PLoS ONE: sumažėjęs išraiška AZGP1 asocijuojasi su prasta prognoze Pirminis Skrandžio Cancer

Anotacija

Fonas

2-cinko-glikoproteino 1 (AZGP1), yra įvairių baltymų, kad dalyvauja daug svarbių funkcijų žmogaus organizme, įskaitant tręšimo, imunoreguliacija ir lipidų mobilizaciją. Pastaruoju metu ji buvo įrodyta, kad AZGP1 taip pat dalyvauja kancerogenezėje ir naviko diferenciacijos. Šiame tyrime mes ištirti raiškos lygius ir prognostinę vertę AZGP1 pradinėse skrandžio vėžio.

Metodai ir rezultatai

išnagrinėjo AZGP1 išraišką 35 suporuotas vėžio ir suderinti šalia noncancerous skrandžio gleivinę audiniai pagal realaus laiko kiekybine RT-PCR (KRL-PGR) ir Imunoblotingo. Be to, mes analizuojami AZGP1 išraišką 248 pacientų, kuriems buvo atlikta rezekcija procedūras tarp 2005 ir 2007 m naudojant imunohistocheminis. Skirtumai tarp AZGP1 ekspresijos lygio santykiai, buvo tiriamos klinikos veiksniai, ir pacientas išlikimo. AZGP1 išraiška buvo žymiai sumažintas tiek mRNR ( P
= 0,023) ir baltymų kiekis ( P
= 0,019) naviko audinių mėginių, palyginti su išraiška suderintų gretimų ne vėžinių audinių mėginių , Į imunohistocheminį dažymo duomenys parodė, kad AZGP1 išraiška buvo žymiai sumažėjo 52,8% (131/248) skrandžio adenokarcinoma atvejais. Klinikos analizė parodė, kad sumažintas išraiška AZGP1 reikšmingai koreliavo su naviko vietą ( P
= 0,011), histologinio laipsnio ( P
= 0,005) ir T etape ( p
= 0,008). Kaplan-Meier išgyvenimo kreivės parodė, kad sumažintos išraiška AZGP1 buvo susijęs su blogos prognozės skrandžio adenokarcinoma sirgusių pacientų ( P
= 0,009). Daugiamatė Cox analizė nustatė AZGP1 išraiška buvo nepriklausoma prognostinis faktorius bendro išgyvenamumo skrandžio adenokarcinoma sirgusių pacientų (RS = 1.681, 95% PI = 1.134-2.494 P
= 0,011).

Išvados

Mūsų tyrimas rodo, kad AZGP1 gali tarnauti kaip kandidatas naviko slopintuvas ir galimo prognostinį biologinis į skrandžio kancerogenezėje

nurodomoji dalis:. Huang CY, Zhao Jj, LV L Chen Yb Li YF Jiang ss, ir kt., (2013) Sumažėjęs išraiška AZGP1 asocijuojasi su prasta prognoze pirminis navikas. PLoS ONE 8 (7): e69155. Doi: 10,1371 /journal.pone.0069155

redaktorius: Alfons Navarro Barselonos universitetas, Ispanija

Įstojo: Kovo 5, 2013 m Priėmė: Birželis 5, 2013 m Paskelbta: Lie 23, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Huang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė daktaro fondo švietimo ministerija Kinijos (20100171110084). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra antra labiausiai paplitusi priežastis, dėl vėžio susijusio mirtingumo visame pasaulyje, su 988,000 naujų atvejų ir 736,000 mirčių per metus [1] - [2]. Kinijoje, skrandžio vėžys buvo prognozuojama, kad bus trečias labiausiai paplitęs vėžio 2005 0,4 milijonai naujų ligos atvejų ir 0,3 mln mirčių pranešė [3]. Skrandžio vėžio gydymas apima chirurgija, chemoterapija, ir spindulinės terapijos derinys. Tačiau beveik 60% nukentėjusių pacientų pasiduoti skrandžio vėžio po vien, gydomojo rezekcija arba po gydomojo rezekcija su vėlesniais palaikomąja terapija [4]. Skrandžio vėžys yra nevienalytė liga tiek histologiją ir genetika; vadinasi, pacientas rezultatas yra sunku prognozuoti, naudojant klasikinius histologinius klasifikacijas. Skrandžio Kancerogeninis yra daugiaveiksnė ir daugiapakopį procesą, kuris apima aktyvuoti onkogenų ir nukenksminti auglio slopinamojo genus skirtingose ​​stadijose skrandžio vėžio progresavimą. Neseniai buvo nustatyta keletas naujų Onkogeny ir naviko slopintuvas genų, susijusių su skrandžio vėžiu. Todėl kliniškai svarbu rasti veiksmingus naujus tikslus už ankstyvą diagnostiką ir veiksmingą gydymą skrandžio vėžio.

AZGP1 (2-cinko-glikoproteino 1, Zn-alfa 2-glikoproteino) yra 41 kDa tirpus baltymas su pagrindinių histosuderinamumo kompleksas-1 (MHC-1) -kaip įmaišykite jo struktūrą, ir jis iš pradžių buvo nustatyti ir išgrynintas nustatymui žmogaus serume 1961 [5]. Už AZGP1 genas, skiriamas chromosomą 7q22.1 per liuminescencinio hibridizacijos kariotipavimas, susideda iš keturių egzonų ir trijų intronai [6], [7]. Imunohistocheminės mokytis, ji buvo nustatyta, kad AZGP1 iš esmės išreiškiamas epitelio ląstelių krūties, prostatos, kepenų ir įvairių kitų virškinimo trakto organų [8]. Laikydamasi savo gamybą sekrecijos epitelio ląstelių, AZGP1 randamas kūno skysčiais skaičius [9], [10], [11].

AZGP1 yra įvairių sričių baltymas, kuris dalyvauja daugelyje svarbių funkcijų žmogaus organizmas, įskaitant trąšų [11], imunoreguliacija [12] ir lipidų mobilizacijos [13], [14], [15]. AZGP1 taip pat siejamas su vėžio išsekimo. AZGP1 turi aukšto lygio amino rūgščių sekos Homologijos su naviko kilmės lipidų mobilizuojančiu faktorius [14], ir pelės modelio AZGP1 gaminančių navikų, AZGP1 skatino lipolizę ir adipocituose vedančių į išsekimo [16]. Pastaruoju metu ji buvo įrodyta, kad AZGP1 taip pat dalyvauja kancerogenezėje ir naviko diferenciacijos. Baltymai ir iRNR raiška tyrimai parodė ryšį tarp AZGP1 lygių ir histologinis laipsnio krūties vėžio navikų [17], [18]. Be to, daug tyrimų rodo, kad AZGP1 yra potencialus serumas žymeklis prostatos vėžio [9], [19]. Be to, buvo įrodyta, kad AZGP1 aktus kaip naują naviko slopintuvas kasos vėžiu [20]. Tačiau nebuvo pranešta šiol sąvoka statusas AZGP1 ir prognozinė vertė šio baltymo pradinėse skrandžio vėžio.

Šiame tyrime mes išanalizavo AZGP1 išraiška lygį skrandžio vėžio naudojant realaus laiko kiekybine RT -PCR (KRL-PGR), imunoblotingu ir imunohistocheminis. Be to, mes nustatyti tarp AZGP1 išraiškos ir klinikos ypatybių skrandžio vėžio ryšį, o mes įvertino prognostinę vertę AZGP1 saviraiškos po rezekcija išlikimo skrandžio vėžiu sergantiems pacientams.

Rezultatai

AZGP1 iRNR raiška analizuojama KRL-PGR

transkripcijos lygiai AZGP1 buvo nustatyta su KRL-PGR, naudojant 35 porų rezekcijos egzempliorių (naviko audinių pavyzdžius ir suderintų gretimų ne vėžinių audinių mėginiai) nuo skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Į AZGP1 iRNR koncentracija buvo žymiai sumažintas 28 (80%) naviko audinių mėginių, palyginti su suderintų gretimų ne vėžinių audinių mėginių ( P
= 0,023, 1 pav.)

AZGP1 išraiška Analizuojama Vakarų sugeriamojo

AZGP1 baltymų kiekiai iš rezekcijos skrandžio vėžio mėginiuose buvo nustatyti Imunoblotingo. Rezultatai parodė, juostelė AZGP1 41 kDa, ir AZGP1 baltymų, esančių suma buvo matuojamas pagal densitometrija ir aukščio. Suderinamas su KRL-PGR rezultatus, A AZGP1 išraiška, mažėjo 25 (71,4%) iš skrandžio navikų audiniuose, palyginti su suderintų gretimų ne navikų audiniuose ( P
= 0,019, 2A pav.) Aštuoni poros atstovybių skrandžio navikų audiniuose ir suderintų gretimų ne navikų audiniuose buvo parodyta 2B pav.

Imunohistocheminis analizė AZGP1 raiškos skrandžio vėžio audinio mėginiai ir jo ryšys su klinikos Įranga

siekiant patvirtinti molekulinius biologinių išvadas ir ištirti klinikos į prognozinius vaidmenis AZGP1 išraiška, mes atliekame imunohistocheminės analizę 248 parafino įterptųjų skrandžio vėžio skyriuose. Teigiamas išraiška AZGP1 buvo lokalizuota į citoplazmą (S1 paveiksle). Tarp 248 skrandžio vėžio mėginiai, 117 (47,2%) parodė aukštą AZGP1 išraišką (AZGP1 ++ arba AZGP1 +++), o likusių 131 atvejų (52,8%) rodomas mažas AZGP1 išraišką (AZGP1- arba AZGP1 +) (3 pav 1 lentelė). Normalus skrandžio audiniai parodė stipriausia AZGP1 teigiamą dažymo (3A pav.)

Remiantis kategorijas, kad mes, apibrėžtų pirmiau minėtų metodų, duomenys parodė, kad mažas išraiška AZGP1 reikšmingai koreliavo su naviko vietoje ( P
= 0,011), histologinis įvertinimas ( P
= 0,005) ir T etapas ( P
= 0,008), bet ne su amžiumi, lytimi, naviko dydį, radikaliai rezekcija , mazgų būklė (N etapas) arba metastazes statusas (M etapas). Į mikrografijos yra pavaizduota 3.

Koreliacija tarp AZGP1 raiškos Remiantis imunohistocheminis ir pacientų išgyvenamumo

išgyvenamumo mediana laikas 248 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams buvo 45 mėnesių (nuo 2-89 mėnesių) , Bendras išgyvenamumas ir 5 metų išgyvenamumas buvo žymiai pagerėjo aukštos AZGP1 išraiška grupėje, nei mažai išraiška grupės [64,2% vs 49,5% (bendras išgyvenamumas) ir 65.1% vs 50,4% (5 metų išgyvenamumas) atitinkamai p
= 0,009, 4 pav].

Vienmatės ir daugiamatė analizė

vienmatės ir daugiamatės analizės buvo atliktos palyginti AZGP1 saviraiškos ir kitų klinikos parametrų poveikį prognozė. Remiantis pagal vieną požymį analizę, kad įtraukti visas 248 pacientus, buvo nustatyta 8 veiksniai turėjo statistiškai reikšmingų sąsajų su bendro išgyvenamumo. Ši analizė buvo šie veiksniai apsvarstyti: naviko vietą, naviko dydį, histologinis kokybės, AZGP1 ekspresijos lygmenis, TNM etapas (7. leidimas TNM klasifikaciją), ir ar radikali rezekcija buvo atlikta (2 lentelė). Visi 8 veiksniai buvo įtraukti į daugiamatis Cox proporciniai pavojų modelį, siekiant prisitaikyti prie iš kintamųjų poveikių. Remiantis šiuo modeliu, navikas vietos, AZGP1 išraiškos lygiai T stadijos ir N stadijos navikas buvo patvirtintas nepriklausomų prognozinių veiksnių (2 lentelė).

Diskusijos

Skrandžio vėžys išlieka viena iš labiausiai mirtinas žmogaus piktybinių navikų. Net su pažanga diagnozuojant ir gydymą, skrandžio vėžio prognozė vis dar niūrus [1], [21]. Klinikinis rezultatas skrandžio vėžiu priklauso nuo auglio savybių, pavyzdžiui, naviko augimo, diferenciacijos, invazija ir tolimoje metastazių, kurios reglamentuojama susijusių genų įvairovė serijos. Todėl paprastai laikoma, kad genetiniai pakitimai, dėl kurių onkogenų aktyvavimo ir vėžinių slopintuvai nukenksminti yra pagrindinės priežastys vėžio patogenezėje. Nuoseklusis pelnas onkogenų ir praradimo naviko slopintuvai suteikti būtiną pagrindą step-protinga progresavimo solidinių navikų nuo pradžios iki transformacijos ir naviko progresavimas [22], [23], [24]. Anksčiau AZGP1 buvo pranešta, kad turi naviko slopinamąją savybės krūties vėžio, prostatos vėžio, kasos vėžio ir kai kurių kitų piktybinių navikų [17], [20], [25]; Tačiau dar nebuvo įvertintas AZGP1 vaidmuo pirminis skrandžio vėžio. Mūsų tyrimas parodė, kad AZGP1 išraiška buvo gerokai sumažintas tiek mRNR ir baltymų kiekiai naviko audinių mėginių, palyginti su išraiška suderintų gretimų ne vėžinių audinių pavyzdžius. Suderinamas su mūsų tyrimo duomenimis, Brysk MM et al. Taip pat įrodyta, kad AZGP1 lygis yra aukštesnis įprastomis burnos audinius nei žodžiu navikų [26]. Gagnon S ir kt. Taip pat įrodyta, kad AZGP1 buvo pateikti gerybinių hiperplazinių liaukų 91,1% atvejų, tačiau tik 40,7% (blogai diferencijuoti komponentas) iki 48,5% (gerai diferencijuotas komponentas) prostatos adenokarcinomos ir tik 8% metastazių [27]. Šie tyrimo rezultatai patvirtina hipotezę, kad AZGP1 gali tarnauti kaip naviko slopintuvas kai kuriais vėžio.

Jei dar patvirtinti šį AZGP1 išraiškos sumažinti pirminės skrandžio vėžio, mes atliekame imunohistocheminės analizę su triušio prieš hAZGP1 antikūnų. Mes pastebėjo mažesnę raišką AZGP1 imunodažymu į proksimalinės ar visiškai skrandžio vėžiu, palyginti su tolimų skrandžio vėžio audiniuose. Kai kurie tyrimai parodė, kad artimieji skrandžio vėžio pacientai turi blogesnį išgyvenamumą nei tolimų skrandžio vėžiu sergančių pacientų [28]. Šie duomenys rodo, kad mažos išraiška AZGP1 skrandžio vėžio yra susijęs su daugiau piktybiniais fenotipų. Be to, mes atradome, kad sumažėjo išraiška AZGP1 buvo susijęs su blogai diferencijuotų adenokarcinomos (G3 vs G1 /G2), nurodant, kad AZGP1 gali sukelti skrandžio vėžio diferenciacijos. Šie rezultatai atitinka su Diez et al išvadas. [17], [18], kuris aprašytas asociaciją tarp aukšto AZGP1 saviraiškos ir aukšto lygio diferenciacija krūties vėžio. Panašūs išvados taip pat buvo pranešė, prostatos vėžio [19], krūties vėžio ir kasos vėžio [26]. Be to, mes nustatėme, kad mažas išraiška AZGP1 buvo susijęs su pažangiomis T etape. Šie rezultatai reiškia, jog mažo išraiška AZGP1 gali skatinti navikų augimą. Pagal mūsų tyrimo, Irmak S et al. pasiūlė, kad AZGP1 yra susiję su paviršinio šlapimo pūslės vėžio išsivystymo ir jos transformacijos į invazinės fenotipą [29]. Šie duomenys kartu nurodyti svarbų vaidmenį AZGP1 į diferenciacijos ir augimo skrandžio vėžio.

Naudojant Kaplan-Meier išgyvenamumo analizė, pacientai mūsų tyrimo metu mažai AZGP1 išraiška turėjo žymiai trumpesnį bendrą išgyvenimą, nei su dideliu ekspresijos lygis. Vienmatės analizė parodė, kad sumažėjo išraiška AZGP1 skrandžio vėžio audiniuose buvo reikšmingai susijęs su bendru išgyvenamumas ir 5 metų išgyvenamumas. Daugiamatė analizė parodė, kad AZGP1 išraišką, kartu su kai kurių tradicinių prognozinių veiksnių, tokių kaip naviko vietą, T etape ir N etape buvo nepriklausomi rizikos veiksniai skrandžio vėžiu sergančių pacientų prognozei. Šie rezultatai rodo, kad AZGP1 gali tarnauti kaip naujas prognozuoti prognozės skrandžio vėžiu sergantiems pacientams po chirurginės rezekcijos.

molekuliniai mechanizmai AZGP1 anketa naviko Slopinamoji savybių vis dar yra neaišku. AZGP1 priklauso macroglobulin šeimos, senovės ir evoliuciškai konservatorius nuorodą imuninės sistemos. Zorins NP et al., pasiūlė, kad macroglobulins talpa privalomas hidrolazių daro galimą fermentu sąlygotas auglys invazijos [30] slopinimą. Tuo pačiu metu, kurio macroglobulin /hidrolazės kompleksų perteklius gali aktyvuoti apoptozę [31]. Jis N ir kt. Pranešama, kad AZGP1 pat žemyn reguliuoja ciklino priklausoma kinazės, kuri yra atsakinga už reguliuojant G2-M perėjimą kursas, ribojantis žingsnis ląstelės ciklo. Tai rodo, kad AZGP1 netiesiogiai vaidina svarbų vaidmenį užkertant naviko progresavimas [32]. AZGP1 buvo pasiūlyta kaip auglio slopinamojo kasos vėžio Kong B et al. Jų tyrimas parodė, kad AZGP1 genas sukelia mezenchiminių-į-epitelio transdifferentiation slopindamas TGF-b-tarpininkaujant ERK signalizacijos [20]. Funkcinis vaidmuo ir mechanizmų AZGP1 skrandžio vėžio reikia atlikti papildomus tyrimus.

Taigi, mes pirmiausia tyrė raiškos lygius ir prognostinę vertę AZGP1 pradinėse skrandžio vėžio šiame tyrime. Mūsų tyrimo rezultatai parodė, kad AZGP1 gali tarnauti kaip kandidatas naviko slopintuvas ir prognozuojamų biologinis į pirminių skrandžio vėžio ir būti potencialus taikinys terapinės intervencijos; Tačiau molekulinius mechanizmus dalyvauja AZGP1 reguliavimo skrandžio vėžio orderių tolesniam tyrimui.

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimas

Šis tyrimas buvo patvirtintas etikos komiteto sun Yat-sen universiteto Vėžys centras, ir raštu informuoti sutikimas buvo gautas iš kiekvieno paciento tyrime dalyvavusių.

žmogaus audinių pavyzdys, -ai

iš 35 viso suporuotas vėžinėmis ir suderinti gretimų noncancerous skrandžio gleivinės audiniai buvo surinkti iš skrandžio vėžiu pacientams, kuriems atliekama pašalintas skrandis ne Sun Yat-sen universiteto Cancer Center nuo 2010 iki 2011 m Po chirurginės rezekcijos, šviežios audiniai nedelsiant buvo panardintas į RNAlater (Ambion, Inc., JAV), kad būtų išvengta RNR degradacija, laikomas 4 ° C temperatūroje per naktį, kad juos būtų galima kruopščiai skverbimąsi į RNAlater į audinį, o paskui sušaldyta iki -80 ° C temperatūroje, kol buvo atliktas RNR ir baltymų gavybos. Dar 248 parafino įterptųjų pirminis skrandžio karcinoma, kurie buvo surinkti nuo 2005 iki 2007 m mėginiai buvo imami iš Sun Yat-sen Universiteto onkologijos centras. Nė vienas iš šių pacientų gavo radioterapija ar chemoterapija prieš operaciją. Histopatologinė tipas ir etapas skrandžio vėžio buvo nustatytos atsižvelgiant į Pasaulio sveikatos organizacijos klasifikavimo ir TNM etape nustatyta, kad Sąjunga Tarptautinės vėžio kontrolės kriterijus.

Gavyba iš viso RNR ir realaus laiko kiekybine AT-PGR

viso RNR išskirta naudojant TRIzol (INVITROGEN, Carlsbad, Kalifornija, JAV) pagal gamintojo protokolą. Bendras RNR koncentracija buvo vertinama matuojant optinį tankį esant 260 nm, naudojant NANO DROP spektrofotometru (ND-1000, Thermo Scientific, JAV). Atvirkštinės transkripcijos (RT), sintetina pirmasis-kryptis kDNR buvo atliekama naudojant 2 mikrogramų viso RNR apdorotame su M-MLV atvirkštinės transkriptazės (Promega, JAV) pagal gamintojo rekomendacijas. tada gautas kDNR buvo atliktas realaus laiko kiekybine RT-PGR metodu dėl vertinimo santykinių mRNR lygių AZGP1 ir GAPDH (gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės, kaip vidaus kontrolės), su šiais pradmenų: AZGP1 į priekį: 5'-GGAAGCAGGACAGCCAACTT -3 "ir pakeisti: 5'-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3"; GAPDH priekį: 5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ", ir atvirkštiniai: 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3". Genų konkrečių amplifikacija buvo atlikta naudojant "ABI 7900HT realaus laiko PGR sistema (Life" technologijas, Karlovi Varai, Kalifornija, JAV), kurio 15-iL PGR mišinio, kuriame yra 0,5 įxL kDNR 7,5 įxL 2 × SYBR Žaliosios pagrindinės mišinio (INVITROGEN, Karlsbadas, California, JAV), ir 200 nM atitinkamų oligonukleotidų pradmenis. Mišinys buvo pakaitinti 95 ° C temperatūroje (10 minučių) ir po to amplifikuojami 95 ° C temperatūroje (30 sec) ir 60 ° C temperatūroje (1 min) 45-ciklų. Raiška kreivė buvo matuojamas, esant 95 ° C temperatūroje 15 sekundžių, 60 ° C temperatūroje 15 sekundžių ir 95 ° C temperatūroje 15 sek. CT (riba ciklas) vertė kiekvieno mėginio buvo skaičiuojamas nuo ribinių ciklų su prietaisu programinės įrangos (SDS 2.3), o santykinė išraiška AZGP1 mRNR buvo standartizuoti GAPDH vertės. Duomenys buvo analizuojami naudojant lyginamąją slenkstinis ciklas (2 ^{-ΔCt) metodą, kaip šią formulę: Santykinis išraiška lygis = 2 -ΔCt = 2 -Ct (GAPDH) - 2 -Ct (AZGP1), kuriame ct (GAPDH) reiškia, CT vertę GAPDH ir Ct (AZGP1) reiškia, CT vertę AZGP1.}

Imunoblotingo analizė

homogenizuotus skrandžio vėžio mėginiai, įskaitant naviko ir nontumor audiniai, buvo lizuojamos į Ripa lizės buferiniame tirpale, ir lizatai nuimami, esant 4 ° C centrifuguojant (12000 rpm) 30 min. Maždaug 20 mikrogramų baltymo mėginiai buvo tada atskirti elektroforezės 12% natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelyje ir patenka ant spausdinamo polivinilideno fluorido membranas. Po to, kai blokuoja nespecifinį vietas 60 min su 5% lieso pieno, membranos buvo inkubuojami per naktį 4 ° C temperatūroje, turintis triušis monokloniniai antikūnai prieš AZGP1 (PTG Company, JAV, esant 1:200 skiedimo). tada membranos tris kartus buvo plaunamos su TBST (Tris-buferio druskų tirpalo su Tween-20) 10 min ir tyrinėjo su krienų peroksidazės (HRP) konjuguoto ožkos anti-triušio IgG antikūnų (Imunologija Konsultantai laboratorija, JAV, esant 1: 2000 praskiedimas), esant 37 ° C temperatūroje 1 valandą. Po trijų plovimų, Membranos sukūrė sustiprintą cheminės liuminescencijos sistemos (Mobilusis Signalizacijos technologijų, Danvers, Masačusetsas, JAV). Grupė intensyvumas buvo matuojamas densitometrija naudojant Kiekis One "programinė įranga (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, JAV). Baltymų lygiai

imunohistocheminis analizė

audinio skyriai buvo normalizuotas kad GAPDH aptiktas naudojant pelę anti-žmogaus GAPDH monokloninis antikūnas (Šanchajus Kangchen, Kinija, ne 1:10000 praskiedimas). buvo deparaffinized su dimetilbenzen ir rehidrataciją per 100%, 95%, 90%, 80% ir 70% etanolio. Po trijų plovimų PBS (fosfato buferinis tirpalas), skaidres buvo virti antigeno pakartotinio buferio, kuriame 0,01 M natrio citrato-vandenilio chlorido rūgštis (pH = 6,0) 15 min mikrobangų krosnelėje. Praplovus PBS, audinių dalys buvo inkubuotos su pirminiais antikūnais ir tada skaidres buvo perplaunamos 3% peroksidazės gesinandiojo tirpalo (Invitrogen) blokuoti endogeninio peroksidaze. tada dalys buvo inkubuotos su triušio monokloniniai antikūnai prieš AZGP1 (PTG Company, JAV, esant 1:200 praskiedimas), esant 4 ° C temperatūroje per naktį, ir inkubuojami su krienų peroksidazės (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM aptikimo rinkinys) kambario temperatūroje 30 min. Nuplovus PBS, vizualizacija signalas buvo sukurtas 3, 3'-diaminobenzidinas (DAB) tirpalo, ir visi skaidrėse buvo counterstained hematoksilinu. Kaip neigiamos kontrolės, kad gretimi skyriai buvo apdoroti kaip aprašyta aukščiau išskyrus tai, kad jie buvo inkubuojami per naktį 4 ° C temperatūroje, blokuojančiu tirpalu be pirminio antikūno.

mėginiai buvo analizuojami trys stebėtojai (Chunyu Huang, Lin LV, ir Jingjing Zhao), kurie buvo apakinti pacientų klinikinei baigčiai. Neatitikimai tarp stebėtojų buvo rasta mažiau nei 10% tirtų skaidres ir sutarimas buvo pasiektas po papildomo patikrinimo. Bendras AZGP1 imunodažymu rezultatas buvo apskaičiuojamas kaip procentinis pozityvumo (iš teigiamai tamsintas vėžinių ląstelių procentinės) ir dažymo intensyvumo suma. Procentas pozityvumo pelnytas kaip "0" (< 5%, neigiamos), "1" (5-25%, atsitiktinis), "2" (25-50%, židinio), arba "3" (> 50 %, difuzinis). Dažymo intensyvumas buvo įmuštas kaip "0" (be dažymo), "1" (silpnai tamsintas), "2" (vidutiniškai tamsintas) arba "3" (stipriai tamsintas). Bendras AZGP1 imunodažymu rezultatas svyravo nuo 0 iki 9. Mes apibrėžė AZGP1 raiškos lygį taip: "-" už rezultatas 0-1, "+", dėl 2-3 rezultatas, kuris buvo apibrėžtas kaip mažos raiškos; "++" Už 4-6 rezultatas, ir "+++" už rezultatą >. 6, kuris buvo apibrėžtas kaip aukštą raišką

Tolesni Iki

pooperacinis Sekite -up buvo atliktas mūsų ambulatorinio skyriaus ir įtraukti klinikiniai ir laboratoriniai tyrimai kas 3 mėnesius per pirmuosius 2 metus, kas 6 mėnesius per trečiąjį kad penktaisiais metais, ir kasmet už papildomą 5 metus arba tol, kol paciento mirties, kuri įvyko pirmasis. Bendras išgyvenamumas, kuri buvo apibrėžiama kaip laikas nuo operacijos paciento mirties arba paskutinės tolesnių buvo naudojamas kaip prognozė priemonė. Buvo apie 4% pacientų prarado tolesnius veiksmus.

Statistinė analizė

suporuoti-pavyzdžiai T-testas buvo naudojamas palyginti AZGP1 iRNR kiekį naviko audinių pavyzdžius ir gretimos neturinčių naviko audinio mėginiai. χ
^{2 testas proporcingai ir Pearsono koreliacijos koeficientai buvo naudojamas analizuoti tarp AZGP1 raiškos ir įvairių klinikos savybių santykį. Bendras išgyvenamumas kreivės buvo apskaičiuojamas Kaplan-Meier metodu ir buvo analizuojami su log-rank testą. Cox proporcinio pavojaus analizė buvo naudojama pagal vieną požymį ir Dispersinės analizės ištirti klinikos kintamųjų poveikį ir AZGP1 išraiška išlikimui. Dvipusis, P
-Pridėtinės < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas. Visi statistinės analizės buvo atlikta su SPSS programinę įrangą (versija 17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, JAV).}

Pagalbinė informacija
S1 paveiksle.
Imunohistocheminiais aptikti AZGP1 baltymų raiškos skrandžio vėžio audinyje. Teigiamas išraiška AZGP1 buvo lokalizuota į citoplazmą
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0069155.s001
(TIF)

• PLoS ONE: sumažėjimas Pasaulis-202-3p išraiška, romano auglio slopinamojo, skrandžio vėžio
• PLoS ONE: Naujas grupuoti nuo PT4 skrandžio vėžio Pasak Serosal invazija plotis