PLoS ONE: A Novel Proteomics-Based Clinical Diagnostics Technology identificeert heterogeniteit in geactiveerde signaalwegen in Gastric Cancers

De abstracte

Doel

Het doel van dit onderzoek was om de proteomics-based Collaborative gebruiken enzym Enhanced Reactive (CEER) immuno-eiwit tyrosine fosforyleringen als diagnostische markers in maagkanker te onderzoeken (GC).

Experimental Ontwerp

eiwit lysaten van vriesverse 434 vergevorderd stadium GC werden geanalyseerd op fosforylering van HER1, HER2, p95HER2, HER3, cMET, IGF1R en PI3K. Het pad activeringspatronen werden gescheiden op basis van de tumor HER2-status. Hiërarchische clustering werd gebruikt om pathway coactivations bepalen GCs. Prognostische waarde van pathway activeringspatronen werd bepaald door het correleren ziektevrije overlevingstijd van de verschillende subgroepen middels GC Kaplan-Meier-analyse. CEER werd ook gebruikt voor het bepalen van de aanwezigheid van tyrosine gefosforyleerd signaaltransductiecascades in circulerende tumorcellen (CTCs) en ascites tumorcellen (ATC).

Resultaten

Met behulp van een nieuwe diagnostische immuuntest, CEER, we de aanwezigheid van niet p95HER2 en gelijktijdig geactiveerde signaalwegen in GC tumorweefsels CTCs en ATC GC geïsoleerd van patiënten voor de eerste keer. p95HER2 wordt uitgedrukt in% ~77 HER2 (+) GC. Ongeveer 54% van GC's hebben een geactiveerde HER1, HER2, HER3, CMET of IGF1R en demonstreren van een slechtere prognose dan die waar deze receptortyrosinekinasen (RTK's) niet worden geactiveerd. Hiërarchische clustering van RTK's onthult co-clusteren van gefosforyleerd HER1: cMet, HER2: HER3 en IGF1R-PI3K. Coactivation van HER1 met CMET maakt GC's met een kortere ziektevrije overleving in vergelijking met alleen CMET GC geactiveerd.

Conclusies

Onze studie wijst op het nut van een nieuwe companion diagnostics technologie, CEER dat heeft sterke implicaties voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en therapeutische monitoring. CEER wordt gebruikt om een ​​beter begrip van geactiveerde signaalwegen in advanced GCs die significant de klinische behandeling kan verbeteren door nauwkeurige selectie van patiënten voor gerichte therapieën bieden

Citation:. Lee J, Kim S, Kim P, Liu X, Lee T, Kim KM, et al. (2013) A Novel Proteomics-Based Clinical Diagnostics Technology identificeert heterogeniteit in geactiveerde signaalwegen in maagkanker. PLoS ONE 8 (1): e54644. doi: 10.1371 /journal.pone.0054644

Editor: Anthony W. I. Lo, De Chinese Universiteit van Hong Kong, Hong Kong

Ontvangen: 20 september 2012; Geaccepteerd: 13 december 2012; Gepubliceerd: 25 januari 2013

Copyright: © 2013 Lee et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. De auteurs hebben geen steun of financiering aan te melden

Competing belangen. Terwijl PK, XL, TL, NH, GH, AK, AJ, GM, GL en de SS in dienst zijn van Prometheus Laboratories, dit doet niets af aan de auteurs ' naleving van alle PLoS ONE beleid op het delen van gegevens en materialen.

Introductie

Molecularly gerichte agenten hebben het gebied van de oncologie versneld. Aangezien ongeveer de helft van de tyrosine kinase component van de menselijke kinome is betrokken bij menselijke kankers, is het niet verrassend dat een groot deel van de huidige geneesmiddelen richten verschillende kinasen [1], [2]. Coactivation van receptortyrosinekinasen (RTK's) is waargenomen in sets van verschillende kankers zoals multiform glioblastoom [3], borstkanker [2], [4], [5], [6], [7], longkanker [8 ], [9], hoofd- en nekkanker [7] en maagkanker [4], [5] [6], waardoor ze als nodig is voor tumorprogressie en overleving implicating. Deze waarnemingen voldoende klinische rationale voor het screenen van geactiveerde RTK's in kankers die vervolgens kunnen leiden therapeutische targeting en potentieel bieden kennis voor rationele combinatorische therapeutische strategieën. Toch is het de expressie of activatie status van een RTK dat de specifieke doeleiwit voor een bepaalde therapeutische onvoldoende selecteren patiënten vaak patiënten niet reageren op therapie, ondanks de expressie van het doel kan analyseren. Aantal potentiële problemen verantwoordelijk zijn voor dergelijke weinig therapeutisch voordeel van gerichte agentia, bijvoorbeeld, 1) gelijktijdige activering van parallelle of alternatieve routes die de oorspronkelijk beoogde eiwit (ten) te omzeilen, en 2) continue verandering in moleculaire en pathologische kenmerken van neoplastische kon weefsels tijdens progressie van kanker. Daarom zou het ideaal zijn om een ​​companion diagnostisch instrument dat op beperkte hoeveelheden klinische monsters kan worden toegepast op de uitgebreide complex gefosforyleerd signaalnetwerken vangen in het neoplastische weefsel naast het directe doelwit RTK eiwit naar de "ontwikkelende" ziekte kunnen monitoren .

Gerichte fosforylatie analyse van klinische monsters wordt gehinderd door het gebrek aan direct bruikbare klinische testen die gevoelig genoeg kan functioneren beperkte hoeveelheden klinische weefsels. We hebben eerder gemeld de ontwikkeling van een nieuwe proximity immunoassay, Collaborative Enzyme Verbeterde Reactive-immunoassay (CEER Figuur S1) [6], die geschikt is voor het analyseren van zowel de totale expressie en activatie status van eiwitten signaaltransductiecascades. CEER kan worden uitgevoerd in een multiplex wijze direct aan klinische monsters die in beperkte hoeveelheden aanwezig kunnen zijn. De CEER assay maakt gebruik van de vorming van een unieke immuno-complex vereist de co-lokalisatie van twee detector enzym-geconjugeerde antilichamen als de doeleiwitten zijn vastgelegd op een microarray. Dit formaat maakt de efficiënte en gevoelige detectie van RTK's en de stroomafwaartse pad eiwitten naar de enkele cel niveau (een gevoeligheid van ongeveer 100 zeptomol). In deze studie hebben we de CEER test om de signaleringsroute complexiteit van maagkanker (GC) te bestuderen benut.

GC zijn de belangrijkste oorzaak van kanker overlijden wereldwijd met een incidentie van 18,9 /100.000 gevallen per jaar en een mortaliteit tarief van 14,7 /100.000 per jaar [10] en zijn de meest voorkomende maligniteit in Korea [11]. Metastatische GC blijft een therapeutische uitdaging voor medisch oncologen te wijten aan de slechte prognose. Momenteel, trastuzumab is de enige werkzame middel waarop wordt gericht dat heeft bewezen effectief te zijn voor GC in een gerandomiseerde fase III onderzoek [12]. Terwijl activatie van verschillende RTK's gerapporteerd in GCs, het effect van GC prognose is onbekend. Dit is belangrijk voor de ontwikkeling en toepassing van therapieën voor de klinische behandeling van GC.

In deze studie hebben we de multiplex CEER platform gebruikt om de niveaus van de geactiveerde RTK (HER1, HER2, afgeknotte varianten van HER2 te bepalen, dat wil zeggen, p95HER2, HER3, cMET, PI3K en IGF1R) in 434 vriesverse GC weefsels en probeerde GC patiënten te categoriseren in potentiële subgroepen op basis van hun eiwitten pad activering patronen. We hebben meerdere signaaleiwit activeringen waargenomen in GC subgroepen van tumoren die samenhangen met de ziekte-vrije overleving (DFS) bij deze patiënten. Daarom veronderstellen we dat redundant pad activering inputs kan leiden tot resterende downstream signalering in GC, waardoor de anti-tumor werkzaamheid van monotherapie gericht tegen enkele RTK's te beperken. Tenslotte hebben we een potentieel krachtige methode die clinici kunnen zijn voor basislijn en evoluerende veranderingen in tumor RTK activering profielen controleren in de loop van een behandeling met circulerende tumorcellen (CTCs) en kwaadaardige cellen geïsoleerd uit peritoneale vloeistof (ascites tumorcellen of ATCs ontwikkeld ). Bij elkaar genomen, onze studie levert het bewijs voor gelijktijdige RTK activering in GC menselijke weefsels naast oprichting CEER als een efficiënt instrument klinisch te diagnosticeren en monitoren RTK activatie tijdens GC behandeling of progressie van de ziekte.

Materialen en methoden

patiëntengroep en Tissue Specimen Procurement

de studie werd uitgevoerd na goedkeuring van de Samsung Medical Center Institutional review Board (IRB SMC) voor informed consent ontheffing gebruik van archiefmateriaal weefsels met terugwerkende klinische gegevens. De primaire tumor monsters werden alle verzamelde van Samsung Medical Center. Alle patiënten ondergingen gastrectomie met radicale lymfeklierdissectie opzet curatieve. Van maart 2001 tot februari 2005 werden 447 vers ingevroren weefsel van 434 patiënten uit chirurgisch weggesneden primaire maag tumoren verzameld en beschikbaar waren voor de uiteindelijke analyse. het operatiegebied en werden onmiddellijk ingevroren en opgeslagen in vloeibare stikstof tot later gebruik; alle vers ingevroren weefsels werden verzameld (30 minu- <). Tumormonsters werden bevestigd op de aanwezigheid van > 70% tumorgebied door de patholoog. Voor de analyse werden kleine stukken bevroren weefsel (10 urn punt X3) bereid met voorgekoelde scheermesje en gelyseerd in 100 pi lysisbuffer. De resulterende lysaten werden opgeslagen bij -80 ° C tot verdere analyse

Histopathologie Reageer en HER2 statusbepaling

Alle beschikbare H &. E-gekleurde glaasjes werden centraal beoordeeld door twee pathologen (ID, KKM ) aan de experimentele pathologie kern van de Samsung Cancer Research Institute. Alle tumor monsters waren afkomstig uit chirurgisch weggesneden primaire maag tumoren. HER2-status werd bepaald door IHC en FISH. IHC analyse werd uitgevoerd met de HercepTest ™ (Dako, Glostrup, Denemarken). HER2 eiwit expressieniveaus werden gescoord als 0 tot 3+, volgens de aanbevelingen consensuspanel over HER2 maken voor GC [13], [14]. Voor FISH, PathVysion HER2 DNA-probe kit (Abbott, Des Plaines, IL) werd gebruikt. Ariol beeldanalysesysteem werd gebruikt om de hybridisatiesignalen (Genetix, San Jose, USA) tellen. Alle monsters waarbij verhoudingen van HER2 /CEP17 tussen 1,8 en 2,2 werden gescoord door handmatig tellen van meer dan 60 niet-overlappende cellen. Verhoudingen van > 2,2, 1,8 tot 2,2, of < 1,8 werden geclassificeerd als positief, twijfelachtig of negatief voor versterking, respectievelijk. Chromosomaal 17 polysomie werd gedefinieerd als een CEP17 signaal dat maximaal zes exemplaren hadden gemiddeld per cel. Van de 447 monsters werden 434 specimens opgenomen in de uiteindelijke analyse.

Collaborative Enzyme Enhanced Reactive-immunoassay (CEER)

CEER dia's werden gedrukt, geïncubeerd met GC lysaten en verwerkt zoals eerder beschreven [ ,,,0],6]. Dia's werden gescand op vier fotomultiplicator (PMT) gain-instellingen om de effectieve dynamische bereik te vergroten. Gegevens waren geschikt voor een vijf parameter vergelijking afgeleid als een functie van capture-antilichaamconcentratie en PMT en gepresenteerd in berekende eenheden (CU).

multiplexverzending-microarray afdrukken.

invangantilichamen gedrukt op glasplaatjes-nitrocellulose gecoate (ONCYTE®, Grace Bio-Labs) met behulp van non-contact printers (Nanoplotter, GESIM). De stipdoorsnede bedroeg ongeveer 175 pm. Glaasjes werden in een kamer droogmiddel bewaard bij 4 ° C. Ongeveer 500 pL van capture Abs werden gedrukt in drievoud bij seriële verdunningen van 1 mg /ml, 0,5 mg /ml en 0,25 mg /ml. Gezuiverd muis-IgG's dienden als negatieve controles. Immuno-matrix slide configuraties worden getoond in Figuur S1.

antilichaam conjugatie en zuivering.

Target-specifieke antilichamen (monoklonaal tegen specifieke epitopen op humane signaaltransductie-eiwitten) en de bijbehorende detector enzymen, glucose oxidase (GO) of mierikswortel peroxidase (HRP), werden geactiveerd met bifunctionele verknoper, succinimidyl-4- (N-maleïmidomethyl) cyclohexaan-1-carboxylaat (SMCC) en gekoppeld waarbij antilichaam-enzym conjugaten. Conjugaten werden gezuiverd met HPLC. Antilichaam activiteiten in de gezuiverde conjugaten werden bepaald door competitie ELISA en na conjugatie enzymactiviteiten werden gedetecteerd door functionele testen specifiek voor elke detector enzym.

CEER assays.

Immuno-microarray glaasjes werden gespoeld 2X met TBST (50 mM Tris /150 mM NaCl /0,1% Tween-20, pH 7,2-7,4), geblokkeerd met 80 ul Whatman Blocking buffer gedurende 1 uur bij KT, daarna 2X gewassen met TBST. Serieel verdund lysaat controles of monsters in 80 pl verdunningsbuffer (2% BSA /0,1% Triton X-100 /TBS, pH 7,2-7,4) werden toegevoegd aan bepaalde subnetwerken op objectglaasjes en geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Objectglaasjes werden gewassen 4X (3 min. Elk) en detector Abs werden 80 pi reactiebuffer toegevoegd en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Na wassen objectglaasjes met TBST ongebonden detector Abs verwijderen, 80 ui biotine-tyramide oplossing (5 ug /ml in 50 mM glucose /PBS) bereid uit 400 ug /ml in ethanol (Perkin-Elmer Life Science) werd toegevoegd en geïncubeerd gedurende 15 min in het donker. GO /HRP-gemedieerde tyramide signaalversterking proces werd beëindigd door wassen met TBST 4X, 3 min elk. Lokale depositie van biotine-tyramide werd gedetecteerd door incubatie met streptavidine (SA) -Alexa647 (Invitrogen) bij 0,5 ug /ml in 2% BSA /0,1% Triton /TBS gedurende 40 minuten. Na voltooiing van de incubatie werden de glaasjes gewassen 4X met TBST, gedroogd en bewaard in het donker totdat ze via een microarray scanner werden afgebeeld.

Voor CEER gegevensanalyse objectglaasjes werden gescand op vier PMT versterkingsinstellingen de effectieve dynamische vergroten range. -Achtergrond gecorrigeerde signaal intensiteiten werden gemiddeld voor plekken afgedrukt in drievoud. Verschillende criteria werden gebruikt om gegevens voor verdere analyse, met inbegrip van beperkingen op plaatse voetafdrukken, variatiecoëfficiënt voor spot herhalingen, en de algehele pad achtergrond te filteren. Voor elke bepaling werd een standaardcurve gegenereerd serieel verdund control cellysaten bereid van cellijnen met goed gekarakteriseerde signaaltransductie proteïnen. Gegevens geschikt waren om een ​​vijf-parameter vergelijking afgeleid als een functie van capture-antilichaamconcentratie en PMT. De standaardcurve voor elke merker geschikt was als een functie van log signaalintensiteit, gemeten als relatieve fluorescentie eenheid (RFU) versus log concentratie van cellysaten en op het standaard cellijnen. Zo werd standaardcurve serieel verdund cellysaten bereid van BT474 gebruikt om HER2 expressie en de mate van fosforylering in elk monster (fig S2) normaliseren. Vandaar dat een monster met 1 CU van HER2 expressie heeft de RFU waarde gelijk aan RFU waarde van 1 standaardwerk BT474 cel. Als referentie cellen hebben 1~2 × 10 ^{6 HER1 of HER2-receptoren per cel met circa 10% gefosforyleerd receptoren, 1 CU is de uitdrukking van 1~2 x 10 6 RTK of 1~2 × 10 5 gefosforyleerd RTK [6]. De detectiegrens (LOD) waarde CU werd vastgesteld dat minder dan 1 CU zowel expressie en activatie van HER2 zijn. Individuele voorspellingen van elke verdunning en winst werden gemiddeld tot één laatste voorspelling.}

afgeknotte HER2 Enrichment

Full-length p185-HER2 receptoren werden uitgeput van tumorweefsel lysaten met behulp van magnetische-kraal gekoppelde antilichamen specifieke extracellulaire domein (ECD) van HER2 zie figuur S3. Verkregen p185 HER2 verarmd lysaten die bevatte verrijkte afgeknot HER2 (t-HER2) receptoreiwitten zonder de ECD, werden gebruikt voor daaropvolgende kwantificatie van t-HER2 expressie en fosforylering met de desbetreffende CEER assays. Een afgesneden waarde van 500 CU werd gebruikt om te scoren voor p95HER2 positiviteit per 20 ug weefsel geanalyseerd. De totale p95HER2 assay uitlezing was ten opzichte van de signalen gegenereerd door de standaard curves gegenereerd met een controle cellysaat van de BT474 borstkanker cellijn.

Celcultuur en reagentia

CEER assay controle cellijnen , MDA-MB-468, T47D, HCC827 en BT474 cellen met verschillende mate van ErbB-RTK expressie werden verkregen van ATCC en gekweekt bij 37 ° C in 5% CO _{2 - MDA-MB-468 (Dulbecco's minimaal essentieel medium (DMEM) + 10% FBS), BT474 (DMEM + 10% FBS) en HCC827 en T47D (RPMI 1640 + 10% FBS, 0,2 U /ml runder insuline). Cellen werden geteld en gewassen met 1 x PBS voordat groeifactor stimulatie. MDA-MB-468 cellen werden gestimuleerd met 100 nM epidermale groeifactor (EGF) en transformerende groeifactor a (TGFa), werden T47D cellen gestimuleerd met 20 nM hereguline β (HRGβ) of 100 ng /ml insuline-achtige groeifactor-1 (IGF1) in serumvrij kweekmedium voor 5 of 15 minuten. Gestimuleerde cellen werden gewassen met 1 x PBS en vervolgens gelyseerd (lysis buffer: 50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 en 2 mM Na 3VO 4) en op ijs bewaard 30 min alvorens de supernatant voor verdere analyse of bewaard bij -80 ° C.}

CEER teller bepalen en warmte kaart clustering

positiviteit voor een bepaalde biomarker gedefinieerd als groter dan de derde kwartiel voor een individuele biomarker in de patiëntenpopulatie van deze studie. Patiënten werden gerangschikt op basis van de waarde van het CU CEER test voor een bepaalde biomarker. Die patiënten groter zijn dan het derde kwartiel cutoff werden beschouwd als het grootste risico op verhoogde biomarker niveaus en dus potentieel geactiveerd signaal paden hebben. Daaropvolgende survival analyse werd gedaan om de voorspellende kwaliteit van deze cutoffs te beoordelen.

De biomarker profiel van de tumor monsters werd vertegenwoordigd door een warmte-kaart. Elke cel werd ingekleurd op basis van de deciel rang van de activering van die markering. Elke marker werd volgorde van decielen, vertegenwoordigd door een duidelijke schaduw, met de weegschaal met vermelding van de kleur. Zowel de rij (patiënt) en de kolom (marker) clustering werd getoond. De integrale koppeling algoritme werd gebruikt om een ​​hiërarchische cluster (of dendrogram) door achtereenvolgens groeperen de gecorreleerde waarnemingen waarvoor hclust functie R, aangeroepen door de heatmap.2 functie beschikbaar gplots de bibliotheek van het statistische systeem R verkrijgen: A Taal en Environment for Statistical Computing (http://www.r-project.org/). Subgroepen van merkers werden door de clustering vergelijkingen van merker profielen toegestaan ​​voor patiënten.

CTC ATC en isolatie

Voor CTC evaluatie, 7,5 ml bloedmonsters werden getrokken in 10 ml ethyleendiamine geëvacueerd tetraazijnzuur (EDTA) buizen. De CellSearch System (Veridex) werd gebruikt voor immuno-magnetische scheiding CTC volgens het protocol eerder beschreven [6] met ferrovloeistoffen geconjugeerd Ab tegen epitheliale cel adhesiemolecuul. ATC beoordeling werden celinhoud verrijkt 50-100 ml ascites vloeistof door centrifugatie en immuno-magnetische tumorcel isolatie werd uitgevoerd op soortgelijke wijze. Meerdere sets van ATC's werden behandeld met een cocktail van groeifactoren (EGF, HRG, HGF en IGF-1) met of zonder lapatinib en PHA-665752-remmer combinatie.

Resultaten en Discussies

Patient kenmerken

Kenmerken van 434 GC patiënten worden gegeven in Tabel 1. Alle patiënten kregen gastrectomies met D2 lymfeklierdissectie met 242 (55,8%) patiënten die subtotaal gastrectomies. Volgens AJCC 2002 staging-systeem, 86 patiënten hadden een pathologische stadium I, 116 had fase II, 126 had stadium III en 106 had stadium IV (35 patiënten met gemetastaseerde M1) GC. Ten tijde van de analyse, 226 patiënten waren dood en 237 patiënten hadden recidief gedocumenteerd. 70 patiënten hadden zegelring cell carcinoma. De 5-jaars algehele en ziektevrije overleving tarieven waren 52,4% en 50,0% respectievelijk. Alle primaire GC weefsels werden verkregen op het tijdstip van de operatie en direct snel bevroren voor toekomstige moleculaire analyse.

-CEER gebaseerde bepalingen blijkt heterogeniteit van HER2 expressie en de aanwezigheid van HER2 afgeknotte variant p95HER2 in HER2 (+) gastric kankers

We hebben eerder gemeld de ontwikkeling van immuno-microarray gebaseerde CEER assays [6], [15]. We gebruikten de CEER gebaseerde HER2 assay de HER2-status van de HER2 (+) en HER2 onderzoeken (-) monsters in onze GC patiëntenpopulatie die werden gescheiden op basis van standaard IHC HercepTest /FISH analyse. Het voordeel van CEER-gebaseerde testen is de hogere gevoeligheid en specificiteit in vergelijking met IHC-gebaseerde testen [6]. Gebaseerd op de huidige HER2 (+) definities van GC's [13], [14], dat wil zeggen, monsters met een HER2-IHC score van 3+ of 2+ en een positieve HER2
genamplificatie status 50 van 434 (11,5%) monsters in onze GC patiënt cohort waren HER2 (+) van IHC HercepTest /FISH-analyse (Tabel S1). Daarentegen volgens de IHC richtlijnen specifiek voor borstkanker, slechts 78% (39/50) van deze patiënten HER2 (+) (Tabel S1) die de verschillen in scorecriteria voor HER2 positiviteit tussen maag- en borstkanker. Een meerderheid van de HER2 (+) GC's (36 van de 50 monsters (72%)) waren van de intestinale subtype in plaats van de diffuse of gemengd type GC in overeenstemming met gepubliceerde rapporten [13], [16], [17].

-HER2 CEER gebaseerde assay toonde aanzienlijk hoger HER2 expressie IHC /FISH HER2 (+) tumoren in vergelijking met die in de HER2 (-) tumoren (met een gemiddelde waarde van 77,9 vs. 4,3 CU CU, p-value 8.18E-10) zoals getoond in figuur 1A. De CEER-gebaseerde HER2 gegevens worden gepresenteerd in CU, een standaard functionele eenheid gebaseerd op cellijn regelt met bekende HER2 expressie [6], dat de vergelijking van HER2 expressie over monsters mogelijk maakt. Slechts 32/50 of 64% van IHC /FISH HER2 (+) GC toonde HER2 expressie door CEER en er was een aanzienlijke heterogeniteit in HER2 expressie in deze monsters zoals blijkt uit de kwantitatieve CEER uitlezingen. Heterogeniteit van HER2 expressie kan de reden voor slechts een matige mate van concordantie (87,5%) tussen de IHC en FISH uitlezingen voor HER2 in de ToGA proef [12] uit te leggen. Deze discrepantie zou rechtstreeks van invloed op de uitkomst van HER2-gerichte therapieën, zoals trastuzumab in GC. Bovendien, vanwege de hoge gevoeligheid van de assay CEER werd vastgesteld dat -20% van de IHC /FISH HER2 (-) GC nog uitgedrukte totaal HER2 zij het duidelijk lager niveau dan de HER2 (+) patiëntenpopulatie
.

de CEER gebaseerde assay p95HER2 platform, werden verkorte vormen van HER2 detecteerde specifiek, naast volledige lengte HER2 in GC voor de eerste keer. p95HER2 expressie werd geanalyseerd 31/50 HER2 (+) monsters en 27/384 HER2 (-) monsters) die een significante full length HER2 expressie aangetoond CEER (Figuur 1B). De incidentie van p95HER2 in HER2 (+) GC was ~77% (in 24/31 monsters) (Tabel S1). Soortgelijke volledige lengte HER2 expressie, de meeste p95HER2 expressie (79% van p95HER2 uitgedrukt in HER2 (+)) werd gedetecteerd in intestinale soort GCs. p95HER2 expressie werd ook waargenomen bij een klein percentage van HER2 (-) GC (37% of 10/27 monsters) die volledige lengte HER2 expressie aangetoond. De gemiddelde p95HER2 HER2 expressie in (+) GC monsters was significant hoger dan die waargenomen bij HER2 (-) GC (5083,6 CU HER2 (+) vs 437,0 CU HER2 (-), p-waarde = 1.27e-05 ). p95HER2 kan bijdragen aan niet-responsiviteit trastuzumab GC tumoren als in 70-80% van HER2 overexpressie borstkanker [18]. Trastuzumab plus standaard chemotherapie gerenderd een totale respons van slechts 47% in HER2 (+) GC's in de ToGA proef [12] aangeeft bestaan ​​van mogelijke mechanismen trastuzumab weerstand en ons onvermogen om nauwkeurig te selecteren trastuzumab responders. Om klinisch valideren p95HER2 expressie met trastuzumab weerstand die controversieel is vooral door de recente tegenstrijdige bevindingen uit de GeparQuattro borstkanker studies [19] en rigoureuze p95HER2 assay verfijning qua klinisch relevante diagnostische assay cut-off bepalingen en toepasbaarheid in een klinische context vereist. Een validatie van p95HER2 expressie is gepland in een fase II neoadjuvante lapatinib plus chemotherapie klinische studie bij patiënten GC en verschillende studies suggereren het gebruik van lapatinib in p95HER2 (+) vormen van kanker [20], [21].

Bij elkaar genomen , onze data duidelijk de HER2 status GC en aantonen van het nut van CEER-gebaseerde HER2 diagnostiek in GC patiënt monsters voor het bepalen van hun accurate volledige lengte en afgeknotte HER2 expressie. De ontwikkeling van dergelijke diagnostiek sterk zal invloed hebben op de nauwkeurige selectie van HER2 (+) GC's die responders trastuzumab en andere HER2 richtende middelen. We hebben eerder gemeld het gebruik van CEER-gebaseerde diagnostiek bij HER2 borstkankerpatiënten [6], [15] dat een hogere gevoeligheid en specificiteit te zien dan bij IHC-gebaseerde diagnostiek.

maagkanker tonen gelijktijdige activering van signaalroutes

We gebruikten de CEER assay direct op GC monsters op de aanwezigheid van totaal en gefosforyleerd (geactiveerd) vormen van een aantal signaalmoleculen die bekend zijn drug targets beoordelen: deze omvatten verscheidene RTK (HER1, HER2, HER3, cMET, IGF1R) en PI3K. Representatieve beelden gemultiplexte CEER route-arrays uit acht verschillende monsters worden getoond in figuur 2A. Deze beelden tonen duidelijk de heterogeniteit in geactiveerde pathway handtekeningen die heerst in GC. Bijvoorbeeld, zowel HER1 /HER2 worden coactivated in monsters 1 en 6, terwijl slechts HER2 wordt geactiveerd in steekproef 2, hoewel HER1, HER2 en CMET worden uitgedrukt om een ​​hoog niveau. Sample 5 toont activering van 5 geanalyseerde RTK zoals de stroomafwaartse PI3K en Shc trajecten. Het volgende hoofdstuk beschrijft de signaleringsroute heterogeniteit waargenomen in onze GC patiëntencohort zoals bepaald door de CEER assays.

Tumoren van 202 patiënten (46,5%) had geen detecteerbare activering van de geteste in onze studie RTK's. Route activeringspatronen voor de rest van de tumoren, zoals weergegeven in een traject clustering analyse (figuur 2B) sterk uiteen enkele GC tonen gelijktijdige activering van meerdere RTK zoals HER2 /HER3, HER1 /2/3, HER1 /3 /cMet of HER3 /cMet terwijl anderen werden gefosforyleerd alleen een enkel eiwit. De tumor inhoud van alle geanalyseerde monsters was > 70% op basis van hun histologisch onderzoek. Echter, de pan-cytokeratine (pan-CK) expressie was duidelijk variabele suggereren heterogeniteit in de epitheliale inhoud van GC. Op basis van deze profilering, gecategoriseerd we de 434 GC monster cohort op basis van hun RTK activering handtekeningen en HER2-status

HER as in maagkanker. (Tabel 2 & Tabel S1).

Tenminste een receptor lid van de HER as werd geactiveerd 41% van de patiënten GC. HER2-fosforylatie werd gedetecteerd niet alleen 50% van HER2 (+) GC patiënten, maar ook in ~22% HER2 (-) kankers in overeenstemming met de waargenomen totale HER2 expressie eerder beschreven. 16/25 HER2 (+) monsters die aantoonden geactiveerd HER2 drukte ook p95HER2. Evenzo HER3 werd gefosforyleerd in een hoger percentage HER2 (+) GC (36%) in vergelijking met HER2 (-) kanker (~24%). Echter, gefosforyleerde HER1 niet zo'n voorkeur hebben en is equivalent geactiveerd beide GC (26% in HER2 (+) en 25% bij HER2 (-)). Bovendien hebben de meeste van de HER-lid geactiveerde GC tumoren (~64%) vertoonde een gelijktijdige activering van andere RTK's, d.w.z. CMET of IGF1R. Histologisch meerderheid van de HER2 (+), intestinale GC Type uitgedrukt geactiveerde HER2 (in 22/36 of ~61%) gevolgd door HER3 (in 13/36 of ~36%) met een totaal 36% van intestinale soort GC expressie een geactiveerd HER2 pathway. Overall, HER2 activatie was geconcentreerd in intestinale type (55/154 of 35,7%) in vergelijking met het diffuse type kanker (43/225 of 19,1%). Daarentegen werd geactiveerd HER1 eveneens waargenomen in beide intestinale-type (38/154 of 24,7%) en diffuse type (58/225 of 25,8%) GC. Geactiveerde HER3 was ook gelijkwaardig aanwezig (29,9% en 21,8%) tussen beide Lauren's classificatie subtypes.

Als de signaalfunctie van de HER kinase-as is afhankelijk van de geactiveerde receptor dimerisatie, hebben we gekeken naar de verschillende paren van HER-lid coactivations. Coactivation van HER2 met HER3 werd de voorkeur in HER2 (+) kanker (13/50 of 26%) met 7/13 HER2: HER3 geactiveerd GC zonder HER1 coactivation. Ongeveer 54% van de HER2: HER3 coactivated HER2 (+) GC's co-expressie gebracht p95HER2. Anderzijds, HER2 (-) GC vertoonde geen voorkeur voor een specifieke HER kinase dimeer paar met drie mogelijke geactiveerde dimeer paren (HER1: HER2, HER1: HER3 en HER2: HER3) uitgedrukt in -15% van zowel HER2 (-) monsters. Triple activering van HER1 /2/3-receptoren werd waargenomen bij 11,1% van GC's met een marginaal hogere distributiekosten in HER2 (-) kankers

CMET geactiveerd maagkanker (tabel 3 & Tabel S1).
.

Net als HER1 werd cMet fosforylatie equivalent verdeeld HER2 (+) (22%) en HER2 (-) (-25%) GC. Bovendien geactiveerd CMET verdeling op basis van de Lauren histotype was vergelijkbaar tussen de intestinale (48/154 of 31,2%) en diffuse-type (55/225 of 24,4%) GC.

De meerderheid van CMET geactiveerd GC monsters (~ 71% of 77/108) toonden een gelijktijdige activering van HER kinase receptor leden. Alle monsters met een gefosforyleerd CMET toonde een CMET
amplificatie (gegevens niet getoond). We onderzochten de voorkeur HER as receptoren die cross-talk met de CMET pad. Van de 77 GC monsters aantonen van een CMET coactivation met een HER-lid, 66 monsters (~86%) waren met HER1. Overall Ook werd CMET voorkeur coactivated met HER1 (15,2%) in vergelijking met HER2 (10,1%) of HER3 (9,7%). Deze waarnemingen suggereren een mogelijke overspraak tussen de CMET en HER1 signaalwegen in GC. CMET activering nooit co-bestaan ​​met geactiveerde HER3 tenzij HER1 en /of HER2 ook werden gefosforyleerd in hetzelfde monster. Ongeveer 7% van de GC patiënten toonde een coactivation van alle drie de HER-as receptor leden CMET. Geactiveerde CMET samen bestaan ​​met p95HER2 expressie monsters 5/24 en 1/10 HER2 (+) en HER2 (-) GC respectievelijk

IGF1R geactiveerd maagkanker (tabel 4 & Tabel S1)..

Net als HER3 activering, de signaleringsroute aangedreven door IGF1 receptor was actief in een hoger percentage HER2 (+) GC (30%) dan de HER2 (-) GC (24,7%). Zoals waargenomen met gefosforyleerde HER3, geactiveerde IGF1R was gelijkwaardig verdeeld tussen de darm (26%) en diffuse type (~24%) GC. Deze verdeling leidt ons om te onderzoeken of er een IGF1R was: HER3 coactivation in het GC patiënt cohort. IGF1R inderdaad maximaal coactivated met p-HER3 vooral in HER2 (+) GC's, waar 22% of 11/50 HER2 (+) GC toonde een IGF1R: HER3 coactivation. In HER2 (-) GC, percentage IGF1R coactivation met HER3 (in 51/384 monsters of 13,8%) was vergelijkbaar met IGF1R coactivation met HER1 (in 53/384 monsters of 13,3%). IGF1R: HER2 coactivation (in 45/384 monsters of 11,7%), gevolgd vlak achter. Over het geheel genomen 34/434 GC monsters aangetoond coactivation van alle leden van de HER kinase as IGF1R waarvan 28 monsters ook blijk gegeven van een CMET coactivation. Echter CMET was zelden co-geactiveerd met IGF1R in afwezigheid van een HER kinase receptor lid coactivation. Bovendien, c-MET: IGF1R coactivations werden voornamelijk waargenomen bij HER2 (-) GC

GC monsters werden hiërarchisch geclusterd op basis van hun deciel-based marker activering profielen (Figuur 2B).. De analyse toonde aan dat CMET: HER1, HER2: HER3 en IGF1R: PI3K activering patronen waren nauw gecorreleerd met de CMET: HER1 cluster vormen een aparte deelverzameling.

• PLoS ONE: Expressie van AFP en STAT3 is betrokken bij Arseentrioxide-geïnduceerde apoptose en remming van proliferatie in AFP-producerende maagkanker Cellen
• PLoS ONE: Functional Promoter -308G > een variant in tumornecrosefactor a-gen wordt geassocieerd met het risico en de progressie van maagkanker in een Chinese bevolking