PLOS ONE: diminution de l'expression de AZGP1 est associée à un mauvais pronostic à la Primaire gastrique Cancer

Résumé

Contexte

2-zinc-glycoprotéine 1 (AZGP1) est une protéine multidisciplinaire qui participe à de nombreux des fonctions importantes dans le corps humain, y compris la fécondation, l'immunorégulation et la mobilisation des lipides. Récemment, il a été démontré que AZGP1 est également impliquée dans la carcinogenèse et la différenciation de la tumeur. Dans cette étude, nous avons étudié les niveaux d'expression et de la valeur pronostique de AZGP1 dans les cancers gastriques primaires.

Méthodes et résultats

Nous avons examiné l'expression de AZGP1 chez 35 jumelés muqueuse gastrique noncancerous adjacente cancéreuse et appariés les tissus en temps réel RT-PCR quantitative (qRT-PCR) et transfert western. En outre, nous avons analysé l'expression de AZGP1 dans 248 patients qui ont subi des procédures de résection entre 2005 et 2007 par immunohistochimie. Les relations entre les niveaux d'expression de AZGP1, les facteurs clinicopathologiques et la survie des patients ont été étudiés. l'expression AZGP1 était significativement réduite à la fois l'ARNm ( P
= 0,023) et taux de protéines ( P
= 0,019) dans des échantillons de tissu tumoral, par rapport à l'expression dans des échantillons appariés de tissu non tumorales adjacentes . Les données de coloration immunohistochimique a montré que l'expression de AZGP1 a été significativement diminuée chez 52,8% (131/248) des cas d'adénocarcinome gastrique. analyse clinicopathologique a montré que l'expression réduite de AZGP1 était significativement corrélé avec l'emplacement de la tumeur ( P
= 0,011), le grade histologique ( P
= 0,005) et le stade T ( P
= 0,008). Les courbes de survie de Kaplan-Meier a révélé que l'expression réduite de AZGP1 était associée à un mauvais pronostic chez les patients atteints d'un adénocarcinome gastrique ( P
= 0,009). Multivariée Cox analyse identifié AZGP1 expression était un facteur pronostique indépendant pour la survie globale des patients atteints d'adénocarcinome gastrique (HR = 1,681, IC à 95% = 1,134 à 2,494, P
= 0,011).

Conclusions

Notre étude suggère que AZGP1 pourrait servir comme un suppresseur de tumeur candidat et un biomarqueur pronostique potentiel dans la carcinogenèse gastrique

Citation:. Huang Cy, Zhao Jj, Lv L, Chen Yb, Li Yf, Jiang Ss et al. (2013) diminution de l'expression de AZGP1 est associée à un mauvais pronostic dans le cancer gastrique primaire. PLoS ONE 8 (7): e69155. doi: 10.1371 /journal.pone.0069155

Editeur: Alfons Navarro, Université de Barcelone, Espagne

reçues: 5 Mars 2013; Accepté 5 Juin 2013; Publié le 23 Juillet, 2013 |

Droit d'auteur: © 2013 Huang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenu par le Fonds de doctorat du ministère de l'Education de Chine (20100171110084). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est la deuxième cause la plus fréquente de la mortalité liée au cancer dans le monde, avec 988.000 nouveaux cas et 736.000 décès par an [1] - [2]. En Chine, le cancer gastrique a été prévu pour être le troisième cancer le plus commun en 2005 avec 0,4 millions de nouveaux cas et 0,3 million de décès déclarés [3]. Le traitement du cancer gastrique comprend une combinaison de chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie. Mais près de 60% des patients atteints succombent à un cancer gastrique après une résection curative seule ou après une résection curative avec un traitement adjuvant ultérieur [4]. Le cancer gastrique est une maladie hétérogène à la fois l'histologie et de la génétique; par conséquent, les résultats des patients est difficile de prévoir l'utilisation des classifications histologiques classiques. carcinogenèse gastrique est un processus multifactoriel et en plusieurs étapes qui implique l'activation des oncogènes et gènes inactivant suppresseurs de tumeurs à différents stades de la progression du cancer gastrique. Récemment, plusieurs nouvelles oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs associées au cancer de l'estomac ont été identifiés. Par conséquent, il est cliniquement important de trouver de nouvelles cibles efficaces pour le diagnostic précoce et un traitement efficace du cancer de l'estomac.

AZGP1 (2-zinc-glycoprotéine 1, Zn-alpha-2-glycoprotéine) est une protéine soluble de 41 kDa avec un complexe majeur d'histocompatibilité-1 (MHC-1) -comme pli dans sa structure, et il a été initialement identifié et purifié dans le sérum humain en 1961 [5]. Le gène codant pour AZGP1, cédé au chromosome 7q22.1 par hybridation fluorescente caryotype, est composé de quatre exons et trois introns [6], [7]. En utilisant des études immunohistochimiques, il a été constaté que AZGP1 est exprimé principalement dans les cellules épithéliales du sein, de la prostate, du foie et d'autres organes gastro-intestinaux [8]. Conformément à sa production par les cellules épithéliales sécrétoires, AZGP1 se trouve dans un certain nombre de fluides corporels [9], [10], [11].

AZGP1 est une protéine multidisciplinaire qui participe à de nombreuses fonctions importantes dans le corps humain, y compris la fécondation [11], immunorégulation [12] et la mobilisation des lipides [13], [14], [15]. AZGP1 est également associée à la cachexie cancéreuse. AZGP1 a un niveau élevé d'homologie de séquence amino-acide avec un lipide en mobilisant le facteur tumoral dérivé [14] et dans un modèle murin de tumeurs AZGP1 productrices AZGP1 a stimulé la lipolyse dans les adipocytes conduisant à la cachexie [16]. Récemment, il a été démontré que AZGP1 est également impliquée dans la carcinogenèse et la différenciation de la tumeur. De protéines et d'expression de l'ARNm des essais ont montré une relation entre les niveaux de AZGP1 et le grade histologique des tumeurs du cancer du sein [17], [18]. De plus, de nombreuses études suggèrent que AZGP1 est un marqueur sérique potentiel du cancer de la prostate [9], [19]. En outre, il a été démontré que AZGP1 agit comme un suppresseur de tumeur nouveau dans le cancer du pancréas [20]. Cependant, jusqu'à présent le statut d'expression de AZGP1 et la valeur pronostique de cette protéine dans les cancers gastriques primaires n'a été signalée.

Dans cette étude, nous avons analysé le niveau d'expression de AZGP1 dans les cancers gastriques en utilisant en temps réel RT quantitative -PCR (qRT-PCR), western blot et immunohistochimie. En outre, nous avons identifié la relation entre l'expression de AZGP1 et les caractéristiques clinico de cancer de l'estomac, et nous avons évalué la valeur pronostique de l'expression AZGP1 pour la survie post-résection des patients atteints de cancer de l'estomac.

Résultats

AZGP1 expression de l'ARNm analysé avec
qRT-PCR

Les niveaux de transcription de AZGP1 ont été déterminées par des tests qRT-PCR en utilisant des 35 paires d'échantillons de résection (échantillons de tissus tumoraux et différents échantillons de tissus non tumoraux adjacents) provenant de patients atteints de cancer gastrique. Les niveaux d'ARNm AZGP1 ont été réduits de manière significative dans les échantillons 28 (80%) des tissus de la tumeur par rapport aux échantillons de tissus non-tumeur adjacents appariés ( P
= 0,023, figure 1).

AZGP1 Expression Analysé par Western blot

les teneurs en protéines de AZGP1 dans les échantillons de cancer gastrique réséquées ont été déterminées par transfert de Western. Les résultats montrent une bande de 41 kDa à AZGP1, et la quantité de protéine présente AZGP1 a été mesurée par densitométrie et la hauteur. Cohérentes avec les résultats qRT-PCR, une diminution de l'expression de AZGP1 a été observée chez 25 (71,4%) des tissus tumoraux gastriques par rapport aux tissus non tumoraux adjacents appariés ( P
= 0,019, figure 2A). Huit paires de tissus tumoraux gastriques représentatifs et les tissus non-tumorales appariées adjacentes ont été présentés à la figure 2B.

Analyse immunohistochimique de AZGP1 Expression dans des échantillons de tissus du cancer gastrique et sa relation avec le clinicopathologique Caractéristiques

afin de confirmer les résultats de biologie moléculaire et d'enquêter sur les clinicopathologiques les rôles pronostiques de l'expression AZGP1, nous avons effectué une analyse immunohistochimique dans 248 sections de cancer gastrique paraffine. L'expression positive de AZGP1 a été localisée dans le cytoplasme (Figure S1). Parmi les échantillons de cancer gastrique 248, 117 (47,2%) ont montré l'expression de AZGP1 élevé (AZGP1 ++ ou AZGP1 +++), alors que les 131 cas restants (52,8%) affiché à faible AZGP1 expression (AZGP1- ou AZGP1 +) (Figure 3, Tableau 1). tissus gastriques normaux ont montré la coloration positive la plus forte de AZGP1 (figure 3A).

Sur la base des catégories que nous avons définies dans les méthodes précités, les données ont montré que la faible expression de AZGP1 était significativement corrélé avec l'emplacement de la tumeur ( P
= 0,011), le grade histologique ( P
= 0,005) et le stade T ( P
= 0,008), mais pas avec l'âge, le sexe, la taille de la tumeur, la résection radicale , le statut ganglionnaire (stade N) ou le statut de métastases (stade M). Les micrographies sont présentés dans la figure 3.

Corrélation entre AZGP1 Expression Basé sur immunohistochimie et Survie des patients

La durée médiane de survie des 248 patients atteints de cancer gastrique était de 45 mois (extrêmes 2-89 mois) . Le taux de survie globale et le taux de survie à 5 ans ont été significativement améliorés dans le groupe d'expression haute AZGP1 que le groupe faible expression [64,2% contre 49,5% (taux de survie globale) et 65,1% contre 50,4% (taux de survie à 5 ans), respectivement, P
= 0,009, Figure 4].

univariée et multivariée analyses

univariée et analyses multivariées ont été réalisées pour comparer l'impact de l'expression de AZGP1 et d'autres paramètres clinicopathologiques sur pronostic. Basé sur une analyse univariée qui comprenait les 248 patients, 8 facteurs se sont avérés avoir des associations statistiquement significatives avec la survie globale. Cette analyse a pris les facteurs suivants en considération: l'emplacement de la tumeur, la taille de la tumeur, le grade histologique, les niveaux d'expression de AZGP1, stade TNM (classification TNM 7e édition) et si une résection radicale a été effectuée ou non (tableau 2). Tous les 8 facteurs ont été inclus dans un multivariée de Cox modèle des risques proportionnels pour ajuster les effets des covariables. Sur la base de ce modèle, l'emplacement de la tumeur, les niveaux d'expression AZGP1, stade T et N stade de la tumeur ont été confirmés comme des facteurs pronostiques indépendants (tableau 2).

Discussion

Le cancer gastrique reste l'un des les tumeurs malignes humaines les plus meurtrières. Même avec les progrès dans le diagnostic et la thérapie, le pronostic pour le cancer gastrique est toujours lamentable [1], [21]. Le résultat clinique du cancer gastrique dépend d'une série de caractéristiques de la tumeur, tels que la croissance tumorale, la différenciation, l'invasion et les métastases à distance, qui sont régies par une variété de gènes apparentés. Par conséquent, il est généralement considéré que des altérations génétiques conduisant à l'activation d'oncogènes et l'inactivation de gènes suppresseurs de tumeur sont les causes sous-jacentes de la pathogenèse du cancer. Le gain séquentiel des oncogènes et la perte de suppresseurs de tumeurs fournissent les bases nécessaires à la progression graduelle des tumeurs solides de l'initiation à la transformation et la progression tumorale [22], [23], [24]. Auparavant, AZGP1 a été signalé comme possédant des propriétés suppressives de tumeur dans le cancer du sein, le cancer de la prostate, le cancer du pancréas et d'autres tumeurs malignes [17], [20], [25]; toutefois le rôle de AZGP1 dans le cancer gastrique primaire n'a pas encore été évalué. Notre étude a révélé que l'expression de AZGP1 était significativement réduite à la fois les taux d'ARNm et de protéines dans des échantillons de tissu tumoral, par rapport à l'expression dans des échantillons appariés de tissu non tumorales adjacentes. Conformément à notre étude, Brysk MM et al. ont également démontré que les niveaux sont plus élevés AZGP1 dans des tissus normaux par voie orale que par voie orale tumeurs [26]. Gagnon S et al. a également prouvé que AZGP1 était présent dans les glandes hyperplasiques bénignes dans 91,1% des cas, mais dans seulement 40,7% (composante peu différencié) à 48,5% (bien composante différenciée) des adénocarcinomes prostatiques et seulement 8% des métastases [27]. Ces résultats d'études soutiennent l'hypothèse que AZGP1 peut servir comme un gène suppresseur de tumeur dans certains cancers.

Afin de valider cette réduction de l'expression de AZGP1 dans le cancer gastrique primaire, nous avons effectué une analyse immunohistochimique avec un anticorps anti-hAZGP1 lapin. Nous avons observé l'expression inférieure de AZGP1 immunocoloration dans le cancer gastrique proximal ou totale par rapport aux tissus de cancer gastrique lointains. Certaines études ont démontré que les patients atteints de cancer de l'estomac proximal ont une survie pire que les patients atteints de cancer gastrique éloignés [28]. Ces données suggèrent que la faible expression de AZGP1 dans le cancer gastrique est associé à plusieurs phénotypes malins. En outre, nous avons découvert que la diminution de l'expression de AZGP1 a été associée à des adénocarcinomes mal différenciées (G3 par rapport G1 /G2), indiquant que AZGP1 peut induire la différenciation d'un cancer gastrique. Ces résultats sont cohérents avec les conclusions de Diez et al. [17], [18] qui a décrit une association entre l'expression de AZGP1 élevé et des niveaux élevés de différenciation dans le cancer du sein. Des résultats similaires ont également été rapportés pour le cancer de la prostate [19], le cancer du sein et le cancer du pancréas [26]. En outre, nous avons détecté que la faible expression de AZGP1 était associée à une étape de T avancé. Ces résultats impliquent que la faible expression de AZGP1 peut favoriser la croissance tumorale. Conformément à notre étude, Irmak S et al. a suggéré que AZGP1 est liée au développement d'un cancer superficiel de la vessie et sa transformation en un phénotype invasif [29]. Ces résultats indiquent collectivement un rôle important pour AZGP1 dans la différenciation et la croissance du cancer de l'estomac.

Utilisation de l'analyse de survie de Kaplan-Meier, les patients dans notre étude avec une expression de faible AZGP1 avaient une survie globale significativement plus courte que celles à haute les niveaux d'expression. Une analyse univariée a montré que la diminution de l'expression de AZGP1 dans les tissus de cancer gastrique était significativement associée avec le taux de survie globale et le taux de survie à 5 ans. L'analyse multivariée a montré que l'expression de AZGP1, ainsi que certains facteurs traditionnels pronostiques tels que l'emplacement de la tumeur, le stade T et N stade, ont été des facteurs de risque indépendants dans le pronostic des patients atteints de cancer gastrique. Ces résultats suggèrent que AZGP1 pourrait servir comme un nouveau facteur prédictif du pronostic chez les patients atteints de cancer gastrique après résection chirurgicale.

Les mécanismes moléculaires de la tumeur propriétés suppressives de AZGP1 sont encore peu claires. AZGP1 appartient à la famille de macroglobuline, un lien ancien et évolutionnaire conservatrice du système immunitaire. Zorin NA et al. a suggéré que la capacité de macroglobulines pour les hydrolases de liaison permet l'inhibition de l'invasion tumorale à médiation enzymatique possible [30]. Dans le même temps, un excès de complexes macroglobuline /hydrolase peut activer l'apoptose [31]. Il N et al. a rapporté que AZGP1 également régule à la baisse kinases cycline-dépendantes, ce qui est responsable de la régulation de la transition G2-M, une étape limitant la vitesse dans le cycle cellulaire. Ceci suggère que AZGP1 joue indirectement un rôle dans la progression tumorale empêchant [32]. AZGP1 a été proposé comme un suppresseur de tumeur dans le cancer du pancréas par Kong B. et al. Leur étude a suggéré que le gène induit AZGP1 mésenchymateuses à épithéliale en inhibant la transdifférenciation ERK TGF-b médiation [20]. Le rôle et les mécanismes fonctionnels de AZGP1 dans le cancer gastrique doivent être étudiées plus.

En conclusion, nous avons d'abord étudié les niveaux d'expression et de la valeur pronostique de AZGP1 dans les cancers gastriques primaires dans cette étude. Nos résultats de l'étude ont suggéré que AZGP1 pourrait servir comme un suppresseur de tumeur candidat et biomarqueur pronostique dans les cancers gastriques primaires et être une cible potentielle pour une intervention thérapeutique; Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation des AZGP1 en bons de souscription de cancer gastrique complément d'enquête.

Matériel et méthodes de

Déclaration

Cette recherche a été approuvé par le comité d'éthique de l'éthique Sun Yat-sen University Cancer Center, et le consentement éclairé écrit a été obtenu à partir de chaque patient participant à l'étude.

Exemple de tissus humains

Un total de 35 apparié cancéreuse et les tissus appariés adjacents noncancerous de la muqueuse gastrique ont été prélevés chez des patients atteints de cancer gastrique subissant une gastrectomie à Sun Yat-sen University Cancer Center de 2010 à 2011. Après la résection chirurgicale, les tissus frais ont été immédiatement immergés dans RNAlater (Ambion, Inc., Etats-Unis) pour éviter dégradation de l'ARN, stocké à 4 ° C pendant une nuit pour permettre une pénétration complète de RNAlater dans le tissu, puis congelé à -80 ° C jusqu'à l'extraction d'ARN et de protéines a été effectuée. Un autre 248 échantillons primaires de carcinome gastrique de paraffine qui avaient été recueillies entre 2005 et 2007 ont été obtenus à partir de l'Université Cancer Center Sun Yat-sen. Aucun de ces patients avaient reçu une chimiothérapie ou une radiothérapie avant la chirurgie. Le type histopathologique et le stade du cancer gastrique ont été déterminées selon les critères de la classification de l'Organisation mondiale de la santé et le stade TNM établi par l'Union internationale contre le cancer.

Extraction de l'ARN total et en temps réel quantitative RT-PCR

ARN total a été extrait à l'aide Trizol (Invitrogen, Carlsbad, Californie, USA) selon le protocole du fabricant. La concentration de l'ARN total a été évaluée en mesurant l'absorbance à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre NANO DROP (ND-1000, Thermo Scientific, États-Unis). Transcription inverse (RT) pour synthétiser le premier brin d'ADNc a été réalisée en utilisant 2 pg d'ARN total traité avec M-MLV transcriptase inverse (Promega, USA) selon les recommandations du fabricant. L'ADNc résultant a alors été soumis à temps réel RT-PCR quantitative pour évaluer les niveaux relatifs d'ARN messager AZGP1 et GAPDH (glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, en tant que contrôle interne) avec les amorces suivantes: AZGP1 en avant: 5'-GGAAGCAGGACAGCCAACTT -3 ', et inverse: 5'-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3'; GAPDH avant: 5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ', et inverse: 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'. l'amplification spécifique du gène a été réalisée à l'aide d'un système de PCR en temps réel ABI 7900HT (Life Technologies, Carlsbad, Californie, Etats-Unis) avec un mélange PCR de 15 pi contenant 0,5 pi d'ADNc, 7,5 pi de 2 x SYBR Green master mix (Invitrogen, Carlsbad, Californie, USA), et 200 nM des amorces oligonucléotidiques appropriées. Le mélange a été préchauffé à 95 ° C (10 min) et ensuite amplifié à 95 ° C (30 sec) et 60 ° C (1 min) pendant 45 cycles. La courbe de résolution a été mesuré à 95 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 15 s et 95 ° C pendant 15 secondes. La valeur Ct (cycle seuil) de chaque échantillon a été calculée à partir des cycles de seuil avec le logiciel de l'instrument (SDS 2.3), et l'expression relative de l'ARNm AZGP1 a été normalisée à la valeur de GAPDH. Les données ont été analysées en utilisant la méthode (2 ^{-ΔCt) que la formule suivante du cycle comparatif de seuil: niveau d'expression relative = 2 -ΔCt = 2 -Ct (GAPDH) - 2 -Ct (AZGP1), dans laquelle Ct (GAPDH), la valeur Ct de GAPDH et Ct (AZGP1) signifie que la valeur Ct de AZGP1.}

Analyse Western Blot

les échantillons de cancer gastrique homogénéisées, y compris des tissus tumoraux et non tumorales, ont été lysées dans un tampon de lyse RIPA, et les lysats ont été récoltées par centrifugation (12 000 tours par minute) à 4 ° C pendant 30 min. Environ 20 ug d'échantillons de protéine ont ensuite été séparés par électrophorèse dans un gel à 12% de sulfate de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium et on les transfère sur une membrane de fluorure de polyvinylidène. Après blocage des sites de liaison non spécifiques pendant 60 minutes avec 5% de lait non gras, les membranes ont été incubées pendant une nuit à 4 ° C avec un anticorps monoclonal de lapin contre AZGP1 (PTG Company, États-Unis, à une dilution 1:200). Les membranes ont ensuite été lavées trois fois avec du TBST (solution saline tris-tamponnée avec du Tween-20) pendant 10 minutes et sondées avec la peroxydase de raifort (HRP) d'anticorps anti-IgG de lapin conjugué à la chèvre (Immunology Consultants Laboratory, États-Unis, à un 1: 2000 dilution) à 37 ° C pendant 1 heure. Après trois lavages, les membranes ont été développées par un système de chimioluminescence amélioré (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, États-Unis). L'intensité de la bande a été mesurée par densitométrie en utilisant le logiciel Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, USA). Les teneurs en protéines ont été normalisées à celle de GAPDH détectée en utilisant un anticorps de souris monoclonal anti-GAPDH humain (Shanghai Kangchen, en Chine, à une dilution 1:10000).

Analyse immunohistochimique

coupes tissulaires ont été déparaffinées avec diméthylbenzène et réhydratée à 100%, 95%, 90%, 80% et 70% d'éthanol. Après trois lavages dans du PBS (solution saline tamponnée au phosphate), les lames ont été bouillis dans du tampon d'extraction d'antigène contenant 0,01 M de citrate de sodium-acide chlorhydrique (pH = 6,0) pendant 15 min dans un four à micro-ondes. Après un rinçage avec du PBS, les coupes de tissu ont été incubées avec l'anticorps primaire et les lames ont ensuite été rincées dans une solution de peroxydase de trempe de 3% (Invitrogen) pour bloquer la peroxydase endogène. Les sections ont ensuite été incubées avec un anticorps monoclonal de lapin contre AZGP1 (PTG Company, États-Unis, à une dilution 1:200) à 4 ° C pendant une nuit, puis mis en incubation avec la peroxydase de raifort (HRP) (Kit ChemMateTM DAKO EnVisionTM de détection) à température ambiante 30 minutes. Après lavage dans du PBS, le signal de visualisation a été développé avec 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) solution, et toutes les diapositives ont été contre l'hématoxyline. En tant que témoins négatifs, des coupes adjacentes ont été traitées comme décrit ci-dessus, sauf qu'ils ont été incubées pendant une nuit à 4 ° C dans une solution de blocage sans anticorps primaire.

Les échantillons ont été analysés par trois observateurs (Tchouenyu Huang, Lin Lv, et Jingjing Zhao) qui ont été aveuglés à des résultats cliniques des patients. Les écarts entre les observateurs ont été trouvés dans moins de 10% des lames examinées, et un consensus a été atteint après un examen plus approfondi. Le score total AZGP1 immunomarquage a été calculé comme la somme de la positivité pour cent (le pourcentage de cellules tumorales colorées positivement) et l'intensité de la coloration. La positivité pour cent a été marqué comme "0" (< 5%, négative), "1" (5-25%, sporadiques), "2" (25-50%, focale), ou "3" (> 50 %, diffus). L'intensité de la coloration a été marqué comme "0" (pas de coloration), "1" (faiblement teinté), "2" (modérément tachée), ou "3" (fortement colorées). Le AZGP1 score total immunocoloration variait de 0 à 9. Nous les niveaux d'expression de AZGP1 défini comme suit: "-" pour un score de 0-1, "+" pour un score de 2-3, qui ont été définis comme une faible expression; "++" Pour un score de 4-6, et "+++" pour un score >. 6, qui ont été définis comme une expression élevée

Suivi

Le suivi post-opératoire -up a été effectuée à notre service de consultations externes et inclus des examens cliniques et de laboratoire tous les 3 mois pour les 2 premières années, tous les 6 mois au cours de la troisième à la cinquième année, et chaque année pour une période supplémentaire de 5 ans ou jusqu'à ce que la mort du patient, selon la première occurrence. La survie globale, qui a été défini comme le temps de l'opération à la mort du patient ou le dernier suivi, a été utilisé comme une mesure de pronostic. Il y avait environ 4% des patients ont perdu suivi.

Analyse statistique

A-échantillons appariés t-test a été utilisé pour comparer les niveaux d'ARNm AZGP1 dans les échantillons de tissu tumoral et la non adjacente des échantillons de tissu tumoral. Le χ
^{2 test pour la proportion et les coefficients de corrélation de Pearson ont été utilisés pour analyser la relation entre l'expression de AZGP1 et les diverses caractéristiques clinico. courbes de survie globale ont été calculés avec la méthode de Kaplan-Meier et ont été analysés avec le test du log-rank. Cox analyse des risques proportionnels a été utilisé pour l'analyse univariée et multivariée pour explorer l'effet des variables clinicopathologiques et d'expression de AZGP1 sur la survie. A deux côtés P
-value < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel SPSS (version 17.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA).}

Informations complémentaires
Figure S1. Le plus détection immunohistochimique de l'expression de la protéine AZGP1 dans un tissu de cancer gastrique. L'expression positive de AZGP1 a été localisée dans le cytoplasme
doi:. 10.1371 /journal.pone.0069155.s001
(TIF)

• PLOS ONE: Diminution de l'expression miR-202-3p, un suppresseur de tumeur Novel, dans le cancer gastrique
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