een versterkte chemoluminescentie systeem (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA). De band intensiteit werd gemeten door densitometrie met de Quantity One software (Bio-Rad Laboratories, Hercules Inc., CA, USA). De eiwitniveaus werden genormaliseerd aan die van GAPDH gedetecteerd met een muizen anti-humaan GAPDH monoklonaal antilichaam (Kang Chen Shanghai, China, bij een 1:10000 verdunning).

Immunohistochemische analyse

De weefselsecties werden van paraffine ontdaan en gerehydrateerd met xyleen tot 100%, 95%, 90%, 80% en 70% ethanol. Na drie wassingen in PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing), werden de objectglaasjes gekookt in antigeenterugtrekking buffer die 0,01 M natriumcitraat-zoutzuur (pH = 6,0) gedurende 15 min in een magnetron. Na spoelen met PBS werden de weefselcoupes geïncubeerd met het primaire antilichaam en de glasplaatjes werden daarna gespoeld in 3% quenching peroxidase oplossing (Invitrogen) om endogeen peroxidase te blokkeren. De coupes werden vervolgens geïncubeerd met een konijn monoklonaal antilichaam tegen AZGP1 (PTG Company, USA, op 1:200 verdunning) bij 4 ° C geïncubeerd en vervolgens geïncubeerd met mierikswortel peroxidase (HRP) (DAKO ChemMateTM enVision Detection Kit) bij kamertemperatuur 30 minuten. Na wassen in PBS, werd de visualisatie signaal ontwikkeld met 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) oplossing, en alle objectglaasjes werden tegengekleurd met hematoxyline. Als negatieve controles werden aangrenzende secties verwerkt zoals hierboven beschreven, behalve dat ze gedurende de nacht geïncubeerd bij 4 ° C in blokkerende oplossing zonder het primaire antilichaam.

De monsters werden geanalyseerd door drie waarnemers (Chunyu Huang, Lin Lv, en Jingjing Zhao) die waren blind voor de klinische resultaten van de patiënten. Verschillen tussen de waarnemers in minder dan 10% van de onderzochte glijbanen en een consensus bereikt na verdere beoordeling. De totale AZGP1 immunokleuring score werd berekend als de som van het percentage positiviteit (het percentage van de positief gekleurde tumorcellen) en de kleuringsintensiteit. Het percentage positiviteit werd gescoord als "0" (< 5% negatief), "1" (5-25%, sporadische), "2" (25-50%, focale), of "3" (> 50 %, diffuse). De kleuringsintensiteit werd gescoord als "0" (geen kleuring), "1" (zwak gekleurd), "2" (matig gekleurd), of "3" (sterk gekleurd). De totale AZGP1 immunokleuring score varieerde van 0 tot 9. We definieerde de AZGP1 expressie niveaus als volgt: "-" voor een score van 0-1, "+" voor een score van 2-3, die werden gedefinieerd als laag meningsuiting; "++" Voor een score van 4-6, en "+++" voor een score >. 6, die zo hoog expressie werden gedefinieerd

Follow-Up

De postoperatieve follow -up werd uitgevoerd in onze polikliniek en inclusief klinisch onderzoek en laboratoriumtests om de 3 maanden voor de eerste 2 jaar, elke 6 maanden in het derde tot en met vijfde jaar, en jaarlijks voor nog eens 5 jaar of tot overlijden van de patiënt, wat het eerst optrad. Overall survival, die werd gedefinieerd als de tijd van de transactie die de dood van de patiënt of de laatste follow-up werd gebruikt als maat voor de prognose. Er waren ongeveer 4% patiënten verloren follow-up.

Statistische analyse

A-gepaarde T-toets werd gebruikt om de mRNA niveaus AZGP1 vergelijken de tumorweefselmonsters en aangrenzende niet- tumorweefselmonsters. De χ
^{2 test voor proportie en Pearson's correlatie coëfficiënten werden gebruikt om de relatie tussen AZGP1 expressie en diverse klinisch-pathologische kenmerken te analyseren. Totale overleving werden berekend met de Kaplan-Meier-methode en werden geanalyseerd met de log-rank test. Cox proportionele hazard analyse werd gebruikt voor univariate en multivariate analyse om het effect van klinisch-pathologische variabelen en AZGP1 uitdrukking op overleving te verkennen. Een tweezijdige P
-waarde < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS-software (versie 17.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA).}

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
Immunohistochemische detectie van de AZGP1 eiwitexpressie bij maagkanker weefsel. De positieve expressie van AZGP1 werd gelokaliseerd in het cytoplasma
doi:. 10.1371 /journal.pone.0069155.s001
(TIF)

• PLoS ONE: Afname van miR-202-3p Expression, een nieuwe tumor suppressor, in Maag Cancer
• PLoS ONE: Een nieuwe onderverdeling van pT4 maagkanker Volgens de breedte van serosale Invasion