Plos ONE: Zmanjšan Izražanje AZGP1 je povezana s slabo prognozo v osnovni želodca Cancer

Povzetek

Ozadje

2-cink-glikoproteina 1 (AZGP1) je multidisciplinarno protein, ki sodeluje v številnih pomembne funkcije v človeškem telesu, vključno gnojenja, imunskega odziva in lipidov mobilizacijo. Nedavno je bilo dokazano, da je AZGP1 vključen tudi v karcinogeneze in diferenciacijo tumorja. V tej študiji smo raziskovali raven izražanja in napovedno vrednost AZGP1 v osnovnih želodčnega raka.

Metode in rezultati

Proučili smo izraz AZGP1 v 35 seznanjene rakavo in izravnano sosednje noncancerous želodčne sluznice tkiva, ki jih v realnem času kvantitativne RT-PCR (QRT-PCR) in zahodni blot. Poleg tega smo analizirali AZGP1 izražanje pri 248 bolnikih, ki uporabljajo imunohistokemično bile opravljene postopke resekcijo med letoma 2005 in 2007. Razmerja med ravnmi AZGP1 izražanja, so bile preiskane clinicopathological dejavniki in preživetje bolnika. AZGP1 izraz se je močno zmanjšala, tako na mRNA ( P
= 0,023) in beljakovin vrednosti ( P
= 0,019) v vzorcih tumorjev tkiv, v primerjavi z izrazom v izravnanih sosednjih vzorcev non-tumorskih tkiv . Imunohistokemične Podatki za barvanje so pokazali, da je bila AZGP1 izraz bistveno zmanjšal na 52,8% (131/248) primerov adenokarcinomom želodca. Clinicopathological analiza je pokazala, da se je zmanjšal ekspresijo AZGP1 pomembno povezana z lokacijo tumorja ( P
= 0,011), histološke ( P
= 0,005) in fazi T ( P
= 0,008). Kaplan-Meier krivulji preživetja je pokazala, da se je zmanjšal ekspresijo AZGP1 povezano s slabo prognozo pri bolnikih adenokarcinomom želodca ( P
= 0,009). Multivariatna Cox analiza opredelila AZGP1 izraz je neodvisen napovedni dejavnik za skupno preživetje bolnikov adenokarcinomom želodca (HR = 1.681, 95% CI = 1.134-2.494, P
= 0,011).

Sklepi

Naša raziskava kaže, da bi AZGP1 služila kot supresorski kandidat tumorja in potencialni prognostični biomarker v želodcu rakotvornost

Navedba. Huang Cy, Zhao Jj, Lv L, Chen Yb, Li Yf, Jiang ss et al. (2013) zmanjšana Izražanje AZGP1 je povezana s slabo prognozo na primarnem želodca raka. PLoS ONE 8 (7): e69155. doi: 10,1371 /journal.pone.0069155

Urednik: Alfons Navarro, Univerza v Barceloni, Španija

Prejeto: 5. marec 2013; Sprejeto: 5. junij 2013; Objavljeno: 23. julij 2013

Copyright: © 2013 Huang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprlo doktorske sklad Ministrstva za šolstvo Kitajske (20100171110084). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je drugi najpogostejši vzrok smrti, povezanih z rakom po celem svetu, z 988,000 novih primerov in 736,000 smrti na leto [1] - [2]. Na Kitajskem se je rak želodca predvidoma tretji najpogostejši rak v letu 2005 z 0,4 milijona novih primerov in 0,3 milijona smrtnih primerov [3]. Zdravljenje raka želodca vključuje kombinacijo kirurškega posega, kemoterapijo in radioterapijo. Vendar skoraj 60% prizadetih bolnikov podlegel raku želodca po zgolj kurativno resekcijo ali po kurativno resekcijo z novejšimi adjuvantno terapijo [4]. Rak želodca je heterogena bolezen tako histologijo in genetike; torej, na rezultate zdravljenja je težko napovedati z uporabo klasičnih histološke klasifikacije. Želodca nastanek raka je multifaktorska in večstopenjski proces, ki vključuje aktiviranje onkogeni in inaktivira zaviralnih genov v različnih fazah želodca napredovanja raka. V zadnjem času so bile ugotovljene številne nove onkogeni in zaviralnih genov, povezanih z rakom želodca. Zato je klinično pomembno najti učinkovite nove cilje za zgodnje diagnosticiranje in učinkovito zdravljenje raka želodca.

AZGP1 (2-cink-glikoproteina 1, Zn-alfa 2-glikoprotein) je 41 kDa topen protein z poglavitnega histokompatibilnega kompleksa-1 (MHC-1) -Kot krat v svojo strukturo, in je bil na začetku identificiran in prečiščen v človeškem serumu leta 1961 [5]. Gen za AZGP1, dodeljena kromosoma 7q22.1 s fluorescentno hibridizacijo kariotip, ki je sestavljena iz štirih eksonov in treh intronov [6] [7]. Uporabi imunohistokemijske študije, je bilo ugotovljeno, da se AZGP1 izraža predvsem v epitelnih celic raka dojke, prostate, jeter in raznih drugih gastrointestinalnih organih [8]. V skladu s svojo proizvodnjo, ki ga izločevalnih epitelijskih celic, je AZGP1 najdemo v številnih telesnih tekočin [9] [10] [11].

AZGP1 je multidisciplinarno protein, ki sodeluje v številnih pomembnih funkcij v človeško telo, vključno oploditve [11], imunoregulacija [12] in lipidov sredstev [13] [14] [15]. AZGP1 je povezano tudi z rakom kaheksije. AZGP1 ima visoko raven aminokisline homologijo v sekvenci s tumorjem izpeljana-lipidov mobilizira faktor [14], in na modelu miši tumorjev proizvodnjo AZGP1, AZGP1 spodbudila lipolizo v adipocitov, ki vodijo do kaheksije [16]. Nedavno je bilo dokazano, da je AZGP1 vključen tudi v karcinogeneze in diferenciacijo tumorja. Beljakovin in mRNA izraz analize so pokazale povezavo med stopnjami AZGP1 in histološko stopnjo raka dojk tumorjev [17], [18]. Poleg tega so številne študije kažejo, da je AZGP1 potencialni serum označevalec raka prostate [9], [19]. Poleg tega se je pokazalo, da AZGP1 deluje kot nova zaviralnih v raka trebušne slinavke [20]. Vendar pa niso poročali doslej status izraz AZGP1 in prognostično vrednost tega proteina v primarnih želodčnega raka.

V tej študiji smo analizirali stopnjo AZGP1 izražanja v želodcu raka s pomočjo realnem času kvantitativne RT -PCR (QRT-PCR), western-blot in imunohistokemija. Poleg tega smo ugotovili, da razmerje med AZGP1 izražanja in clinicopathological značilnosti raka želodca, in smo ocenili napovedno vrednost AZGP1 izražanja za preživetje po resekcijo bolnikov z rakom želodca.

Rezultati

AZGP1 mRNA Expression Analizirano s QRT-PCR

transkripcijski ravni AZGP1 so bile ugotovljene s QRT-PCR z uporabo 35 parov odstranjenimi vzorcev (vzorcev tumor tkiva in izravnanih sosednjih vzorcev ni tumorskih tkiv) od bolnikov z rakom želodca. Ravni AZGP1 mRNA so se bistveno zmanjša v vzorcih 28 (80%) tumor tkiva v primerjavi z ujemanjem sosednjih vzorcev brez tumor tkiva ( P
= 0,023, slika 1).

AZGP1 Expression Analizirano Western blot

vsebnosti beljakovin AZGP1 v odstranjenimi želodca vzorcih raka so bile določene s zahodni blot. Rezultati so pokazali pas za AZGP1 pri 41 kDa, in znesek AZGP1 proteina sedaj smo merili z denzitometrijo in višino. Skladni z rezultati QRT-PCR, so opazili zmanjšanje AZGP1 izražanja v 25 (71,4%) od želodca tumorskih tkivih, v primerjavi z izravnanih sosednjih non-tumorskih tkivih ( P
= 0,019, slika 2A). Osem parov reprezentativnih želodčnih tumorskih tkiv in izravnanih sosednjih non-tumorskih tkivih so prikazani na sliki 2B.

Imunohistokemično Analiza AZGP1 izražanja v želodcu raka tkivnih vzorcev in njen odnos z Clinicopathological funkcije

da bi lahko potrdili molekularnih bioloških ugotovitve in raziskati clinicopathological na prognostičnih vloge AZGP1 izražanja, smo izvedli imunohistokemičnim analizo v 248-parafin vgrajeni želodca oddelkov raka. Pozitiven izraz AZGP1 bil lokaliziran v citoplazmi (Slika S1). Med 248 želodčnih vzorcev raka, 117 (47,2%), je pokazala visoko AZGP1 izraz (AZGP1 ++ ali AZGP1 +++), medtem ko je preostalih 131 primerih (52,8%) prikaže nizko AZGP1 izraz (AZGP1- ali AZGP1 +) (slika 3, tabela 1). Normalno želodca tkiva je pokazala najmočnejši AZGP1 pozitivno barvanje (slika 3A).

Na podlagi kategorij, ki smo jih opredelili v zgoraj omenjenih metod, podatki so pokazali, da je bila nizka izraz AZGP1 pomembno povezana z lokacijo tumorja ( P
= 0,011), histološke razred ( P
= 0,005) in faza T ( P
= 0,008), vendar ne na starost, spol, velikost tumorja, radikalno resekcijo , vozla stanje (faza N) ali stanja metastaze (M faza). Mikrografi so prikazani na sliki 3.

Korelacija med AZGP1 izražanja Na imunohistokemija in bolnikov preživetje

Mediana časa preživetja 248 bolnikov, Rak želodca je bila 45 mesecev (od 2-89 mesecev) . Splošna stopnja preživetja in 5-letno preživetje je bilo v visoki AZGP1 izraz skupine močno izboljšala od nizke izražanja skupini [64,2% v primerjavi s 49,5% (skupna stopnja preživetja) in 65,1% v primerjavi z 50,4% (5-letno stopnjo preživetja), oziroma, P
= 0,009, slika 4].

Univariatne in multivariatne analize

Univariatna in multivariatne analize so bile opravljene za primerjavo vpliva AZGP1 izražanja in drugih clinicopathological parametrov na prognoza. Na podlagi univariantne analizi, ki je vključevala vse 248 bolnikov, je bilo ugotovljeno, 8 dejavniki, da so statistično pomembne zveze z celokupnega preživetja. Ta analiza je naslednji dejavniki v obravnavanem: lokacije tumorja, velikosti tumorja, histološki razred, nivojev AZGP1 izraz, fazi TNM (7. izdaja klasifikacija TNM) in ali radikalna resekcija je bila izvedena ali ne (tabela 2). Vseh 8 dejavniki so bili vključeni v multivariatno Cox sorazmernih tveganj modela za prilagoditev učinkov spremenljivk. Na podlagi tega modela, lokacija tumorja, AZGP1 ravni izraz, odrski T in N faza tumorja je bilo potrjeno, neodvisnih napovednih dejavnikov (tabela 2).

Pogovor

rak želodca ostaja ena najbolj smrtonosne človekovih malignosti. Tudi z napredkom v diagnostiki in zdravljenju, je prognoza za raka želodca, je še vedno žalostna [1], [21]. Klinični izid raka želodca je odvisna od vrste značilnosti tumorja, kot so tumorske rasti, diferenciacije, invazije in daljni metastaziranje, ki jih ureja različnih sorodnih genov. Zato se na splošno šteje, da so genetske spremembe, ki vodijo do aktivacije onkogeni in deaktivacijo tumorskih razbijal vzroke za raka patogenezo. Zaporedna dobiček onkogenov in izguba tumorskih razbijal zagotovi potrebno podlago za step-wise napredovanje solidnih tumorjev od začetka do preoblikovanja in napredovanja tumorja [22], [23] [24]. Prej, AZGP1 so poročali, da imajo tumorske omejevalno lastnosti pri raku dojke, raka prostate, raka trebušne slinavke in nekaterih drugih malignih tumorjev [17], [20], [25]; Vendar pa še ni bila ovrednotena vloga AZGP1 v primarni rak želodca. Naša raziskava je pokazala, da je bila AZGP1 izraz bistveno zmanjšala tako na ravni mRNA in beljakovin v vzorcih tumor tkiva, v primerjavi z izrazom v izravnanih sosednjih vzorcev ni tumorskih tkiv. V skladu z našo raziskavo, Brysk MM et al. tudi pokazala, da so ravni AZGP1 v normalnih ustna tkiva večja kot pri ustnem tumorjih [26]. Gagnon S et al. tako dokazal, da je AZGP1 prisotna v benignih hiperplastičnih žlez v 91,1% primerov, a le 40,7% (slabo diferencirane komponenta) na 48,5% (dobro diferenciran komponenta) prostate adenokarcinome in le 8% metastaz [27]. Ti študijski rezultati potrjujejo hipotezo, da lahko AZGP1 služi kot supresorski tumorja v nekatere vrste raka.

Za dodatno potrditev tega zmanjšanje AZGP1 izražanja v primarnim rakom želodca, smo izvedli imunohistokemičnim analizo z zajec anti-hAZGP1 protitelesa. Ugotovili smo nižje izražanje AZGP1 imunskim barvanjem v proksimalnem ali popolni rakom želodca v primerjavi z oddaljenimi želodčnega tkiva raka. Nekatere študije so pokazale, da imajo proksimalne bolniki z rakom želodca slabše preživetje kot oddaljenih bolnikov želodca z rakom [28]. Ti podatki kažejo, da je nizka izraz AZGP1 raka želodca, povezanih z več malignih fenotipov. Poleg tega smo ugotovili, da je zmanjšala izražanje AZGP1 je bila povezana s slabo diferenciranimi adenokarcinome (G3 primerjavi G1 /G2), kar pomeni, da lahko AZGP1 inducira diferenciacijo raka želodca. Ti rezultati so skladni z ugotovitvami Diez et al. [17] [18], ki je opisal pridružitvi med visoko AZGP1 izražanja in visoke stopnje diferenciacije pri raku dojke. Podobne ugotovitve so poročali tudi za raka prostate [19], raka dojke in raka trebušne slinavke [26]. Poleg tega smo ugotovili, da je bila nizka izraz AZGP1 povezana s fazi T. Ti rezultati pomenilo, da bi nizka izraz AZGP1 spodbujanje rasti tumorja. V skladu z našo raziskavo, Irmak S et al. Predlaga se, da se AZGP1 povezana z razvojem površinskega raka sečnega mehurja in njeno pretvorbo v invazivne fenotipa [29]. Te ugotovitve skupaj kaže na pomembno vlogo AZGP1 pri diferenciaciji in rast raka želodca.

Z analizo preživetja po metodi Kaplan-Meier, so imeli bolniki v naši raziskavi z nizko AZGP1 izražanja bistveno krajši skupno preživetje kot tisti z visokim ravni izraz. Univariatne analize so pokazale, da se je zmanjšala izraz AZGP1 v želodčnih tkivih raka značilno povezana s splošno stopnjo preživetja in 5-letno stopnjo preživetja. Multivariatna analiza je pokazala, da AZGP1 izraz, skupaj z nekaterimi tradicionalnimi prognostičnih dejavnikov, kot so lokacija tumorja, stadij T in stopnji N, so neodvisni dejavniki tveganja na prognozo bolnikov z rakom želodca. Ti rezultati kažejo, da bi lahko AZGP1 služi kot nov napovedovalec prognozo pri bolnikih želodca z rakom po kirurški odstranitvi.

molekularnih mehanizmov tumorskih supresivno lastnosti AZGP1 so še vedno nejasne. AZGP1 spada v družino makroglobulina, starodavno in evolucijsko konzervativno povezavo imunskega sistema. Zorin NA sod. Predlaga se, da se zmogljivost macroglobulins za vezavo hidrolaz omogoča zaviranje-encimske posredovane tumorske invazije možni [30]. Hkrati lahko prebitek makroglobulina /hidrolaze kompleksov aktivirajo apoptozo [31]. Je N et al. poročali, da AZGP1 tudi navzdol uravnava ciklin-odvisne kinaze, ki je odgovorna za reguliranje G2-M prehoda, ki omejuje hitrost korak celičnega cikla. To kaže, da AZGP1 posredno igra pomembno vlogo pri ovira napredovanje tumorjev [32]. AZGP1 je bila predlagana kot supresorski tumorjev pri raku trebušne slinavke, ki ga Kong B. et al. Njihova študija je nakazala, da je gen AZGP1 inducira mezenhimske-to-epitelijskih transdifferentiation z zaviranjem TGF-b-posredovano ERK signalizacijo [20]. Funkcija in mehanizmi za AZGP1 na raka želodca potrebujejo nadaljnjo preiskavo.

Na koncu smo najprej raziskovali raven izražanja in napovedno vrednost AZGP1 v osnovnih želodčnega raka v tej študiji. Naši študijski rezultati kažejo, da bi lahko AZGP1 služila kot supresorski kandidat tumorja in prognostičnega biomarker v primarnih želodčnega raka in je lahko tarča za terapevtsko intervencijo; Vendar pa so molekularni mehanizmi vključeni v regulacijo AZGP1 v želodcu nalogov za rakom nadaljnje preiskave.

Etika Statement

Materiali in metode

Ta raziskava je odobril Odbor za etiko Sun Yat-sen University Cancer Center, in pisno privolitev je bila pridobljena iz vsakega, ki sodeluje pri raziskavi bolniku.

Human Tissue Vzorec s

skupno 35 v paru rakavi poveže in sosednjih noncancerous želodčne sluznice tkiva so bili zbrani pri bolnikih želodca z rakom, ki želodca pri Sun Yat-sen University Cancer Center od leta 2010 do leta 2011. po kirurški odstranitvi, so sveže tkiva takoj potopijo v RNAlater (Ambion, Inc., ZDA), da bi se izognili razgradnje RNA, shranjena pri 4 ° C preko noči, da se omogoči temeljito prodiranje RNAlater v tkivo in zamrznemo pri -80 ° C, dokler nismo izvedli ekstrakcijo RNA in proteinov. Še 248-parafin vgrajeni osnovni želodčni karcinom vzorcev, ki so bili zbrani med letoma 2005 in 2007 so bili pridobljeni iz Sun Yat-sen University Cancer Center. Nobeden od teh bolnikov je prejela radioterapijo ali kemoterapijo pred operacijo. Histopatološke vrsta in stopnja raka želodca so bili določeni v skladu z merili iz klasifikacije Svetovne zdravstvene organizacije in v fazi TNM določen Unije za mednarodni nadzor raka.

Pridobivanje Total RNA in v realnem času Kvantitativni RT-PCR

Total RNA je bila vzeta s pomočjo TRIzola (Invitrogen, Carlsbad, California, ZDA) po protokolu proizvajalca. Skupna koncentracija RNA smo določili z merjenjem absorbance pri 260 nm z uporabo NANO DROP spektrofotometra a (ND-1000, Thermo Scientific, ZDA). Reverzna transkripcija (RT) za sintetiziranje prvi sklop cDNA smo izvedli z uporabo 2 ug celotne RNA obdelamo z M-MLV reverzne transkriptaze (Promega, ZDA) v skladu s priporočili proizvajalca. Nastalo cDNK smo nato podvržemo realnem času kvantitativne RT-PCR za oceno relativne ravni mRNA AZGP1 in GAPDH (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze, kot notranje kontrole) z naslednjimi primerji: AZGP1 naprej: 5'-GGAAGCAGGACAGCCAACTT -3 ", in obratno: 5'-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3 '; GAPDH naprej: 5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ", in obratno: 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3". Gene-specifično pomnoževanje smo izvedli z uporabo ABI 7900HT realnem času sistem PCR (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornija, ZDA), z 15-ul PCR mešanico, ki vsebuje 0,5 xl cDNA, 7,5 xl 2 × SYBR Green master mix (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, ZDA) in 200 nM ustreznih oligonukleotidnih primerjev. Mešanica je bila ogreta na 95 ° C (10 min) in nato pomnožili pri 95 ° C (30 sek) in 60 ° C (1 minuto), za 45 ciklov. Krivulja resolucija smo izmerili pri 95 ° C 15 sekund, pri 60 ° C za 15 sekund in 95 ° C za 15 sekund. Vrednost Ct (prag cikel) vsakega vzorca smo izračunali iz ciklov praga s programsko opremo inštrumenta (SDS 2,3) in relativna izraz AZGP1 mRNA smo normalizirali na vrednost GAPDH. Podatki so bili obdelani s pomočjo primerjalne mejno cikel (2 ^{-ΔCt) Postopek naslednjo formulo: Relativni nivo izražanja = 2 -ΔCt = 2 -Ct (GAPDH) - 2 -Ct (AZGP1), v katerem Ct (GAPDH) pomeni Ct vrednost GAPDH in Ct (AZGP1) pomeni Ct vrednost AZGP1.}

Western blot analiza

homogenizirana želodca vzorce raka, vključno z tumor in nontumor tkiva smo lizirali v RIPA lize pufru, in lizate požanjemo s centrifugiranjem (12.000 rpm) pri 4 ° C 30 minut. Približno 20 mikrogramov proteinske vzorce nato ločimo z elektroforezo na 12% natrijev dodecil sulfat poliakrilamidnem gelu in prenese na poliviniliden fluorida membran. Po blokiranje non-specifična vezavna mesta za 60 min s 5% nemastnega mleka, smo membrane inkubirali preko noči pri 4 ° C z protitelesa zajec monoklonsko proti AZGP1 (PTG Company, ZDA, pri razredčenju 1:200). Membrane smo nato trikrat sprali s TBST (-tris pufrom s Tween-20) za 10 minut in zaznati s hrenovo peroksidazo (HRP) označenih s kozje anti-kunčje protiteles IgG (Imunologija svetovanje Laboratory, ZDA, na 1: 2000 razredčitev) pri 37 ° C 1 uro. Po treh pranjih, smo membrane razvili izboljšano kemiluminiscentnim sistema (Cell signalizacijo tehnologijo, Danvers, Massachusetts, ZDA). Intenzivnost skupina je bila merjena z denzitometrijo uporabo programske opreme Količina One (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, ZDA). Ravni beljakovin so normalizirane tistemu GAPDH zazna z miško GAPDH monoklonskih protiteles proti humanemu (Shanghai Kangchen, Kitajska, pri redčenju 1:10000).

Imunohistokemija Analiza

odseki tkiva smo deparaffinized z dimetilbenzen in hidracijo preko 100%, 95%, 90%, 80% in 70% etanola. Po treh izpiranjih v PBS (-fosfatnim pufrom), so drsi v vreli antigensko arhiviranje pufru, ki vsebuje 0,01 M natrijev citrat, klorovodikovo kislino (pH = 6,0) za 15 minut v mikrovalovni pečici. Po spiranju s PBS, so odseki tkiva inkubiramo s primarnim protitelesom in drsi nato splaknemo v 3% raztopini peroksidaza gašenja (Invitrogen), da blokira endogenega peroksidazo. Odseki smo nato inkubirali z protitelesa zajec monoklonsko proti AZGP1 (PTG Company, ZDA, pri 1:200 redčenju) pri 4 ° C preko noči in nato inkubiramo s hrenovo peroksidazo (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Detection Kit) pri sobni temperaturi 30 min. Po spiranju v PBS, je vizualizacija signala razviti s 3 raztopino 3'-diaminobenzidine (DAB) in vse diapozitive smo jih nasprotno s hematoksilinom. Kot negativne kontrole so sosednji odseki obdelujejo kot je opisano zgoraj, razen da so inkubirali preko noči pri 4 ° C v blokirni raztopini brez primarnega protitelesa.

osebki so bili analizirani v treh opazovalcev (Chunyu Huang Lin lv in Jingjing Zhao), ki so zaslepljeni s kliničnimi izidi pacientov. Razlike med opazovalci so našli v manj kot 10% pregledanih diapozitivov in soglasje je bilo doseženo po nadaljnji pregled. Skupna ocena AZGP1 imunskim barvanjem je izračunana kot vsota odstotkov pozitivnosti (na odstotek pozitivno obarvanih tumorskih celic) in intenziteto barvanja. Odstotek pozitivnost je dosegel kot "0" (< 5%, negativna), "1" (5-25%, občasna), "2" (25-50%, osrednja), ali "3" (> 50 %, difuzni). Intenzivnost obarvanja je dosegel kot "0" (brez barvanja), "1" (rahlo obarvane), "2" (zmerno obarvajo), ali "3" (močno obarvajo). Skupno AZGP1 imunskim barvanjem ocena v razponu od 0 do 9. smo opredelili raven AZGP1 izražanja, kot sledi: "-" za rezultatom 0-1, "+" za rezultatom 2-3, ki so bili opredeljeni kot nizko izražanja; "++" Za rezultatom 4-6, in "+++" za rezultat > 6., Ki so bili opredeljeni kot visoko izražanje

Spremljanje

pooperativna spremljanje -up je bila izvedena v naši ambulanti in so vključeni klinične in laboratorijske preiskave vsake 3 mesece za prvi 2 leti, vsakih 6 mesecev v obdobju od tretjega do petega leta in vsako leto za dodatnih 5 let ali do smrti bolnika, kar je prej. Celokupno preživetje, ki je opredeljen kot čas od operacije do smrti bolnika ali zadnjem pregledu, je bila uporabljena kot merilo prognozo. Je bilo približno 4% bolnikov izgubi spremljanje.

Statistična analiza

A paru-vzorce, t-test smo uporabili za primerjavo ravni AZGP1 mRNK v vzorcih tumor tkiva in sosednjih brez porekla vzorci tumor tkiva. χ
^{2 test za sorazmerno in Pearson koeficientov smo uporabili za analizo odnosa med AZGP1 izražanja in različnih clinicopathological značilnosti. Splošni Krivulje preživetja smo izračunali po metodi Kaplan-Meier in smo analizirali s testom log-ranga. Cox analiza proporcionalnega nevarnosti je bil uporabljen za univariantne in multivariatne analize raziskati učinek clinicopathological spremenljivk in AZGP1 izraz na preživetje. Obojestranskega P
-vrednost < 0.05 je štelo, da je statistično značilna. Vse statistične analize smo opravili s SPSS programske opreme (različica 17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, ZDA).}

Podpora Informacije
Slika S1.
imunohistokemično ugotavljanje ekspresije AZGP1 beljakovin v želodcu tkivu raka. Pozitivna izraz AZGP1 je lokalizirana v citoplazmo
doi:. 10,1371 /journal.pone.0069155.s001
(TIF)

• Plos ONE: Zmanjšanje miR-202-3p izražanja, ki je roman zaviralnih, želodčnega raka
• Plos ONE: Nova Subclassification iz PT4 gastrični rak glede na širino od serozne Invasion