PLOS ONE: A Novel Proteomics-Based Clinical Diagnostics tecnologia identifica Heterogeneidade em vias de sinalização ativadas em cânceres gástrico

Abstract

Purpose

O objetivo deste estudo foi o de utilizar o Collaborative enzima à base de proteômica avançado reativa (CEER) imunoensaio para investigar fosfolarização proteína tirosina como marcadores de diagnóstico em câncer gástrico (GCs ).

Experimental design by

lisados ​​de proteína de fresco congelado 434 GCs estágio avançado foram analisadas para a fosforilação de HER1, HER2, p95HER2, HER3, cMET, IGF1R e PI3K. Os padrões de activação da via foram segregados com base no tumor estado de HER2. agrupamento hierárquico foi utilizado para determinar coactivations Caminho no GCs. Valor prognóstico dos padrões de ativação da via foi determinada pela correlação tempos de sobrevida livre de doença dos vários subgrupos GC utilizando análise de sobrevivência de Kaplan-Meier. CEER também foi usada para determinar a presença de tirosina fosforilada cascatas de sinalização em células tumorais (CTCs) e células do tumor ascitico (ATCS) circulante.

Resultados

Utilizando um imunoensaio novos diagnósticos, CEER, nós demonstrar a presença de p95HER2 e vias de sinalização activadas concomitantemente em tecidos de tumor de GC, e CTC ATC isolado a partir de pacientes GC pela primeira vez. p95HER2 é expressa em% de ~77 HER2 (+) GCs. Cerca de 54% de GC tem um activada HER1, HER2, HER3, ou cMET IGF1R e demonstram um prognóstico pior do que aqueles em que estas tirosina-quinases receptoras (RTKs) não são activados. agrupamento hierárquico de RTK revela co-agregação de HER1 fosforilada: cMET, HER2: HER3 e IGF1R-PI3K. Coativação de HER1 com cMET torna GCs, com uma sobrevida livre de doença mais curto em comparação com apenas cMET activado GCs.

Conclusões

Nosso estudo destaca a utilidade de uma nova tecnologia de diagnóstico de companhia, que tem CEER fortes implicações para o desenvolvimento de medicamentos e acompanhamento terapêutico. CEER é usado para fornecer uma maior compreensão de vias de sinalização ativadas em GCs avançados que podem melhorar significativamente a sua gestão clínica por meio da seleção precisa do paciente para terapias direcionadas

Citation:. Lee J, Kim S, Kim P, Liu X, Lee T, Kim KM, et ai. (2013) uma novela Proteomics-Based Clinical Diagnostics tecnologia identifica Heterogeneidade em vias de sinalização ativadas em cânceres gástrico. PLoS ONE 8 (1): e54644. doi: 10.1371 /journal.pone.0054644

editor: Anthony W. I. Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 20 de setembro de 2012; Aceite: 13 de dezembro de 2012; Publicação: 25 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Enquanto PK, XL, TL, NH, GH, AK, AJ, GM, GL e SS são empregados pela Prometheus Laboratories, este não altera os autores a adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

agentes Molecularly direcionados têm acelerado o campo da oncologia. Uma vez que cerca de metade da componente da tirosina quinase do kinome humana está implicada em cancros humanos, não é surpreendente que uma grande proporção das terapias actuais alvo várias cinases [1], [2]. Coativação de tirosina-quinases receptoras (RTKs) tem sido observada em subconjuntos de vários cancros, tais como glioblastoma multiforme [3], o cancro da mama [2], [4], [5], [6], [7], o cancro do pulmão [8 ], [9], câncer de cabeça e pescoço [7] e câncer gástrico [4], [5] [6], implicando-os na medida do necessário para a progressão do tumor e sobrevivência. Estas observações fornecem raciocínio clínico suficiente para triagem RTKs ativadas em cânceres que poderá nortear direcionamento terapêutico e potencialmente fornecer conhecimento para estratégias terapêuticas combinatórias racionais. No entanto, simplesmente analisando a expressão ou a activação de um único estado RTK que pode ser a proteína alvo específico para um terapêutico particular é insuficiente para seleccionar doentes que muitas vezes os pacientes não respondem a terapias, apesar da expressão do alvo. Vários problemas potenciais poderiam ser responsáveis ​​por tal falta de benefício terapêutico de agentes direcionados, por exemplo, 1) a ativação concomitante de vias paralelas ou alternativas que ignorar a proteína (s) alvo original, e 2) alteração contínua em características moleculares e patológicas de neoplásica tecidos durante a progressão do câncer. Portanto, o ideal seria ter uma ferramenta de diagnóstico complementar que poderia ser aplicado em quantidades limitadas de amostras clínicas para capturar a complexidade global de redes de sinalização fosforilados no tecido neoplásico para além do alvo directo proteína RTK para monitorizar a doença "evoluindo" .

Targeted análise de amostras clínicas fosforilação tem sido dificultado devido à ausência de ensaios clínicos facilmente utilizáveis ​​que são suficientemente sensíveis para funcionar em quantidades limitadas de tecidos clínicos. Descrevemos previamente o desenvolvimento de um novo imunoensaio baseado em proximidade, Collaborative Enzima reforçada reactiva-imunoensaio (CEER; Figura S1) [6], o qual é apropriado para analisar tanto a expressão total e estado de activação de cascatas de sinalização de proteína. CEER pode ser realizada de uma forma multiplexada directamente em amostras clínicas que podem estar disponíveis em quantidades limitadas. O ensaio utiliza CEER a formação de um imuno-complexo que requer a co-localização de conjugados com enzimas-anticorpos uma vez que os dois detectores de proteínas alvo foram capturados sobre um micro-arranjo original. Este formato permite a detecção eficiente e sensível de RTK, bem como as proteínas da via de jusante para baixo para o nível de uma única célula (sensibilidade de cerca de 100 zeptomoles). Neste estudo nós utilizamos o ensaio CEER para estudar a complexidade via de sinalização em cânceres gástrico (CG).

GCs são a principal causa de morte por câncer em todo o mundo com uma incidência de 18,9 /100.000 casos por ano e uma mortalidade taxa de 14,7 /100.000 por ano [10] e é o tumor maligno mais comum na Coreia [11]. Metastático GC permanece um desafio terapêutico para médicos oncologistas devido ao seu mau prognóstico. Actualmente, trastuzumab é o único agente activo alvo que tem provado ser eficaz para GC em um estudo de fase III randomizado [12]. Enquanto a activação de vários RTKs tem sido relatada em GC, o seu impacto no prognóstico de GC é desconhecido. Isso é importante para o desenvolvimento e aplicação de terapêuticas para a gestão clínica dos GCs.

Neste estudo, utilizamos a plataforma CEER multiplexado para determinar os níveis de RTKs ativados (HER1, HER2, variantes truncadas de HER2, ou seja, p95HER2, HER3, cMET, PI3K, e IGF1R) em 434 tecidos GC fresco congelado e tentou categorizar os pacientes em subgrupos GC potenciais com base em seus padrões de ativação da via de proteína. Temos observado várias ativações de proteína de sinal em subgrupos de tumores GC que se correlacionam com sobrevida livre de doença (DFS) nestes pacientes. Por conseguinte, os autores sugerem que a activação da via redundantes entradas pode levar a sinalização a jusante residual em GC, limitando assim a eficácia anti-tumor de monoterapias individuais dirigidas contra RTKs. Finalmente, nós desenvolvemos uma metodologia potencialmente poderosa que pode permitir que os clínicos para monitorar linha de base e em evolução alterações no tumor perfis de activação RTK durante o curso de um tratamento utilizando células circulantes de tumor (CTCs) e células malignas isoladas a partir do fluido peritoneal (células do tumor ascitico ou ATCs ). Tomados em conjunto, o nosso estudo fornece evidência para a ativação RTK concomitante em tecidos humanos GC além de estabelecer CEER como uma ferramenta clínica eficiente para diagnosticar e monitorar a ativação RTK durante o tratamento GC ou progressão da doença.

Materiais e Métodos

paciente Cohort e amostra de tecido Procurement

o estudo foi realizado após aprovação do Samsung Medical Center Institutional Review Board (IRB SMC) de levantamento consentimento informado usando tecidos de arquivo com os dados clínicos retrospectivos. As amostras de tumores primários foram todos recolhidos da Samsung Medical Center. Todos os pacientes foram submetidos a gastrectomia com linfadenectomia radical com intenção curativa. De março de 2001 a fevereiro de 2005, 447 tecidos congelados frescos obtidos de 434 pacientes foram coletadas de tumores gástricos primários ressecados cirurgicamente e estavam disponíveis para análise final. Todos os tecidos congelados frescos foram recolhidos (dentro de < 30 minutos) ao campo cirúrgico e foram imediatamente congeladas rapidamente e armazenadas em azoto líquido até utilização posterior. espécimes de tumor foram confirmados para a presença de > 70% área do tumor pelo patologista. Para a análise, pequenos pedaços de tecidos congelados (10 uM secção x 3) foram preparados utilizando lâmina de barbear previamente arrefecido e lisadas em 100 mL de tampão de lise. Os lisados ​​resultantes foram armazenadas a -80 ° C até análise posterior

Histopatologia Comente e HER2 determinação do estatuto

Todos os H &disponíveis;. Diapositivos E-coradas foram centralmente analisados ​​por dois patologistas (ID, KKM ) no núcleo patologia experimental do Instituto de Pesquisa do Câncer Samsung. Todos os espécimes de tumor eram de tumores gástricos primários cirurgicamente ressecado. status de HER2 foi determinada por IHC e FISH. análise IHC foi realizada utilizando o HercepTest ™ (Dako, Glostrup, Dinamarca). Os níveis de expressão de proteína HER2 foram classificados como 0 a 3+, de acordo com as recomendações do painel de consenso sobre HER2 marcando o GC [13], [14]. Para os peixes, DNA PathVysion HER2 kit sonda (Abbott, Des Plaines, IL) foi utilizado. sistema de análise de imagem Ariol foi usado para contar os sinais de hibridação (Genetix, San Jose, EUA). Todas as amostras com índices de HER2 /CEP17 entre 1,8 e 2,2 foram marcados manualmente por meio da contagem de mais de 60 células que não se sobrepõem. Coeficientes de > 2.2, 1.8 a 2.2, ou < 1,8 foram classificados como positivos, equívoca ou negativo para a amplificação, respectivamente. Cromossómica 17 polissomia foi definida como um sinal CEP17 que teve mais de seis cópias em média por célula. Das 447 amostras, 434 espécimes foram incluídos na análise final.

Collaborative Enzyme avançado Reactive-imunoensaio (CEER)

lâminas CEER foram impressos, incubadas com lisados ​​GC e processada como descrito anteriormente [ ,,,0],6]. As lâminas foram feitos a varredura em quatro configurações fotomultiplicador (PMT) de ganho para aumentar o alcance dinâmico e económico. Os dados foram ajustados a uma equação de cinco parâmetro derivado como uma função da concentração de anticorpo de captura-e PMT e apresentada em unidades computadas (CU).

impressão de multiplexagem de microarray.

anticorpos de captura foram impressas em lâminas de vidro revestidas de nitrocelulose (ONCYTE®, Etiqueta Bio-Labs) por meio de impressoras sem contato (Nanoplotter, GESIM). O diâmetro do ponto era de aproximadamente 175 um. As lâminas foram mantidas numa câmara de dessecação a 4 ° C. Cerca de 500 pL de captura Abs foram impressos em triplicado em concentrações de diluição em série de 1 mg /ml, 0,5 mg /mL, e 0,25 mg /mL. Purificada rato-IgG serviram como controlos negativos. configurações de deslizamento Imuno-matriz são mostrados na Figura S1.

conjugação do anticorpo e purificação.

Alvo anticorpos específicos (monoclonal de ratinho contra epitopos específicos em proteínas de transdução de sinal de humanos) e as enzimas de detectores correspondentes, glucose-oxidase (GO) ou peroxidase de rábano (HRP), foram activadas com bifuncional reticulante, succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC), e acoplado originando conjugados de anticorpo-enzima. Os conjugados foram purificados por HPLC. actividades de anticorpos em conjugados purificados foram determinados por ELISA de competição e as atividades de enzimas pós-conjugação foram detectados por ensaios funcionais específicos para cada enzima detector.

ensaios CEER.

lâminas de Imuno-microarray foram lavadas 2X com TBST (Tris 50 mM /NaCl 150 mM /0,1% de Tween-20, pH 7,2-7,4), bloquearam-se com 80 mL Whatman tampão de bloqueio durante 1 h à TA, seguidamente lavado 2 x com TBST. Diluídas em série controlos de lisado ou de amostras em 80 uL de tampão de diluição (BSA a 2% /0,1% Triton X-100 /TBS, pH 7,2-7,4) foram adicionados a sub-matrizes designados em lâminas e incubaram-se durante 1 hora à TA. As lâminas foram lavadas 4X (3 min. Cada), e o detector Abs foram adicionadas em 80 ul de tampão de reacção e incubados durante 2 horas à TA. Depois de lâminas de lavagem com TBST para remover desacoplado detector de Abs, 80 mL de solução de biotina-tiramida (5 ug /ml em glicose a 50 mM /PBS), preparada a partir de 400 ug /mL em solução de etanol (Perkin-Elmer Life Science) foi adicionado e incubado durante 15 min na obscuridade. processo de amplificação de sinal tiramida GO /HRP-mediada foi encerrado por lavagem com TBST 4X, 3 min cada um. deposição local de biotina-tiramida foi detectado por incubação com estreptavidina (SA) -Alexa647 (Invitrogen) a 0,5 ug /ml em 2% de BSA /0,1% de Triton /TBS durante 40 min. Após a conclusão da incubação, as lâminas foram lavadas 4x com TBST, secas e mantidas na obscuridade até que eles foram fotografadas através de um scanner de microarray.

Para análise dos dados CEER, as lâminas foram feitos a varredura em quatro configurações de ganho PMT para aumentar a dinâmica eficaz alcance. intensidades de sinal corrigido-fundo-se a média de pontos impressos em triplicado. Vários critérios foram utilizados para filtrar os dados para análises posteriores, incluindo limites sobre pegadas ponto, o coeficiente de variação dos replicados ponto, e fundo geral pad. Para cada ensaio, uma curva padrão foi gerada a partir de lisados ​​de células de controlo diluídos em série preparados a partir de linhas de células com proteínas de transdução de sinal bem caracterizadas. Os dados foram ajustados a uma equação de cinco parâmetro derivado como uma função da concentração de anticorpo de captura e-PMT. A curva padrão para cada marcador foi ajustada em função da intensidade do sinal de registo, medida como unidade de fluorescência relativa (RFU) versus log concentração de lisados ​​celulares e referenciado para as linhas celulares normais. Por exemplo, a curva padrão de lisados ​​celulares preparados a partir de diluições seriadas BT474 foi utilizada para normalizar a expressão de HER2 e o grau de fosforilação em cada amostra (Figura S2). Assim, uma amostra com uma CU de expressão HER2 tem o valor RFU equivalente ao valor RFU de 1 celular BT474 referência padrão. Como as células de referência têm 1~2 × 10 ^{6 receptores HER1 ou HER2 por célula com receptores fosforilados aproximadamente 10%, 1 CU representa a expressão de 1~2 × 10 6 RTKs ou 1~2 × 10 5 RTKs fosforilados [6]. O limite do valor de detecção (LOD) de CU foi determinada para ser menor do que 1 CU tanto para expressão e activação de HER2. previsões individuais de cada diluição e ganho foram calculados em uma única previsão, final.}

receptores HER2 truncado enriquecimento
Full-length p185-HER2 foram esgotados a partir de lisados ​​de tecidos tumorais utilizando anticorpos magnética talão acopladas específico para o domínio extracelular (ECD) de HER2 tal como mostrado na Figura S3. Resultante p185 HER2-lisatos depletados, que continha proteínas enriquecidas HER2 receptor truncado (t-HER2) sem os ECD, foram utilizados para quantificação subsequente de expressão t-HER2 e fosforilação usando os respectivos ensaios CEER. Um valor de corte de 500 CU foi usado para marcar para p95HER2 positividade por cada 20 mg de tecido analisado. O ensaio de leitura total de p95HER2 era relação aos sinais gerados a partir das curvas padrão geradas utilizando um lisado celular de controlo a partir da linha celular de cancro da mama BT474.

de cultura celular e os reagentes

linhas celulares de controlo do ensaio CEER , células MDA-MB-468, T47-D, HCC827 e BT474 com vários graus de expressão de ErbB-RTK foram obtidas de ATCC e cultivadas a 37 ° C em 5% de CO _{2 - para MDA-MB-468 (Dulbecco mínimo essencial Médium (DMEM) + 10% de FBS), BT474 (DMEM + 10% de FBS), e HCC827 e T47D (RPMI 1640 + 10% de FBS, 0,2 U /ml de insulina bovina). As células foram contadas e lavadas com 1 x PBS antes da estimulação do factor de crescimento. As células MDA-MB-468 foram estimuladas com 100 nM de factor de crescimento epidérmico (EGF), ou factor de crescimento transformante-A (TGFa), células T47D foram estimuladas com 20 nM β heregulina (HRGβ) ou 100 ng /ml de factor-1 de crescimento tipo insulina (IGF1) em meio de crescimento isento de soro, durante 5 ou 15 min. As células estimuladas foram lavadas com 1 x PBS e depois lisadas (tampão de lise: Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% de Trition X-100 e Na 2 mM de 3VO 4) e mantido em gelo durante 30 minutos antes de tomar o sobrenadante para um ensaio posterior ou mantido a -80 ° C.}

determinação CEER marcador e calor mapa agrupamento

a positividade para um determinado biomarcador foi definido como maior do que o terceiro quartil para um biomarcador indivíduo na população de pacientes deste estudo. Os pacientes foram classificados com base no valor do ensaio CU CEER para um determinado biomarcador. Esses pacientes maiores do que o terceiro quartil de corte foram considerados de maior risco a ter níveis elevados de biomarcadores e vias de sinal, portanto, potencialmente activadas. análise de sobrevivência subseqüente foi feito para avaliar a qualidade predicativo desses cortes.

O perfil biomarcador das amostras de tumor foi representado por um mapa de calor. Cada célula foi colorized com base na classificação de decil a activação do referido marcador. Cada marcador foi classificada pela decis, representada por um tom distinto, com a escala que indica a cor. Tanto a linha (paciente) e coluna (marcador) agrupamento foi mostrado. O algoritmo de ligação completa foi usado para obter um cluster hierárquico (ou dendrograma) agrupando sequencialmente as observações mais correlacionados com a função hclust em R, chamada pela função heatmap.2 disponível com a biblioteca gplots do ambiente estatístico R: A Linguagem e ambiente para Statistical Computing (http://www.r-project.org/). Subgrupos de marcadores foram definidos pelo agrupamento que permitiu comparações de perfis de marcadores para os pacientes.

CTC e ATC isolamento

Para a avaliação do CTC, 7,5 ml de amostras de sangue foram atraídos para 10 ml de etilenodiamina evacuado ácido tetra-acético (EDTA) os tubos. O Sistema CellSearch (Veridex) foi utilizado para imuno-isolamento magnético CTC de acordo com o protocolo previamente descrito [6] utilizando ferrofluidos conjugados com Ab contra a molécula de adesão celular epitelial. Para avaliação ATC, conteúdos celulares foram enriquecidas de 50 a 100 mL de fluido de ascites através de centrifugação e isolamento das células do tumor imuno-magnética foi realizada de forma semelhante. Vários conjuntos de ATCs foram tratados com cocktails de fatores de crescimento (EGF, HRG, HGF e IGF1), com ou sem lapatinib e combinação de inibidor de PHA-665752.

Resultados e Discussões

As características dos pacientes

Características dos 434 pacientes do GC são fornecidos na Tabela 1. Todos os pacientes receberam gastrectomias com D2 dissecção de linfonodos com 242 (55,8%) pacientes que receberam gastrectomias subtotal. De acordo com AJCC 2002 sistema de estadiamento, 86 pacientes tiveram estágio patológico I, 116 tiveram fase II, 126 tiveram fase III e 106 tiveram estágio IV (35 pacientes com M1 metastático) GC. No momento da análise, 226 pacientes estavam mortos e 237 pacientes tinham documentado recorrência. 70 pacientes tinham carcinoma de células em anel de sinete. A 5 anos em geral e as taxas de sobrevida livre de doença foram 52,4% e 50,0%, respectivamente. Todos os tecidos foram adquiridos GC primárias no momento da cirurgia e imediatamente congeladas rapidamente para análise molecular futuro.

ensaios baseados em CEER revelam heterogeneidade na expressão de HER2 e HER2 presença da variante truncada, p95HER2, em HER2 (+) gástrica cancros

Temos relatado anteriormente o desenvolvimento de ensaios CEER base imuno-microarray [6], [15]. Utilizou-se o ensaio de HER2-based CEER para investigar o status HER2 dos HER2 (+) e HER2 - amostras em nossa coorte GC paciente que foram segregados com base no padrão IHC HercepTest /análise de FISH (). A vantagem de ensaios baseados em CEER é a sua maior sensibilidade e especificidade em comparação com ensaios de [6] baseados no IHC. Baseado em HER2 atual (+) definições para GCs [13], [14], ou seja, as amostras com uma pontuação HER2-IHC de 3+ ou 2+ e um positivo HER2
estado de amplificação do gene, 50 de 434 (11,5%) amostras em nossa coorte GC paciente eram HER2 (+) por IHC HercepTest /análise de FISH (Tabela S1). Em contraste, de acordo com as diretrizes IHC específicas para cânceres de mama, apenas 78% (39/50) dos pacientes eram HER2 (+) (Tabela S1), indicando as diferenças de critérios de pontuação para a positividade HER2 entre câncer gástrico e da mama. A maioria dos GCs HER2 (+) (36 de 50 amostras (72%)) eram do subtipo intestinal, em vez de as difusas ou tipo misto GCs em acordo com relatórios publicados [13], [16], [17].

HER2 ensaio à base de CEER demonstrou níveis de expressão mais elevados de HER2 substancialmente no IHC /FISH HER2 (+) tumores, em comparação com aqueles na HER2 (-) (tumores com um valor médio de 77,9 versus 4,3 CU CU, 8.18E-10 valor de p), como mostrado na Figura 1A. Os dados HER2-based CEER é apresentado em CU, uma unidade funcional padrão com base na linha de células controla com expressão HER2 conhecida [6], que permite a comparação de expressão HER2 através amostras. Apenas 32/50 ou 64% do IHC /FISH HER2 (+) GCs demonstrou expressão HER2 pelo CEER e houve um significativo nível de heterogeneidade na expressão HER2 nestas amostras como revelado pelas leituras CEER quantitativos. A heterogeneidade na expressão HER2 pode explicar a razão por apenas um grau moderado de concordância (87,5%) entre o IHC e leituras de peixe para HER2 no julgamento de ToGA [12]. Esta discrepância afetaria diretamente o resultado da terapêutica direcionada-HER2, tais como trastuzumab em GCs. Além disso, devido à elevada sensibilidade do ensaio CEER, notou-se que ~ 20% da IHC /FISH HER2 (-) GCs ainda expressa total de HER2 embora em níveis mais baixos do que distintamente a HER2 (+)
população de pacientes.

Utilizando a plataforma de ensaio baseado p95HER2-CEER, formas truncadas de HER2 especificamente foram detectados, além de comprimento completo de HER2, em GCs pela primeira vez. p95HER2 expressão foi analisada em 31/50 de HER2 (+) e 27/384 amostras HER2 (-) de amostras), que demonstrou uma expressão de comprimento completo de HER2 significativa por CEER (Figura 1B). A incidência de p95HER2 HER2 em (+) foi GCs ~77% (24/31 em amostras) (Tabela S1). Semelhante a expressão de HER2 comprimento completo, a maioria de expressão p95HER2 (79% de p95HER2 expressos em HER2 (+)) foi detectada em GC tipo intestinal. expressão p95HER2 também foi observada em uma pequena porcentagem de HER2 (-) GCs (37% ou 10/27 amostras) que demonstraram expressão HER2 comprimento total. No entanto, a expressão de HER2 em média p95HER2 amostras de GC (+) foi significativamente mais elevada do que a observada em HER2 (-) (GC 5083,6 CU HER2 em (+) vs 437,0 CU HER2 em (-), p-valor = 05 1.27e- ). p95HER2 pode contribuir ao trastuzumab não-resposta em tumores GC como acontece em 70-80% dos cancros da mama com superexpressão de HER2 [18]. Trastuzumab acrescido de quimioterapia padrão rendeu uma resposta global de apenas 47% no HER2 (+) GCs no julgamento de ToGA [12] indicando existência de possíveis mecanismos de resistência trastuzumab e nossa incapacidade para selecionar com precisão respondedores trastuzumab. A fim de clinicamente validar expressão p95HER2 com a resistência trastuzumab, que tem sido controverso, especialmente devido às recentes descobertas conflitantes dos estudos de câncer de mama GeparQuattro [19], rigoroso refinamento ensaio p95HER2 em termos de determinações e aplicabilidade ensaio de diagnóstico de corte clinicamente relevantes em contextos clínicos é necessária. Uma validação de expressão p95HER2 está prevista em um lapatinib neoadjuvante fase II mais quimioterapia ensaio clínico em doentes GC como vários estudos sugerem o uso de lapatinib em p95HER2 (+) cânceres [20], [21].

Em conjunto , nossos dados definir claramente o status HER2 em GCs e demonstrar a utilidade de diagnósticos HER2 baseados em CEER em amostras GC de pacientes para determinar seu comprimento total e expressão HER2 truncada preciso. O desenvolvimento de tais diagnósticos terá um grande impacto a selecção exacta de HER2 (+) GCs que são respondedores ao trastuzumab e outros agentes de direccionamento HER2. Nós já relataram o uso de diagnósticos HER2 baseados em CEER em pacientes com câncer de mama [6], [15], que demonstrou uma maior sensibilidade e especificidade, em comparação com os diagnósticos baseados em IHC.

cancros gástricos demonstrar a ativação concomitante de vias

Nós utilizados no ensaio CEER diretamente em amostras de GC para avaliar a presença de formas totais e fosforiladas (ativada) de várias moléculas de sinalização que são conhecidos alvos de drogas sinalização: estes incluíram vários RTKs (HER1, HER2, HER3, cMET, IGF1R) e PI3K. Imagens representativas de multiplexados CEER via de matrizes de oito amostras diferentes estão apresentados na Figura 2A. Estas imagens demonstram claramente a heterogeneidade nas assinaturas via ativadas que é prevalente em GCs. Por exemplo, tanto HER1 /HER2 são coactivated nas amostras 1 e 6, ao passo que apenas HER2 é activado na amostra 2, embora de HER1, HER2 e cMET são expressos a níveis elevados. Amostra 5 demonstra a activação de todos os 5 RTKs analisados, incluindo a via PI3K a jusante e vias de Shc. A secção seguinte descreve a heterogeneidade via de sinalização observada em nossa coorte GC como determinado pelos ensaios CEER.

Os tumores de 202 pacientes (46,5%) não tinha activação detectável dos RTKs testados em nosso estudo. padrões de activação da via para o resto dos tumores, como descrito em análise de caminho de agrupamento (Figura 2B), variaram amplamente com algumas GCs demonstrando concomitante activação de múltiplos RTKs, tais como HER2 /HER3, HER1 /2/3, HER1 /3 /cMET ou HER3 /cMET enquanto outros foram fosforilados em apenas uma única proteína. O conteúdo do tumor de todas as amostras analisadas era > 70% com base no seu exame histológico. No entanto, a expressão pan-citoqueratina (pan-CK) foi heterogeneidade sugerindo distintamente variável no conteúdo epitelial dos GCs. Com base nesse perfil, dividimos o grupo de amostra 434 GC de acordo com suas assinaturas de ativação RTK e status HER2

HER eixo em cancros gástricos. (Tabela 2 & Tabela S1).

Pelo menos um membro do receptor do eixo HER foi activado em 41% dos pacientes de GC. Fosforilação de HER2 foi detectado não apenas em 50% dos pacientes HER2 GC (+) mas também em ± 22% de HER2 (-) cancros de acordo com a expressão de HER2 total observada descrito anteriormente. 16/25 HER2 (+) amostras que demonstraram ativados HER2 também expressou p95HER2. Da mesma forma, também HER3 foi fosforilada numa maior percentagem de HER2 (+) GC (36%) em comparação com HER2 (-) cancros (~24%). No entanto, HER1 fosforilados não têm uma tal preferência e equivalentemente foi activado em ambos os tipos de GC (26% em HER2 (+) e 25% em HER2 (-)). Além disso, a maioria dos tumores HER membro activado GC (-64%) demonstraram uma activação concomitante de outros RTKs, isto é, cMET ou IGF1R. Histologicamente, a maioria do HER2 (+), do tipo intestinal GC expressa um HER2 activado (em 22/36 ou ~61%) seguido por HER3 (em 13/36 ou ~36%) com um 36% no total dos GCs tipo intestinal expressando uma via de HER2 activado. Em geral, a activação de HER2 estava mais concentrada no tipo intestinal (55/154 ou 35,7%), em comparação com os cancros do tipo difuso (43/225 ou 19,1%). Em contraste, HER1 activado foi igualmente observada tanto do tipo intestinal (38/154 ou 24,7%) e tipo difuso (58/225 ou 25,8%) GCs. Activado HER3 também foi equivalente presentes (29,9% e 21,8%) entre os dois subtipos de classificação de Lauren.

Como a função de sinalização do eixo HER-cinase é dependente de dimerização do receptor ativado, olhamos para os vários pares de seu membro coactivations. Coativação de HER2 com HER3 foi preferida em HER2 (+) cancros (13/50 ou 26%) com 7/13 HER2: HER3 GCs ativados sem coativação HER1. Aproximadamente 54% do HER2: HER3 coactivated HER2 (+) GCs p95HER2 co-expresso. Por outro lado, HER2 (-) GCs não demonstrou uma preferência para qualquer par HER-cinase específica dímero com todos os três pares possíveis dímero activados (HER1: HER2, HER1: HER3 e HER2: HER3) expressa em ~ 15% de cada HER2 (-) amostras. ativação tripla de /2/3 receptores HER1 foi observada em 11,1% dos GCs com uma distribuição marginalmente superior em HER2 (-) cancros

cMET activado cancros gástricos (Tabela 3 & Tabela S1).
.

Semelhante a HER1, cMET fosforilação foi distribuídos equivalentemente entre HER2 (+) (22%) e HER2 (-) (~ 25%) GC. Além disso, a distribuição cMET activado com base no histotipo Lauren foi semelhante entre intestinal (48/154 ou 31,2%) e do tipo difuso (55/225 ou 24,4%) GCs.

A maioria das amostras de GC activado CMET (~ 71% ou 77/108) demonstraram uma activação concomitante de membros receptor HER-cinase. Todas as amostras com uma cMET fosforilada demonstrado um amplificação cMet
(dados não mostrados). Nós investigamos os receptores HER eixos que cross-talk com a via cMET preferido. Das amostras de 77 GC demonstrando a coativação cMET com um HER membro, 66 amostras (~86%) estavam com HER1. Em geral também, cMET foi preferencialmente coactivated com HER1 (15,2%), em comparação com HER2 (10,1%) ou HER3 (9,7%). Estas observações sugerem uma possível cross-talk entre as vias de sinalização CMET e HER1 em GCs. cMET activação não co-existisse com HER3 activado, a menos que HER1 e /ou HER2 também foram fosforilados na mesma amostra. Aproximadamente 7% dos pacientes GC demonstrado coativação de todos os três membros do eixo HER de receptores com cMET. cMET activado co-existia com p95HER2 expressar amostras em 5/24 e 1/10 HER2 (+) e HER2 (-) GCs, respectivamente

IGF1R cânceres gástricos ativados (Tabela 4 & Tabela S1)..

Semelhante a activação HER3, a via de sinalização dirigida pelo receptor de IGF-1 estava activo numa percentagem mais elevada de GC de HER2 (+) (30%) do que as HER2 (-) GC (24,7%). Além disso, como observado com HER3 fosforilada, IGF1R activado foi distribuídos equivalentemente entre o intestino (26%) e do tipo difuso (~24%) GC. Esta distribuição nos levam a investigar se havia um IGF1R: HER3 coativação na coorte GC paciente. IGF1R foi efectivamente maximamente coactivated com p-HER3 especialmente em HER2 (+) GCs em que 22% ou 11/50 HER2 (+) GCs demonstraram uma IGF1R: HER3 coativação. No entanto, em HER2 (-) GCs, percentagem de coativação IGF1R com HER3 (em 51/384 amostras ou 13,8%) foi semelhante ao IGF1R coativação com HER1 (em 53/384 amostras ou 13,3%). IGF1R: coativação HER2 (em 45/384 amostras ou 11,7%), seguido de perto. No geral, 34/434 amostras GC demonstrou coativação de todos os membros do eixo HER-cinase com IGF1R dos quais 28 amostras também demonstraram uma coativação cMET. No entanto, raramente cMET foi co-activado com IGF1R na ausência de um SUA coativação membro receptor da cinase. Além disso, c-Met: coactivations IGF1R foram observados principalmente no HER2 (-) GCs

amostras de GC foram hierarquicamente agrupados com base nos seus perfis de activação marcador à base de decil (Figura 2B).. A análise demonstrou que cMET: HER1, HER2: HER3 e IGF1R: padrões de ativação PI3K estavam intimamente correlacionado com o cMET: Conjunto HER1 formando um subconjunto distinto.

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