PLoS ONE: roman Proteomika-Based Klinička dijagnostika Tehnologija Identificira Heterogenost u aktiviranim signalnih putova u želučanom Cancers

Sažetak pregled

Svrha pregled

Cilj ovog istraživanja bio je iskoristiti proteomika-based kolaborativni se enzim Enhanced reaktivne (CEER) imunološkim testom ispitati protein tirozin fosforilacije što dijagnostičkih biljega u želučanog karcinoma (GCS). pregled

analizirani su eksperimentalni dizajn pregled

proteini lizat iz svježe smrznute 434 poodmakloj fazi GCS za fosforilaciju HER1, HER2, HER3 p95HER2 cMET, IGF1R i PI3K. Obrasci za aktivaciju puteva su odijeljene na osnovu tumora status HER2. Hijerarhijski klastera je korištena za određivanje puta prijenosa coactivations u GCS. Prognostička vrijednost uzoraka aktivacije signalnog puta je određena korelaciju bolesti bez trajanje života različitih GC podskupina pomoću Kaplan-Meier analiza preživljavanja. CEER je također koristi kako bi se utvrdilo prisustvo tirozina fosforilirane signalnih kaskada u cirkulirajućih stanica (CTCs) i ascites tumorskih stanica (ATCs). Pregled

Rezultati

Koristeći nove dijagnostiku imunološkim testom, CEER, mi utvrdi prisutnost p95HER2 i istovremeno aktiviraju signalne putove u GC tumorskim tkivima, CTCs i ATCs izolirati iz GC pacijenata po prvi put. p95HER2 se izražava u ~77% HER2 (+) GCS. Približno 54% GCS ima aktivirani su HER1, HER2, HER3 ili cMET IGF1R i pokazuju lošiju prognozu nego one gdje su ti receptori tirozin kinaza (RTK), ne aktiviraju. Hijerarhijski grupiranje RTK otkriva suradnju klastera fosforiliranog HER1: cMET, HER2: HER3 i IGF1R-PI3K. Coactivation HER1 s cMET čini GCS s opstanak kraćeg slobodnog od bolesti u odnosu na samo cMET aktivirana GCS. Pregled

Zaključci

Naša studija naglašava korisnost nove kućne dijagnostiku tehnologije, CEER koja ima snažne implikacije za razvoj lijekova i terapijskom praćenju. CEER se koristi da bi se povećala razumijevanje aktiviranih signalnih putova u naprednim GCS koji može značajno poboljšati njihovu kliničku upravljanje kroz precizan odabir bolesnika za ciljane terapeutika pregled

Izvor:. Lee J, Kim, Kim P, Liu X, lee T, Kim KM, et al. (2013) roman Proteomika-Based Klinička dijagnostika Tehnologija Identificira Heterogenost u aktiviranim signalnih putova u karcinome želuca. PLoS ONE 8 (1): e54644. doi: 10,1371 /journal.pone.0054644 pregled

Urednik: Anthony W. I. Lo, Kineskog sveučilišta u Hong Kongu, Hong Kong pregled

Primljeno: 20. rujna 2012; Prihvaćeno: 13. prosinca 2012; Objavljeno: 25 siječanj 2013 pregled

Copyright: © 2013 Lee et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Autori nemaju podršku ili sredstva za prijaviti pregled

suprotstavljenih interesa. Dok PK, XL, TL, NH, GH, AK, AJ, GM, GL i SS su zaposleni Prometheus Laboratories, to ne mijenja autori ' pridržavanje svih PLoS ONE politika na razmjenu podataka i materijala. pregled

Uvod pregled

molekularno ciljano agenti su ubrzani području onkologije. S obzirom da je otprilike polovica komponente tirozin kinaze ljudskog kinome je uključena u humanim karcinomima, to je ne čudi da je veliki dio sadašnjih lijekova ciljati različite kinaze [1], [2]. Coactivation receptorskih tirozin-kinaza (RTK), uočen je u podskupove više vrsta raka, kao što su glioblastoma multiforme [3], raka dojke [2], [4], [5], [6], [7], karcinom pluća [8 ], [9], karcinom glave i vrata [7] i rak želuca [4], [5], [6] time što ukazuje da im je to potrebno za napredovanje tumora i preživljavanja. Ova zapažanja pružaju dovoljno kliničkog opravdanje za probir aktiviraju RTK u karcinomima koji može voditi terapijsko ciljanje i potencijalno pružiti znanje za racionalnim kombiniranih terapijskih strategija. Međutim, samo analizu ekspresije ili aktivacije statusa jednog RTK koji može biti specifična ciljni protein za određenog terapijskog nedovoljna za odabir pacijenata kako često puta pacijenti ne reagiraju na terapiju unatoč ekspresiju mete. Nekoliko potencijalnih problema može biti odgovoran za takav nedostatak terapeutske koristi od ciljanih agenata, npr 1) istovremene aktivacije paralelnih ili alternativni putevi koji zaobilaženjem prvotno ciljane protein (i), i 2) kontinuirano promjene u molekularnoj i patoloških obilježja neoplastičnim tkiva tijekom progresije raka. Dakle, to bi bilo idealno imati pratilac dijagnostički alat koji bi se mogao primijeniti na ograničenim količinama kliničkih uzoraka za hvatanje sveobuhvatne složenost fosforilirane signalne mreže u tumora, osim izravnog cilja RTK proteina za praćenje "razvija" bolest . pregled

Ciljano fosforilacija analiza kliničkih uzoraka je otežano zbog nedostatka lako iskoristive kliničkim testovima koje su dovoljno osjetljivi da funkcionira na ograničenim količinama kliničkih tkiva. Mi smo ranije izvijestili razvoj novih blizine bazi imuno testom a, Kolaborativni enzima Pojačan reaktivni-imunološkim (CEER Slika S1) [6], koja je pogodna za analizu kako ukupan ekspresiju i aktivaciju statusa proteina signalne kaskade. CEER može se provesti u multipleksirano način izravno na kliničkim uzorcima koje mogu biti dostupne u ograničenim količinama. Test CEER koristi formiranje jedinstvena imuno-kompleksa zahtijeva suradnju lokalizaciju dva detektora enzim-konjugirani-antitijela nakon ciljne proteine ​​su uhvaćeni na mikročipa. Ovaj format omogućuje učinkovitu i osjetljivu detekciju RTK, kao i nizvodno puta prijenosa proteina do razine jedne stanice (osjetljivost od oko 100 zeptomoles). U ovom istraživanju smo koristio CEER test za proučavanje složenosti signalnog puta u želučanog karcinoma (GC). Pregled

GCS su vodeći uzrok smrti od raka u svijetu s incidencijom od 18,9 /100.000 slučajeva godišnje i smrtnosti stopa 14,7 /100.000 godišnje [10] i su najčešći zloćudni tumor u Koreji [11]. Metastatskim GC ostaje terapijski izazov za medicinske onkologa zbog lošu prognozu. Trenutačno, trastuzumab je jedini aktivni ciljana tvar koja se pokazao učinkovit za GC u nasumičnom ispitivanju faze III [12]. Dok je aktivacija nekoliko RTK je prijavljen u GCS, njihov utjecaj na GC prognozu je nepoznat. To je važno za razvoj i primjenu lijekova za kliničko upravljanje GCS. Pregled

U ovom istraživanju smo koristili multipleksirani CEER platformu za određivanje razine aktiviranih RTK (HER1, HER2 skraćenih varijanata HER2, tj p95HER2, HER3 cMET, PI3K i IGF1R) u 434 svježih smrznuti GC tkiva i pokušao kategorizirati pacijente GC u potencijalne podskupine na temelju njihovih proteinskih uzoraka aktivacijski put. Opazili smo više signala protein aktivacija u podskupinama GC tumora koje su povezane s preživljavanjem bez bolesti (DSF) u ovih bolesnika. Stoga smo hipotezu da suvišan puteva aktiviranje ulaza može dovesti do rezidualnog nizvodno signala u GCS, čime se ograničava učinkovitost anti-tumorsku monoterapija usmjerene protiv pojedinačnih RTK. Na kraju, mi smo razvili potencijalno snažan metodologiju koja može omogućiti kliničarima da prati osnovne i rastuće promjene u tumorskim profila RTK aktivacije tijekom liječenja pomoću cirkulirajućih stanica tumora (CTCs) i maligne stanice izolirane iz peritonealnoj tekućini (ascites stanice tumora ili ATCs ). Uzeti zajedno, naša studija pruža dokaze za istovremene aktivacije RTK u GC ljudskim tkivima, osim uspostave CEER kao efikasan klinički alat za dijagnosticiranje i praćenje RTK aktivaciju tijekom GC liječenja ili progresije bolesti. Pregled

Materijali i Metode pregled

Pacijent Skupina i uzorak tkiva za nabavu pregled

istraživanje je provedeno nakon odobrenja Samsung Medical Center Institutional Review Board (SMC IRB) za informirani pristanak odricanje, koristeći arhivske tkiva retrospektivnu kliničkih podataka. Uzorci primarni tumor se svi prikupljeni iz Samsung Medical Center. Svi pacijenti podvrgnuti gastrektomija s radikalnim limfnog čvora disekcija s namjerom izliječenja. Od ožujka 2001. do veljače 2005., 447 svježe smrznute tkiva dobiveni od 434 bolesnika prikupljeni su iz kirurški reseciranih primarnih želučanih tumora i bili su dostupni za konačnu analizu. Sve svježe smrznute tkiva se skupljaju (unutar < 30 min) pri kirurškog područja te su odmah nakon toga brzinski zamrznute i pohranjene u tekućem dušiku sve do ubuduće. Uzorci tumora su potvrdila prisutnost > 70% površine tumora od strane patologa. Za analizu, mali komadi smrznutog tkiva (10 um odjeljak x 3) pripravljeni su primjenom prechilled britvicom i lizira u 100 ul pufera za lizu. Dobivene lizati su pohranjeni na -80 ° C do naknadne analize

Patohistološki pregled i HER2 utvrđivanje statusa pregled

Svi dostupni H &. E-obojeni slajdovi su centralno pregledao dva patologa (ID, KKM ) na eksperimentalnu patologiju jezgri Samsung Cancer Research Institute. Svi uzorci tumora su bili iz kirurški reseciranih primarnih želučanih tumora. Status HER2 je određena IHC i ribe. IHC analiza je izvršena pomoću HercepTest ™ (Dako, Glostrup, Danska). HER2 protein razinama su označeni kao 0 do 3+, u skladu s preporukama konsenzus panel na HER2 bodovanje za GC [13], [14]. Za ribe, PathVysion HER2 DNA sonde kit (Abbott, Des Plaines, IL) se koristi. Ariol slika sustava analize korištena je brojati hibridizacije signale (Genetix, San Jose, SAD). Svi uzorci s omjerima HER2 /CEP17 između 1,8 i 2,2 su označeni ručno brojanje više od 60 ne-preklapajuće stanice. Omjeri > 2,2, 1,8 do 2,2 ili < 1,8 klasificirani su kao pozitivne, dvosmisleni ili negativan za pojačanje, respektivno. Kromosomska 17 polysomy je definirana kao CEP17 signal koji je imao više od šest primjeraka u prosjeku po stanici. Od 447 uzoraka, 434 primjerci su bili uključeni u konačnu analizu. Pregled

Collaborative enzim Poboljšana jalove-imunološka ispitivanja (CEER) pregled

CEER stakalca su tiskani, inkubirani s GC lizati i obrađivati ​​kao što je ranije opisano [ ,,,0],6]. Slajdovi su skenirani na četiri postavke fotomultiplikacijskom (PMT) dobitak za povećanje efektivne dinamički raspon. Podaci su uneseni u jednadžbu pet parametra izveden kao funkcija hvatanje-antitijelo koncentracije i PMT i predstavljeni u izračunatom jedinica (CU). Pregled

multipleksirano-mikropostrojima tisak. Pregled

Snimanje antitijela su tiskane na nitroceluloze obložena stakalca (ONCYTE®, Grace Bio-Labs) koji koriste ne-kontakt pisače (Nanoplotter, GeSiM). Promjer točka bila je približno 175 um. Stakalca su držane u suhom komori pri 4 ° C. Približno 500 ul hvatanje Ab tiskani u triplikatu serijske koncentracije razrjeđenju od 1 mg /ml, 0.5 mg /ml, 0,25 mg /ml. Pročišćeni miš IgG služili su kao negativne kontrole. Imuno-array klizne konfiguracije prikazane su na Slici S1. Pregled

Antitijelo konjugacije i pročišćavanja. Pregled

ciljno specifična antitijela (mišje monoklonsko protiv specifičnih epitopa na humanim signalnog proteina) i odgovarajućih detektora enzima glukoza oskidazu (GO) ili peroksidaza iz hrena (HRP), aktivira se s bi-funkcionalnim poprečni linker, sukcinimidil-4- (N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilata (SMCC), i zajedno dajući antitijelo-enzim konjugata. Konjugati su pročišćeni pomoću HPLC. Antitijela aktivnosti u Očišćene konjugata su bile određene od strane konkurencije ELISA i enzim aktivnosti post-konjugacija su detektirani funkcionalnim testovima specifičnih za svaki detektor enzima. Pregled

CEER testovi. Pregled

Immuno-microarray slajdovi se ispiru 2X TBST (50 mM Tris /150 mM NaCl /0.1% Tween-20, pH 7.2-7.4), blokirane sa 80 ul pufera za blokiranje Whatman 1 sat na sobnoj temperaturi, zatim se ispere 2x s TBST. Serijski razrijeđenog lizata kontrole ili uzoraka u 80 uL pufera za razrjeđivanje (2% BSA /0,1% TritonX-100 /TBS, pH 7.2-7.4) dodani su u određenim pod-polja na stakalca i inkubirane tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Stakalca su isprani 4X (3 min. Svaki), a detektor Abs dodano je u 80 ul reakcijskog pufera i inkubira 2 sata pri sobnoj temperaturi. Nakon slajdovi pranje s TBST da se ukloni nevezani detektora Abs, 80 ul biotin-tiramidom otopine (5 ug /ml u 50 mM glukoze /PBS), pripravljen je iz 400 ug /ml u etanolnoj otopini (Perkin-Elmer Life Science) se doda i inkubira za 15 minuta u mraku. GO /HRP-posredovane tiramidom proces signal pojačanje prestalo ispiranjem s TBST 4X, 3 min svaki. Lokalna naslaga biotin tiramidom se detektirati inkubacijom sa streptavidin (SA) -Alexa647 (Invitrogen) na 0,5 ug /ml u 2% BSA /0,1% Triton /TBS 40 min. Po završetku inkubacije, stakalca su isprani 4X s TBST, osuši i čuva u mraku dok su promatrani preko mikropolja skeneru. Pregled

CEER analizu podataka, stakalca su skenirani na tri postave PMT osjetljivost povećati učinkovite dinamiku raspon. Pozadina korigiran intenziteta signala su u prosjeku za spotova tiskani u tri primjerka. Nekoliko su kriteriji korišteni za filtriranje podataka za daljnju analizu, uključujući ograničenja na licu mjesta otiske, koeficijent varijacije za spot ponavljanja, dok je sveukupno slabljenja pozadini. Za svaki pokus, standardna krivulja je dobivena iz serijski razrijeđenim staničnih lizata kontrole pripravljene iz staničnih linija sa dobro okarakteriziranih signalnog proteina. Podaci uneseni su u jednadžbu pet parametra izveden kao funkcija hvatanje antitijelo koncentracije i PMT. Standardna krivulja za svaki biljeg je odgovarao kao funkcija intenziteta log signala, mjerena kao relativne fluorescencije jedinice (RFU) u odnosu na koncentraciju logaritamske staničnim lizatima te ih uspoređuju se standardnim staničnim linijama. Na primjer, standardne krivulje serijski razrijeđenim staničnih lizata pripravljenim iz BT474 korišten za normalizaciju HER2 ekspresiju i stupanj fosforilacije u svakom uzorku (Slika S2). Dakle, uzorak s 1 CU HER2 izražavanja ima RFU vrijednost jednaku RFU vrijednosti od 1 standardne referentne BT474 stanice. Kao referentni stanice imaju 1~2 × 10 ^{6 HER1 ili HER2 receptora po stanici s oko 10% fosforilirane receptora, 1 CU predstavlja izraz 1~2 × 10 6 RTK ili 1~2 × 10 5 fosforilirane RTK [6]. Granica detekcije (LOD) vrijednosti po CU utvrđeno je da se manje od 1 CU i za izražavanje i aktivaciju HER2. Pojedini predviđanja iz svakog razrjeđenja i dobitak su u prosjeku u jednu, konačnu prognozu. Pregled}

krnjeg HER2 obogaćivanja pregled

Full-length p185-HER2 receptora su iscrpljene od lysates tumorskih tkiva pomoću magnetske kuglice kombinaciji antitijela specifični za ekstracelularne domene (ECD) HER2 kao što je prikazano na slici S3. Dobivena p185-HER2 osiromašene lizati, koji sadrži obogaćena okrnjeni HER2 (t-HER2) proteinskih receptora kojima nedostaje ECD, korišteni su za naknadno kvantifikaciju t-HER2 ekspresiju i fosforilacije pomoću odgovarajuće CEER metode. Jedan cut off vrijednost 500 CU je korišten u pogodak za p95HER2 pozitivnosti po 20 mg tkiva analizira. Ukupna p95HER2 Test očitanju u odnosu na signale generirane iz standardnih krivulja korištenjem generira upravljačke stanični lizat iz stanične linije raka dojke BT474.

kultura stanica i reagensima

CEER kontrolni pokus stanične linije , MDA-MB-468, T47D, HCC827 and BT474 stanice s različitim stupnjevima erbB-RTK ekspresije dobivene su od ATCC i rasle su na 37 ° C u 5% CO _{2 - za MDA-MB-468 (Dulbeccov minimalni esencijalni mediju (DMEM) + 10% FBS), BT474 (DMEM + 10% FBS), te HCC827 i T47D (RPMI 1640 + 10% FBS, 0.2 U /ml goveđeg inzulina). Stanice se broje i isprana 1 x PBS prije stimulacije faktora rasta. MDA-MB-468 stanice su stimulirane s 100 nM epidermalnog faktora rasta (EGF) ili transformirajući faktor rasta A (TGFa) T47D stanice su stimulirane s 20 nM heregulin P (HRGβ) ili 100 ng /ml faktora-1 inzulinu sličan rast (IGF1) u mediju za rast bez seruma 5 ili 15 minuta. Stimulirane stanice su isprane sa 1 × PBS i lizirane (pufera: 50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Trition X-100 i 2 mM Na 3VO 4), te držan na ledu za 30 minuta prije nego što se supernatant za naknadnom analizom ili čuvaju na -80 ° C. pregled}

određivanje marker CEER i grupiranje toplinska karta pregled

pozitivnosti za određenu biomarkera definirana je kao više od trećeg kvartila za pojedinog pokazatelja u populaciji bolesnika ove studije. Pacijenti su rangirani na temelju vrijednosti CU iz CEER testu za određenu biomarkera. Oni pacijenti veća od trećeg kvartila prekinuta su smatrani najvećim rizikom da imaju povišene razine biomarkera i stoga potencijalno aktiviranih putevi signala. Naknadna analiza preživljavanja je učinjeno kako bi se procijenila predikatska kvalitetu tih graničnih. Pregled

biomarker profil uzoraka tumora zastupao karti topline. Svaka stanica je colorized temelju decilni rangu aktivaciju tog markera. Svaki marker je bio rangiran od strane decilima, koju zastupa jasnim hladu, uz skali ukazuje na boju. I red (pacijent) i stupac (marker) grupiranje je prikazano na slici. Potpuna povezanost algoritam se koristi za dobivanje hijerarhijski klaster (ili dendrograma) po sekvencijalno grupiranje najviše dovesti u vezu zapažanja pomoću funkcije hclust u istraživanje, nazvan po funkciji heatmap.2 dostupan s gplots knjižnice statističkog okoliša R: jezik i Okoliš za statistiku računarstva (http://www.r-project.org/). Podskupine markera su definirani od strane klastera koji je dopustio usporedbe marker profila za pacijente. Pregled

CTC i ATC izolacija pregled

Za CTC procjeni, 7,5 ml uzoraka krvi su izvučeni u 10-ml evakuirano etilendiamina tetraoctena kiselina (EDTA) cijevi. CellSearch sustav (Veridex) je korišten za imuno magnetskog CTC izolacije prema protokolu prethodno opisanoj [6] koristeći ferrofluids konjugirani s protutijelom protiv epitelnih stanica adhezijska molekula. Za procjenu ATC, stanični sadržaj je obogaćen s 50 do 100 mL ascites tekućine centrifugiranjem i izolacija stanica tumora imuno magnetskog je izvedena na sličan način. Višestruki skupovi ATCs su tretirani s koktelima faktora rasta (EGF, Hrg, HGF, te IGF1) sa ili bez lapatinib i PHA-665,752 kombinacije inhibitora. Pregled

Rezultati i Rasprava pregled

Karakteristike pacijentica

Karakteristike 434 GC bolesnika prikazani su u tablici 1. Svi bolesnici primili gastrectomies sa D2 limfnog čvora disekcija s 242 (55,8%) bolesnika koji su primali međuzbroj gastrectomies. Prema AJCC 2002 staging sustava, 86 bolesnika je imalo patološkog stadija I, 116 je imao fazu II, 126 je imao fazu III i 106 imali stadiju IV (35 bolesnika s metastatskim M1) GC. U vrijeme analize, 226 pacijenata su bili mrtvi i 237 pacijenata je dokumentirano ponavljanje. 70 bolesnika je imalo karcinom pečatni prsten. 5 godina ukupni i bolesti bez preživljavanje bile 52,4% i 50,0%, respektivno. Svi primarni GC tkiva su nabavljena u vrijeme operacije i odmah nakon toga brzinski zamrznuti za buduću molekularnu analizu. Pregled

CEER analize na bazi pokazuju heterogenost ekspresije HER2 i prisutnosti HER2 krnjeg izvedbi p95HER2 u HER2 (+) želučanog raka

Mi smo ranije izvijestili razvoj imuno-mikropostrojima temelje CEER testovima [6], [15]. Koristili smo HER2 CEER-based istražiti HER2 statusa HER2 (+) i HER2 - uzorke u našoj GC bolesnika skupine koje su se izdvojili na standardnu ​​IHC HercepTest /FISH analize (). Prednost CEER-based testovima je njihova veća osjetljivost i specifičnost u odnosu na testovima IHC-based [6]. Na temelju trenutnog HER2 (+) definicije za GCS [13], [14], odnosno uzorci s HER2-IHC ocjenom 3+ ili 2+ i pozitivan HER2 pregled gena pojačanje status, 50 od 434 (11,5%) uzoraka u našem GC bolesnika skupini bili su HER2 (+) od IHC HercepTest /FISH analize (tablica S1). Nasuprot tome, u skladu sa smjernicama za IHC specifična za rak dojke, oko 78% (39/50) od ovih pacijenata su HER2 (+) (Tablica S1) koja pokazuje razlike u kriterijima za bodovanje HER2 pozitivnosti između karcinoma želuca i dojke. Većina HER2 (+) GCS (36 od 50 uzoraka (72%)) bili su crijevne podtip nego difuzno ili miješani tip GCS u dogovoru s objavljenim izvješćima [13], [16], [17]. pregled

CEER-based HER2 pokazali značajno višu razinu HER2 ekspresija u IHC /FISH HER2 (+) tumora u usporedbi s onima u HER2 (-) tumori (sa srednjom vrijednosti od 77,9 CU vs 4.3 CU, p-vrijednost 8.18E-10), kao što je prikazano na slici 1A. HER2 podaci CEER-based prikazana je u CU, standardna funkcionalna jedinica temeljena na staničnoj liniji kontrolira s poznatim izrazom HER2 [6], koji omogućava usporedbu HER2 izražavanja preko uzoraka. Samo 32/50 ili 64% IHC /FISH HER2 (+) GCS pokazali ekspresiju HER2 po CEER i tamo je bio značajan stupanj heterogenosti u HER2 izražavanja u ovim uzorcima kao što su pokazale kvantitativnih CEER očitavanja. Heterogenost u HER2 izražavanja može objasniti razlog samo umjereni stupanj slaganja (87,5%) između IHC i ribe očitavanja za HER2 u toge suđenju [12]. Ta razlika će izravno utjecati na ishod lijekova HER2 ciljane kao što je trastuzumab u GCS. Osim toga, zbog visoke osjetljivosti testa CEER, uočeno je da je ~ 20% od IHC /FISH HER2 (-) GCS još uvijek izražena ukupna HER2 iako na izrazito nižim razinama nego na HER2 (+) populacije pacijenata pregled.

Upotreba p95HER2 testu platformu CEER-based, skraćeni oblici HER2 posebno otkrivene su, osim pune duljine HER2 u GCS po prvi put. p95HER2 ekspresija je analizirana u 31/50 HER2 (+) uzoraka i 27/384 HER2 (-) uzoraka) koja pokazuje značajno pune duljine HER2 ekspresija CEER (Slika 1B). Incidencija p95HER2 u HER2 (+) GCS je ~77% (u 24/31 uzoraka) (tablica S1). Slično pune duljine, HER2 izražavanja, većina p95HER2 izraza (79% p95HER2 izražena u HER2 (+)) otkrivena je u crijevnim GCS tipa. p95HER2 ekspresija također je uočena u malom postotku HER2 (-) GCS (37% ili 10/27 uzorka) koji su pokazivali pune dužine ekspresiju HER2. Međutim, prosječna p95HER2 izraz u HER2 (+) uzoraka GC bila je značajno viša od one opažene HER2 (-) GCS (5083,6 Cu u HER2 (+) vs 437,0 CU u HER2 (-) p-vrijednost = 1.27e-05 ). p95HER2 može doprinijeti trastuzumab ne reagirati na GC tumora kao što se u 70-80% HER2 ekspresijom raka dojke [18]. Trastuzumab plus standardna kemoterapija donio ukupni odziv od samo 47% u HER2 (+) GCS u togu suđenja [12] pokazuje postojanje mogućih mehanizama otpornosti trastuzumab i naša nesposobnost da precizno odabrati trastuzumab reagiraju. Kako bi se klinički potvrditi p95HER2 izraz s otporom trastuzumab, koji je bio kontroverzni pogotovo zbog nedavnih sukobljenih nalazima iz studija raka dojke GeparQuattro [19], strog p95HER2 test doradu u smislu klinički relevantnih dijagnostički test cut-off određivanja i primjene u kliničkoj praksi je potrebno. Valorizacije p95HER2 izražavanja planiran je u fazi II neoadjuvant lapatinib plus kemoterapije kliničkom ispitivanju u GC bolesnika kao nekoliko studija pokazalo je korištenje lapatinib u p95HER2 (+) raka [20], [21]. Pregled

Sve zajedno Naši podaci jasno definirati status HER2 u GCS i pokazati korisnost CEER-based HER2 dijagnostike u uzorcima GC pacijenata za određivanje njihove točne full length i skraćeni HER2 izraz. Razvoj takvih dijagnostike snažno će utjecati na točan odabir HER2 (+) GCS koje reagiraju na trastuzumab i drugih ciljnih agensa HER2. Mi smo ranije izvijestili korištenje CEER-based HER2 dijagnostiku kod pacijenata oboljelih od raka dojke [6], [15] koji je pokazao veću osjetljivost i specifičnost u odnosu na IHC dijagnostiku. Pregled

Želučani karcinom pokazuju istodobnu aktivaciju signalnih putova pregled

Mi smo koristili testa CEER direktno na uzorcima GC procijeniti prisutnost ukupnih i fosforilirane (aktivirane) oblike nekoliko signalnih molekula koje su poznate ciljeve droge: to je uključivalo nekoliko RTK (HER1, HER2, HER3 cMET, IGF1R) i PI3K. Reprezentativne slike metode mnogostrukog CEER puta sinteze-polja iz osam različitih uzoraka prikazani su na slici 2A. Ove slike jasno pokazuju heterogenost u aktivirani put potpisa koji je rasprostranjen u GCS. Na primjer, i HER1 /HER2 coactivated u uzorku 1 i 6, dok je samo HER2 aktivira u uzorku 2 iako HER1, HER2 i cMET izraženi na visokoj razini. Uzorak 5 pokazuje aktivaciju svih 5 analiziranih RTK uključujući nizvodno PI3K i SHC putova. Sljedeći odjeljak opisuje signalni put heterogenost promatrali u našim GC bolesnika skupine koje odrede CEER testovima. Pregled

Tumori od 202 bolesnika (46,5%) nisu imali mjerljivu aktivaciju testiranih u našem istraživanju RTK. aktivacije put obrasce za ostatak tumora, kako je prikazano u analizi put klastera (slika 2B), široko varirati s nekim GCS pokazujući Popratna aktivacija više RTK, kao što je HER2 /HER3 HER1 /2/3, HER1 /3 /cMET ili HER3 /cMET dok su drugi bili fosforiliran samo na jednom proteinu. Sadržaj tumor svih analiziranih u bilo > 70% na osnovi njihove histološki pregled. Međutim, pan-keratin (pan-CK) je izraz lica bio izrazito varijabilna sugerirajući heterogenost u sadržaju epitela od GCS. Na temelju tog profiliranja, kategorizirani smo 434 GC uzorak skupinu u skladu s njihovim RTK aktivacije potpisa i statusa HER2 pregled

HER os u želučanim karcinoma. (Tablica 2 & Tablica S1). Pregled

Najmanje jedan član receptora HER osi aktivirana u 41% pacijenata GC. HER2 fosforilacija je otkrivena, ne samo u 50% HER2 (+) GC bolesnika nego i ~22% HER2 (-) tumori u dogovoru s promatranom ukupnom izrazu HER2 ranije opisano. 16/25 HER2 (+) Uzorci koji su pokazivali aktivirane HER2 također izrazio p95HER2. Isto tako, HER3 i fosforiliran u većem postotku HER2 (+) GCS (36%) u odnosu na HER2 (-) karcinomi (~24%). Međutim, fosforilirani HER1 nemaju takvu prednost te je ekvivalentno aktiviraju oba tipa GC (26% u HER2 (+) i 25% u HER2 (-)). Nadalje, većina HER članova aktivira tumora GC (~64%) pokazala su istovremeno aktiviranje druge RTK, tj cMET ili IGF1R. Histološki, većina od HER2 (+), crijevna tip GCS izrazio aktiviranu HER2 (u 22/36 ili ~61%), a nakon HER3 (u 13/36 ili ~36%) s ukupnim 36% crijevne GCS tipa eksprimiraju aktivirani HER2 put. Sve u svemu, HER2 aktiviranje bio koncentriran u crijevnom tipa (55/154 ili 35.7%) u usporedbi s raka difuzno tipa (43/225 ili 19,1%). Nasuprot tome, aktiviraju HER1 jednako uočeno je u crijevnom tipa (38/154 ili 24,7%) i difuznog tipa (58/225 ili 25,8%) GCS. Aktiviran HER3 je također ekvivalentno prisutna (29,9% i 21,8%) između obje Lauren klasifikacija podtipova. Pregled

Kako je signalna funkcija HER kinaze osi ovisi o aktivnom dimerizacija receptora, gledali smo različitih parova za nju člana coactivations. Coactivation HER2 s HER3 je poželjna u HER2 (+) karcinoma (13/50 ili 26%) s 7/13 HER2: HER3 aktivirane GCS bez HER1 coactivation. Oko 54% od HER2: HER3 coactivated HER2 (+) GCS coexpressed p95HER2. S druge strane, HER2 (-) GCS ne pokazuju sklonost za bilo koji određeni HER kinaze dimera paru sa sve tri moguće aktiviranih dimera parova (HER1: HER2, HER1: HER3 i HER2: HER3) izražene u ~15% svake od HER2 (-) uzoraka. Trostruki aktivacija HER1 /2/3 receptore zabilježena je u 11,1% GCS s neznatno većom raspodjelom u HER2 (-) karcinomi pregled

cMET aktivira želučani rak (tablica 3 i Tablica S1). Pregled.

Slično HER1, cMET fosforilacija ekvivalentno je razdijeljen između HER2 (+) (22%) i HER2, (-) (oko 25%) GCS. Osim toga, aktivira cMET distribucija temelji na Lauren Histotip bio sličan između crijeva (48/154 ili 31,2%) i difuzne tipa (55/225 ili 24,4%) GCS. Pregled

Većina cMET uzoraka aktivira GC (~ 71% ili 77/108) pokazali su istovremeno aktiviranje HER kinaze članova receptora. Svi uzorci s fosforiliranog cMET pokazao cMET pregled amplifikacije (podaci nisu prikazani). Istražili smo poželjni Njezina os receptore koji interferencija s cMET puta. GC uzoraka 77 su pokazali cMET coactivation sa članom njom, 66 uzoraka (~86%) bili su sa HER1. Ukupni također cMET je poželjno coactivated sa HER1 (15,2%), u odnosu na HER2 (10,1%) ili HER3 (9,7%). Ta opažanja ukazuju na mogući preklapanje između cMET i HER1 signalnih putova u GCS. Aktivacija cMET nikad ko-postojala je aktivni HER3 osim HER1 i /ili HER2 također su fosforilirane u istom uzorku. Oko 7% GC bolesnika pokazala je coactivation sve tri osi HER receptora člana s cMET. Aktiviran cMET su tada postojale, p95HER2 izražavajući uzoraka u 5/24 i 1/10 HER2 (+) i HER2 (-) GCS, odnosno pregled

IGF1R aktiviraju želučani karcinom (Tablica 4 &Tablica S1)..

Kao i HER3 aktivacije, signalni put vođeni IGF1 receptora bila aktivna u većem postotku HER2 (+) GCS (30%) nego HER2 (-) GCS (24,7%). Nadalje, kao što je uočeno kod fosforiliranog HER3, aktivirani IGF1R je ekvivalentno raspoređena između crijeva (26%) i difuznog tipa (~24%) GCS. Ova distribucija vode nas istražiti, ako je došlo do IGF1R: HER3 coactivation u GC pacijenta skupini. IGF1R doista maksimalno coactivated sa p-HER3 posebno u HER2 (+) GCS gdje 22% ili 11/50 HER2 (+) GCS pokazao IGF1R: HER3 coactivation. Međutim, u HER2 (-) GCS, postotak IGF1R coactivation s HER3 (u 51/384 uzoraka ili 13,8%) bila je slična IGF1R coactivation sa HER1 (u 53/384 uzoraka ili 13,3%). IGF1R: HER2 coactivation (u 45/384 uzoraka ili 11,7%), zatim u stopu. Sve u svemu, 34/434 uzorci GC pokazao coactivation svih članova HER osi kinaze s IGF1R od kojih je 28 uzoraka također je pokazao cMET coactivation. Međutim, cMET rijetko zajedno aktiviran s IGF1R u odsutnosti HER coactivation član receptor kinaza. Osim toga, c-MET: IGF1R coactivations se prvenstveno opažena u HER2 (-) GCS pregled

uzorci GC su hijerarhijski grupirani na temelju njihovih decilnim bazi aktivacijski marker profila (slika 2B).. Provedena analiza pokazala je da je cMET: HER1, HER2: HER3 i IGF1R: obrasci za aktivaciju PI3K su usko povezane s cMET: HER1 klaster formira poseban podskup.

• PLoS ONE: Izražavanje AFP i STAT3 je uključen u arsen trioksid apoptozi i inhibiciju proliferacije AFP-proizvodi Želučani stanica raka
• PLoS ONE: Funkcionalna Promotor -308G > je varijanta tumorske nekroze Faktor a Gene je povezana s rizikom i progresiju raka želuca u kineskoj populaciji