PLoS ONE: romano Proteomika-Based Klinikiniai diagnostika technologijų Identifikuoja heterogeniškumas aktyviajame signalo perdavimo kelių skrandžio vėžio

Anotacija

Paskirtis

Šios studijos tikslas buvo panaudoti proteomiką pagrindu bendradarbiaujant Fermentų Glaudesnis Reaktyviosios (EERT) imunologinė ištirti baltymų tirozino phosphorylations kaip diagnostikos žymekliai skrandžio vėžio (GKS ).

eksperimentinio projektavimo

Baltymų fragmentai iš šviežių užšaldytų 434 pažengęs gCS buvo analizuojami fosforilinimo HER1, HER2, p95HER2, HER3, cMet, IGF1R ir PI3K. Kelias aktyvavimo modelius buvo atskirtos remiantis naviko HER2 būklę. Hierarchinis grupavimas buvo naudojamas siekiant nustatyti kelią coactivations į GCS. Prognostinė vertė kelią aktyvinimo modelių nulėmė koreliacijos ligos reiškinių išgyventas kartus įvairių GC pogrupių naudojant Kaplan-Meier išgyvenamumo analizė. EERT taip pat buvo siekiama nustatyti tirozino buvimas fosforilinamos signalizacijos kaskadomis cirkuliuojančių vėžinių ląstelių (CTCs) ir ascitas navikines ląsteles (ATCS).

Rezultatai

Naudojant naujus diagnostikos imunologinis, CEER, mes įrodyti p95HER2 buvimą ir kartu aktyvuota signalo perdavimo kelių GC navikų audiniuose, CTCs ir ATCS izoliuotas nuo GC pacientams pirmą kartą. p95HER2 išreiškiamas ~77% HER2 (+) GCS. Maždaug 54% GCS turėti aktyvuotą HER1, HER2, HER3, cMet arba IGF1R ir įrodyti, kad blogesnę prognozę nei tie, kur šie tirozino kinazės receptorius (RTKs) nėra aktyvuotas. Hierarchinis grupuojama RTKs atskleidžia bendrą telkinys fosforilinto HER1: cMet, HER2: HER3 ir IGF1R-PI3K. Coactivation iš HER1 su cMet teikia GCS su ligos reiškinių išgyventas trumpesnį, palyginti su tik cMet aktyvuota GCS.

Išvados

Mūsų tyrimas išryškina naują kompanionas diagnostikos technologijos, EERT, kad turi įrankį stiprus poveikis vaistų kūrimo ir gydymo kontrolės. EERT naudojamas suteikti didesnį supratimą apie aktyvintos signalizacijos stažuočių pažangių GCS, kuri gali žymiai pagerinti savo klinikinį valdymą per tiksli paciento pasirinkimo tikslinėms terapijos

nurodomoji dalis:. Lee J Kim S Kim P Liu X lee T, Kim KM, ir kt. (2013) romaną Proteomika-Based Klinikiniai diagnostika Technologijos Identifikuoja heterogeniškumas aktyviajame signalo perdavimo kelių skrandžio vėžio. PLoS ONE 8 (1): e54644. Doi: 10,1371 /journal.pone.0054644

Redaktorius: Antanas W. I. Štai Kinijos universiteto Honkonge, Honkongas

Įstojo rugsėjo 20, 2012 m Priėmė: Gruodžio 13, 2012 m Paskelbta sausio 25 d 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Lee et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Autoriai neturi paramą ar finansavimą pranešti

konkuruojančių interesų. Nors PK, XL, Lt NH, GH, AK, AJ, GM, G. ir SS dirba Prometheus Laboratories, tai nekeičia autoriai " laikytis visų PLoS ONE politikos dalijimosi duomenimis ir medžiagų.

Įvadas

molekules tiksliniai agentai paspartino onkologijos srityje. Atsižvelgiant į tai, kad maždaug pusė tirozino kinazės komponento žmogaus kinome yra susijęs žmogaus vėžio, todėl nenuostabu, kad didelė dalis dabartinių terapijos nukreipti įvairias kinazes [1], [2]. Coactivation receptoriaus tirozino kinazės (RTKs), buvo pastebėta pogrupių keliais vėžio, pavyzdžiui, glioblastoma [3], krūties vėžio [2], [4], [5], [6], [7], plaučių vėžio [8 ], [9], galvos ir kaklo vėžys [7] ir skrandžio vėžys [4], [5], [6] taip implicating juos, kiek reikia auglio progresavimo ir išgyvenimo. Šie stebėjimai suteikia pakankamą klinikinę loginį dėl atrankinės patikros aktyvuota RTKs į vėžio tada, kad galėtų remtis gydomąjį taikymą ir potencialiai suteikti žinių racionalių kombinatorines terapines strategijas. Tačiau, tiesiog analizuojant ekspresijos arba aktyvinimo būseną vieno RTK, kad gali būti konkretaus taikinio baltymas, skirtas specifiniam gydomajam yra nepakankamas atrankos pacientus kaip dažnai kartus pacientai nesugeba reaguoti į gydymo, nepaisant to, į taikinį išraiška. Keli potencialūs klausimai galėtų būti atsakinga už tokio gydymo naudos nebuvimo iš tikslinių agentų, pvz, 1) kartu aktyvavimo lygiagrečių ar pakaitinių būdų kurie aplenkia iš pradžių tikslingai baltymų (-os), ir 2) nuolat pakeistų molekulių ir patologinių funkcijų navikinių audinių metu vėžio progresavimą. Todėl būtų idealu turėti kompanionas diagnostikos įrankis, kuris gali būti taikomas riboto dydžio klinikinių mėginių užfiksuoti išsamią sudėtingumą fosforilintų signalizacijos tinklus į neoplastiniu audinio be tiesioginio tikslo RTK baltymų stebėti "vystosi" liga .

Tikslinės fosforilinimo analizė klinikinių mėginių buvo trukdoma dėl lengvai naudojamų klinikiniuose tyrimuose, kurie yra pakankamai jautrus, kad gali veikti ribotais kiekiais klinikinių audinių trūkumo. Mes jau anksčiau pranešė apie naują artumo pagrindu analizės metodu, bendradarbiavimo fermentų Glaudesnis reaktyviojo analizės metodu plėtra (EERT; S1 paveiksle) [6], kuris tinka analizuoti tiek bendrą išraišką ir aktyvinimo būseną baltymų signalizacijos kaskadomis. EERT gali būti atliekamas multipleksuojamų mados tiesiai ant klinikinių mėginių, kurie gali būti prieinami nedidelių sumų. CEER testo metu naudojamas formavimo unikalus imuninės sudėtinga reikalauti, kad bendrai lokalizacija dviejų detektorių fermentų konjuguoto-antikūnų kartą tikslinės baltymai buvo sugauti ant microarray. Šis formatas leidžia efektyviai ir jautrus aptikimo RTKs, taip pat tolesniam kelią baltymų žemyn į vieną ląstelių lygmenyje (iš viso apie 100 zeptomoles jautrumas). Šiame tyrime mes naudojamas su CEER tyrimą studijuoti signalinio kelio sudėtingumą skrandžio vėžio (GC).

GCS yra pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirties visame pasaulyje su 18,9 /100.000 atvejų dažnis per metus ir mirtingumo norma 14,7 /100000 per metus [10] ir yra labiausiai paplitęs piktybinis navikas Korėjoje [11]. Metastazavusiu GC lieka gydomąjį iššūkį medicinos onkologai dėl savo blogos prognozės. Šiuo metu trastuzumabu yra vienintelis aktyvus skirta medžiaga, kuri įrodė, kad veiksmingas GC atsitiktinių imčių III fazės tyrimo metu [12]. Nors aktyvacijos kelių RTKs buvo pranešta GCS, jų įtaka GC prognozės yra nežinoma. Tai svarbu plėtoti ir taikyti terapijos klinikinės valdymo GCS.

Šiame tyrime mes naudojome sutankintų CEER platformą, siekiant nustatyti lygius aktyvintos RTKs (HER1, HER2, nupjauto variantų HER2, ty p95HER2, HER3, cMet, PI3K ir IGF1R) 434 šviežios šaldytos GC audinių ir mėgino suskirstyti GC pacientus į potencialių pogrupių pagal jų baltymų kelias aktyvacijos modelius. Mes pastebėjome kelis signalas baltymų aktyvinimo pogrupiuose GC navikų, sutampantys su išgyvenimą iki ligos progresavimo (DFS) šiems pacientams. Taigi, mes iškėlė hipotezę, kad nereikalingi kelio sužadinimu įėjimai gali sukelti likutinės vartotojų signalizacijos GCS, tokiu būdu apribojant priešnavikinis veiksmingumas monoterapijos nukreiptas prieš vieno RTKs. Galiausiai, mes sukūrėme potencialiai galinga metodiką, kuri gali padėti gydytojams stebėti pradinius ir besikeičiančius pakitimus naviko RTK aktyvacijos profilius per gydymo naudojant cirkuliuojančių vėžinių ląstelių (CTCs) ir piktybinių ląstelių, išskirtų iš pilvaplėvės skystyje (ascitas vėžinių ląstelių ar ATCS žinoma ). Kartu paėmus, mūsų tyrimas suteikia įrodymus kartu RTK aktyvacijos GC žmogaus audinių, be steigimo CEER kaip efektyviai klinikinė priemonė GC gydymo ar ligos progresavimo metu diagnozuoti ir stebėti RTK aktyvacijos.

Medžiagos ir metodai

Ligonių kohortos ir audinių pavyzdys pirkimų

tyrimas buvo atliktas gavus Samsung Medical Center institucinių ekspertizės valdyba (SMC IRB) už informuoto sutikimo atsisakymo naudojant archyvinius audinius retrospektyvinių klinikiniais duomenimis. Pirminio naviko mėginiai buvo viskas surinkta iš Samsung medicinos centras. Visi pacientai patyrė pašalintas skrandis su radikaliai limfmazgių skrodimo su gydomuoju ketinimų. Nuo 2001 kovo iki 2005 vasario, 447 šviežių šaldytų audiniai, pagaminti iš 434 pacientų buvo surinkti iš chirurginiu rezekcijos pirminių skrandžio navikų ir buvo galima galutinę analizę. Visi švieži šaldyti audiniai buvo surinkti (per < 30 minučių), kad operacijos srityje ir buvo nedelsiant spragtelėjimu, užšaldyti ir saugomi skystame azote, kol vėlesniam naudojimui. Naviko egzemplioriai buvo patvirtinta už >akivaizdoje; 70% naviko plotas pagal patologas. Analizei, maži šaldytų audinių (10 mkm X SKIRSNIS 3) buvo parengta naudojant prechilled skustuvo ašmenimis ir lizuoti 100 įxL lizės buferio. Gauti fragmentai buvo laikomi -80 ° C iki vėlesnei analizei

Histopatologiniai apžvalga ir HER2 būklę nustatymas

Visi laisvų H ​​&. El tamsintas skaidres buvo centralizuotai recenzuoja du patologai (ID, KKM ) ne eksperimentinės patologijos branduolys Samsung vėžio tyrimų institutas. Visi naviko pavyzdžiai buvo iš chirurginiu rezekcijos pirminių skrandžio navikų. HER2 būklę nulėmė IHC ir žuvis. IHC analizė buvo atlikta naudojant HercepTest ™ (DaKo, Glostrup, Danija). HER2 baltymo ekspresija lygiai pelnė kaip 0 iki 3+ pagal sutarimą komisijos rekomendacijos dėl HER2 balais GC [13], [14]. Žuvims, buvo naudojamas PathVysion HER2 DNR zondas komplektas (Abbott "Des Plaines, IL). Ariol vaizdo analizės sistema buvo naudojama suskaičiuoti hibridizacijos signalus (GENETIX, San Chosė, JAV). Visi mėginiai su rodiklių HER2 /CEP17 tarp 1,8 ir 2,2 pelnė rankiniu būdu suskaičiavus daugiau nei 60 nepersidengiantiems ląsteles. Koeficientai > 2.2, 1.8 2.2, ar < 1,8 buvo klasifikuojami kaip teigiamas, abejotini arba neigiamas stiprinimas, atitinkamai. Chromosomų 17 polysomy buvo apibrėžiamas kaip CEP17 signalas, kuris turėjo daugiau nei šešis kopijas vidutiniškai per langelį. Iš 447 egzempliorių, 434 egzemplioriai buvo įtrauktos į galutinę analizę.

Bendrai Fermentų Glaudesnis Reaktyviosios-imunologinė (EERT)

CEER skaidres buvo spausdinami, inkubuojami su GC lizatuose ir tvarkomi taip, kaip aprašyta anksčiau [ ,,,0],6]. Skaidrės buvo nuskaityti keturių Photomultiplier (PMT) gauti parametrus padidinti veiksmingą dinaminį diapazoną. Duomenys buvo tinkami penkių parametrų lygtį gautas kaip gaudymo-antikūno koncentracijos ir PMT funkcija ir pateikiami skaičiuojamas vienetais (Cu).

sutankintus-Mikrogardelė spausdinimas.

Capture antikūnai buvo spausdinami nitroceliuliozė dengtos stikliukų (ONCYTE®, Grace Bio-Labs), naudojant bekontakčiams spausdintuvai (Nanoplotter, GeSiM). Vietoje skersmuo buvo maždaug 175 mkm. Skaidres buvo laikomi sausais kameroje, esant 4 ° C temperatūroje. Maždaug 500 pL gaudymo Abs buvo spausdinami tris kartus esant serijos praskiedimo koncentracija 1 mg /ml, 0,5 mg /ml, ir 0,25 mg /ml. Išgrynintas pelės IgG tarnavo kaip neigiamos kontrolės. Imuninės masyvo skaidrių konfigūracijos rodomi S1 paveiksle.

antikūnų konjugacijos ir valymas.

Target-specifiniai antikūnai (pelės monokloninis nuo konkrečios epitopq žmogaus signalo perdavimo baltymų), o atitinkamos detektorius fermentų, gliukozės oksidazės (go) arba krienų peroksidazės (HRP) buvo aktyvuoti su bi-funkcinis kryžminio linkeris, sukcinimidilo-4- (N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilato (SMCC), ir kartu gaunant antikūnas-fermento konjugatus. Konjugatai buvo gryninamas HPLC metodu. Antikūnų veikla išgrynintus junginius lėmė konkurencinė ELISA ir po konjugacijos fermentų veikla buvo aptikti specifiniai kiekvienam detektoriaus fermento funkciniai tyrimai.

CEER tyrimai.

imuniteto mikrogardeliq skaidres buvo skalaujami 2x su TBST (50 mmol Tris /150 mm NaCl /0,1% Tween-20, kurio pH 7,2-7,4), blokavo su 80 pL Whatman blokuojančio buferio 1 val kambario temperatūroje, tada nuplauti 2x su TBST. Serijiniu atskiesti lizatas kontrolę ar pavyzdžius 80 mikrol praskiedimo buferio (2% BSA /0,1% TritonX-100 /TBS, pH 7,2-7,4) buvo pridėta į paskirtų sub-matricos ant skaidrių ir inkubuojami 1 valandą kambario temperatūroje. Skaidres buvo plaunamos 4X (3 minutės. Kiekvienas), ir detektorių Abs buvo pridėta 80 pL reakcijos buferinio tirpalo ir inkubuojami 2 valandas kambario temperatūroje. Po skalbimo slysta su TBST pašalinti nesusiję detektoriaus ABS, 80 pL biotino-tyramide tirpalo (5 mikrogramai /ml 50 mM gliukozės /PBS) yra pagaminti iš 400 mikrogramų /ml etanolio tirpalo (Perkin-Elmer gyvosios gamtos) buvo įtraukta ir inkubuojami 15 min tamsoje. Go /HRP tarpininkaujant tyramide signalas amplifikacija procesas buvo nutrauktas plaunant TBST 4X, 3 minutės kiekvienam. Vietos nusėdimas biotino-tyramide buvo aptikta inkubuojant su streptavidino (SA) -Alexa647 (Invitrogen), esant nuo 0,5 g /ml 2% BSA /0,1% Triton /TBS 40 min. Baigus inkubacijos skaidres buvo plaunami 4X su TBST, džiovinti ir laikyti tamsoje, kol jie buvo nufotografuota per mikrogardeliq skenerio.

CEER duomenų analizė, skaidres buvo nuskaityti keturių PMT gauti parametrus padidinti veiksmingą dinamiką diapazonas. Background-ištaisyti signalo intensyvumas buvo vidutiniškai už dėmės spausdintų trimis egzemplioriais. Keli kriterijai buvo naudojami filtruoti duomenis išsamesnei analizei, įskaitant apribojimus vietoje pėdsakus, variacijos koeficientas taškiniam kartotinių bei bendra trinkelėmis fone. Kiekvieno tyrimo standartinis kreivė buvo gautos iš serijiniu sumažintą kontrolės ląstelių fragmentai, paruoštus iš ląstelių linijų su gerai apibūdina signalo perdavimo baltymų. Duomenys buvo tinkami penkių parametrų lygtį gautas kaip gaudymo-antikūno koncentracijos ir PMT funkcija. Standartinė kreivė kiekvieną persekiotoją buvo tilptų kaip log signalo intensyvumo funkcija, matuojamas santykinis fluorescencijos vienetą (RFU) vs žurnalo koncentracija ląstelių fragmentai ir nuorodą į standartinių ląstelių linijų. Pavyzdžiui, standartinė kreivė iš serijiniu atskiestų ląstelių lizato, pagamintus iš BT474 buvo naudojamas normalizuoti HER2 raišką ir fosforilinimo laipsnį kiekvieno mėginio (S2 pav). Taigi, pavyzdys 1 CU HER2 raiškos turi RFU vertės, atitinkančio RFU vertės 1 etaloninis BT474 langelį. Kaip pagalbos ląstelės turi 1~2 × 10 ^{6 HER1 ar HER2 receptoriai per ląstelės su maždaug 10% fosforilintų receptorių, 1 CU atstovauja 1~2 × 10 6 RTKs ar 1~2 × 10 5 fosforilinamos RTKs [6]. Aptikimo (LOD) vertę CU riba buvo pasiryžę būti mažesnis nei 1 CU tiek saviraiškos ir aktyvacijos HER2. Individualūs prognozės iš kiekvieno praskiedimo ir įgyti buvo vidutiniškai į vieną, galutinę prognozavimas.}

sutrumpintas HER2 praturtėjimo

Visas ilgis-p185-HER2 receptoriai buvo pašalinami iš vėžinių audinių lizatuose naudojant magnetinio karoliukas sukabintos antikūnų būdingi tarpląstelinio domeno (ECD) HER2 kaip parodyta S3 pav. Gautas p185-HER2 išeikvoti lizatais, kuriame yra praturtintas sutrumpintas HER2 (T-HER2) receptorių baltymų trūksta EVD, buvo naudojami vėliau kiekybinio T-HER2 raiškos ir fosforilinimo naudojant atitinkamą CEER tyrimų. Riba yra vertė 500 CU buvo pelnyti p95HER2 pozityvumo per 20 mikrogramų tirtų audinių. Bendras p95HER2 tyrimas Skaitliuko parodymai buvo palyginti su signalų, gautų iš standartinių kreivės, gautos naudojant kontrolinės ląstelių lizatas iš BT474 krūties vėžio ląstelių linija.

Mobilusis Kultūra ir reagentai

EERT tyrimo kontrolės ląstelių linijos , MDA-MB-468, T47D, HCC827 and BT474 ląstelės su įvairaus ErbB RTK išraiška buvo gauti iš ATCC ir išaugo 37 ° C 5% CO _{2 - už MDA-MB-468 (Dulbecco minimalus būtinas terpė (DMEM) + 10% FBS), BT474 (DMEM + 10% FBS), ir HCC827 ir T47D (RPMI 1640 + 10% FBS, 0,2 V /ml galvijų insulino). Ląstelės buvo skaičiuojamas ir plaunamas 1 × PBS prieš augimo faktoriaus stimuliacijos. MDA-MB-468 ląstelės buvo stimuliuojama su 100 nM epidermio augimo faktoriaus (EGF) arba transformuojančio augimo faktorių (TGFα), T47D ląstelės buvo stimuliuojama su 20 nM heregulin beta (HRGβ) arba 100 ng /ml į insuliną panašaus augimo faktoriaus-1 (IGF1) į augimo žiniasklaidos serumo nemokamai 5 arba 15 min. SUŽADINTĄ ląstelės buvo išplauti su 1 × PBS ir tada lizuojamos (lizės buferis: 50 mmol Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% trition X-100 ir 2 mM Na 3VO 4) ir laikomi ledo 30 minutės prieš pradėdami vartoti skystį už vėlesnį tyrimą arba laikomi -80 ° C.}

EERT žymeklis nustatymas ir šilumos žemėlapis grupavimas

Pozityvumas tam tikrą biologinis žymuo buvo apibrėžtas kaip didesnis nei trečiąjį kvartiliui individualiam biologinis į pacientų populiacijos šio tyrimo. Pacientai buvo reitinguojami remiantis CU vertės iš CEER tyrimą tam tikram biologinis žymuo. Šie pacientai didesnis nei trečiąjį kvartilis nukirpimas buvo laikomi aukščiausios rizikos turėti padidėjusį žymenų koncentracijų ir todėl potencialiai aktyvuota signalo kelius. Po išgyvenamumo analizė buvo atlikta siekiant įvertinti predikatinių kokybę šių Apipjaustymas.

biologinis profilis navikų mėginiuose atstovavo šilumos žemėlapyje. Kiekviena ląstelė buvo nudažyta remiantis decilinis rango laikmenos ši žymė yra aktyvacijos. Kiekvienas žymeklis buvo reitinguojami pagal decilėse, atstovaujamos atskira pavėsyje, su naudotojo veiklos mastu, nurodant spalvą. Tiek eilėje (pacientas) ir skiltis (žymeklis) grupavimas buvo parodyta. Pilnas ryšys algoritmas buvo naudojamas siekiant gauti hierarchinę klasterį (arba Dendrogramoje) paeiliui grupuojant labiausiai koreliuoja pastabas per hclust funkciją R, vadinama pagal heatmap.2 funkcija prieinama su gplots bibliotekoje statistinės aplinkos R kalbą ir aplinka statistikos Kompiuterija (http://www.r-project.org/). Pogrupiai žymeklių buvo apibrėžta į grupes, kad leido palyginti žymėtųjų profilių pacientų.

BTK ir ATC izoliacija

CTC vertinimo, 7,5 ml kraujo mėginiai buvo paimti į 10 ml evakuota Etilendiamino tetraacto rūgšties (EDTA) vamzdžiai. CellSearch sistema (Veridex) buvo naudojamas imuno-magnetinė CTC atskirai pagal protokolą anksčiau aprašytą [6], naudojant ferrofluids konjuguoto su Ab prieš epitelio ląstelių adhezijos molekulės. ATC vertinimo, korinio turinys buvo praturtintas nuo 50 iki 100 ml ascito skystyje centrifuguojant ir imuninės sistemos magnetinio naviko ląstelių izoliavimo buvo atliktas panašiai. Keli rinkiniai ATCS buvo gydomi kokteilių augimo veiksnių (EGF HRG, hgf ir IGF1) su arba be lapatinibui ir PHA-665,752 inhibitoriaus derinys.

Rezultatai ir diskusijos

Ligonių charakteristikos

Charakteristikos 434 GC pacientams yra teikiamos 1 lentelėje Visi pacientai gavo gastrectomies su D2 limfmazgių skrodimo su 242 (55,8%) pacientų, vartojusių Tarpinė suma gastrectomies. Pasak AJCC 2002 sustojimo sistema, 86 pacientų patologinį I etapas, 116 turėjo II etapas, 126 turėjo III etapas ir 106 turėjo IV etapas (35 pacientams, sergantiems metastazavusiu M1) GC. Tuo analizės metu 226 pacientai buvo miręs ir 237 pacientai dokumentais pasikartojimo. 70 pacientų antspaudo žiedas ląstelių karcinoma. Bendras 5 metų ir ligų be išgyvenamumas buvo 52,4% ir 50,0%, atitinkamai. Visos pirminės GC audiniai buvo įsigyta ne operacijos metu ir iš karto Snap įšaldytos ateityje molekulinės analizės.

CEER pagrindu tyrimai atskleidžia heterogeniškumas į HER2 raiškos ir buvimo HER2 nupjauto variantu, p95HER2, kad HER2 (+), skrandžio vėžio

Mes jau anksčiau pranešė, kad imuninės Mikrogardelė pagrindu CEER tyrimų plėtrą [6], [15]. Mes naudojamas CEER-remiantis HER2 tyrimą ištirti, ar navikas HER2 statusą HER2 (+) ir HER2 (-) mėginius mūsų GC pacientų kohortos, kad buvo atskirtas pagrįsta standartine IHC HercepTest medžiagos /žuvų analizės. Iš CEER-pagrįstas tyrimų privalumas yra tai, aukštesnis jų jautrumas ir specifiškumas, palyginti su IHC pagrindu tyrimų [6]. Remiantis turima HER2 (+) apibrėžčių GCS [13], [14], ty, mėginiai su HER2 IHC rezultatas 3+ ar 2+ ir teigiamas, HER2
geno statusas, 50 434 (11,5%) mėginiai mūsų GC pacientų kohortos buvo HER2 (+), IHC HercepTest /Žuvis analizė (lentelė S1). Priešingai, pagal konkrečius krūtų vėžio į IHC gaires, tik 78% (39/50) iš šių pacientų buvo HER2 (+) (lentelė S1), rodantis vertinimo kriterijais skirtumus ar navikas HER2 teigiamas tarp skrandžio ir krūties vėžio. Iš HER2 (+) GCS dauguma (36 iš 50 mėginių (72%)) buvo žarnyno potipio, o ne iš pasklidųjų arba mišraus tipo GKS susitarusi su paskelbtais pranešimais [13], [16], [17].

EERT pagrindu HER2 tyrimo parodė gerokai didesnės HER2 raiškos lygį IHC /Žuvis HER2 (+) navikų, palyginti su tų, HER2 (-) navikai (su vidutinę vertę 77,9 VV vs 4.3 Cu, p-reikšmė 8.18E-10), kaip parodyta 1A pav. CEER pagrindu HER2 duomenys pateikiami CU, standartinis funkcinis vienetas, remiantis ląstelių linijos kontroliuoja žinomas HER2 raiškos [6], kad būtų galima palyginti HER2 raiškos visoje mėginių. Tik 32/50 arba 64% IHC /Žuvis HER2 (+) GCS parodė HER2 ekspresiją EERT ir ten buvo nemažai žmonių heterogeniškumas HER2 raiškos šių mėginių kaip matyti iš kiekybinių CEER rodmenis. Heterogeniškumas HER2 ekspresija gali paaiškinti, kodėl tik vidutinio sunkumo laipsnį nuoseklūs (87,5%) tarp IHC ir žuvų rodmenis už HER2 į TOGA teismą [12] priežastį. Šis neatitikimas būtų tiesiogiai paveikti HER2 orientuojasi terapijos rezultatus, pavyzdžiui, trastuzumabu GCS. Be to, dėl didelio jautrumo CEER tyrimą, buvo pastebėta, kad ~20% nuo IHC /Žuvis HER2 (-) GCS dar išreiškė bendrą HER2 nors aiškiai žemesnio lygio nei HER2 (+) pacientų populiacijos
.

Naudojant CEER-remiantis p95HER2 Bandymo platformą, nupjauto formos HER2 buvo specialiai aptikta, be to, pilnas ilgis HER2, į gcs pirmą kartą. p95HER2 išraiška buvo analizuojamas 31/50 HER2 (+) mėginių ir 27/384 HER2 (-) mėginių), kad pasireiškė reikšmingas visą ilgį HER2 ekspresiją EERT (1b pav.) Iš p95HER2 dažnis HER2 (+) GCS buvo ~77% (iš 24/31 mėginių) (lentelė S1). Panašus į visą ilgį HER2 raiškos, iš p95HER2 išraiškos dauguma (79% p95HER2 išreikštas HER2 (+)) buvo aptikta žarnyno tipo GKS. p95HER2 sąvoka taip pat buvo pastebėtas nedidelis procentas HER2 (-) GCS (37% arba 10/27 mėginiai), kad parodė visą ilgį HER2 raiška. Tačiau vidutinis p95HER2 išraiška HER2 (+) GC pavyzdžių buvo gerokai didesnis nei stebėtas HER2 (-) GCS (5083,6 Cu HER2 (+) vs 437.0 Cu HER2 (-), p reikšmė = 1.27e-05 ). p95HER2 gali prisidėti prie trastuzumabu non-reagavimą į GC navikų, kaip ji tai daro 70-80% HER2 krūties vėžio [18]. Trastuzumabu plius standartinė chemoterapija teikiamos HER2 bendrą atsaką tik 47% (+) GCS į TOGA teismą [12] nurodant egzistavimą galimų atsparumo trastuzumabu mechanizmų ir mūsų nesugebėjimas tiksliai pasirinkti trastuzumabu gelbėtojams. Siekiant kliniškai patvirtintų p95HER2 išraišką su atsparumu trastuzumabo, kuris buvo ginčytinas, ypač dėl to, kad pastaraisiais prieštaringų išvadų iš GeparQuattro krūties vėžio tyrimų [19], griežtas p95HER2 tyrimas tobulinimas požiūriu kliniškai atitinkamų diagnostinė analizė atskyrimo nustatymų ir taikymo klinikinių nustatymų nereikia. Iš p95HER2 išraiškos patvirtinimas planuojamas II etapas neoadjuvantas lapatinibui plius chemoterapijos klinikinių tyrimų metu GC pacientams keli tyrimai rodo, kad lapatinibui naudojimą p95HER2 (+) vėžio [20], [21].

Kartu mūsų duomenys aiškiai apibrėžti HER2 būklės gCS ir pademonstruoti EERT pagrindu HER2 diagnostikos GC pacientų mėginių naudingumas, nustatant jų tikslus pilnas ilgis ir sutrumpintas HER2 raiška. Tokių diagnostikos plėtra stipriai įtakoti tikslią pasirinkimą HER2 (+) GCS kurie yra atsakas į trastuzumabu ir kitų HER2 skirtomis medžiagomis. Mes jau anksčiau pranešė, kad EERT pagrindu HER2 diagnostikos naudojimą krūties vėžiu sergantiems pacientams [6], [15], kad įrodė aukštesnį jautrumą ir specifiškumą, palyginti su IHC diagnostika.

Skrandžio vėžio įrodyti vartojo aktyvavimą signalo perdavimo kelių

Mes naudojome CEER tyrimą tiesiogiai GC mėginių įvertinti visų ir fosforilintų (aktyvintas) formų kelių signalinių molekulių, kurie yra žinomi narkotikų tikslus buvimą: apėmė keletas RTKs (HER1, HER2, HER3, cMet, IGF1R) ir PI3K. Reprezentacinės vaizdai multipleksines CEER keliu-masyvų iš aštuonių skirtingų pavyzdžių rodomi 2A pav. Šie vaizdai aiškiai įrodyti aktyviajame kelią parašų įvairiapusiškumą, kuris yra paplitęs GCS. Pavyzdžiui, tiek HER1 /HER2 yra coactivated ir 6 mėginių 1, kadangi tik HER2 įjungiamas mėginio 2 nors HER1, HER2 ir cMet yra išreikštas didelis. Imties 5 rodo aktyvacijos visų 5 analizuotų RTKs įskaitant vartotojų PI3K ir SHC kelius. Šiame skyriuje aprašoma signalinio kelio heterogeniškumas pastebėtą mūsų GC pacientų kohortos, kaip nustatyta CEER tyrimus.

Augliai iš 202 pacientų (46,5%) turėjo neaptinkama aktyvavimo išbandytų mūsų tyrime RTKs. Kelias aktyvavimo modelius ataskaita apie navikų poilsio, kaip vaizduojamas kelias grupavimo analizė (2b pav), skyrėsi su kai GCS parodyti vartojo aktyvavimo keliais RTKs pvz HER2 /HER3, HER1 /2/3, HER1 /3 /cMet arba HER3 /cMet o kiti buvo fosforilinamos tik vieną baltymų. Navikas kiekis visų tirtų mėginių buvo > 70%, remiantis jų histologinio tyrimo. Tačiau visos citokeratino (visos CK) išraiška buvo aiškiai kintamasis rodo, heterogeniškumas epitelio turinio GCS. Remiantis šia profiliavimo, mes suskirstyti į 434 GC mėginio kohortos pagal jų RTK aktyvacijos parašų ir HER2 būklės

JOS ašis skrandžio vėžio. (2 lentelė & lentelė S1).

Bent vienas receptorius narys JAI ašies buvo aktyvuota 41% GC pacientams. HER2 fosforilinimas buvo aptikta ne tik 50% HER2 (+) GC pacientų, bet taip pat ~22% HER2 (-) vėžio atvejai susitarimą su pastebėtas anksčiau aprašyto visos HER2 raiška. 16/25 HER2 (+) mėginiai, kad pastebėta, aktyvuotos HER2 taip pat išreiškė p95HER2. Be to, HER3 taip pat buvo fosforilinamos sudaro didesnę procentinę dalį HER2 (+) GCS (36%), palyginti su HER2 (-), vėžio (~24%). Tačiau, fosforilinto HER1 neturėjo tokio pirmenybę ir buvo ekvivalentiškai aktyvuota abiejų GC tipų (26% HER2 (+) ir 25% HER2 (-)). Be to, dauguma paties valstybė aktyvuota GC navikų (~64%) parodė vartojo aktyvacijos kitų RTKs, t.y., cMet ar IGF1R. Histologiškai, iš HER2 (+) dauguma, žarnyno tipas GCS išreiškė aktyvuotą HER2 (į 22/36 arba ~61%), po to HER3 (į 13/36 arba ~36%), kurių bendras 36% žarnyno tipo GKS išreikšti aktyvuotą HER2 kelią. Apskritai, HER2 aktyvacijos buvo labiau koncentruota žarnyno tipo (55/154 arba 35,7%), lyginant su difuzine tipo vėžio (43/225 arba 19,1%). Priešingai, aktyvuota HER1 buvo vienodai pastebima tiek žarnyno tipo (38/154 arba 24,7%) ir difuzinio tipo (58/225 arba 25,8%) GCS. Aktyvuotas HER3 taip pat buvo analogiškai metu (29,9% ir 21,8%) tarp abiejų Lauren klasifikacinių potipių.

Kadangi signalizacijos funkcija JAI kinazės ašies priklauso nuo aktyvuota receptorių dimerizacijai, mes pažvelgė įvairių porų JAI narys coactivations. Coactivation apie HER2 su HER3 buvo teikiama pirmenybė HER2 (+), vėžio (13/50 arba 26%) su 7/13 HER2: HER3 aktyvuota GCS be HER1 coactivation. Maždaug 54% iš HER2: HER3 coactivated HER2 (+) GCS persipynusių p95HER2. Kita vertus, HER2 (-) GCS neįrodė pirmenybę jokios konkrečios JOS kinazės dimerai poroje su visų trijų galimų aktyvintos dimerų porų (HER1: HER2, HER1: HER3 ir HER2: HER3), išreiškiamas ~15% kiekviena HER2 (-) mėginiai. Trivietis aktyvavimo HER1 /2/3 receptorius buvo stebimas 11,1% iš GCS su nežymiai didesniu paskirstymo HER2 (-) vėžio

cMet aktyvuota skrandžio vėžio (3 lentelė & lentelė S1).
.

Panašus į HER1, cMet fosforilinimo buvo ekvivalentiškai paskirstyta tarp HER2 (+) (22%) ir HER2 (-) (~25%) gcs. Be to, aktyvuotos cMet paskirstymas grindžiamas Lauren histotype buvo panašus žarnyno (48/154 arba 31,2%) ir difuzinis tipo (55/225 arba 24,4%) GCS.

Daugelis cMet aktyvuota GC mėginių (~ 71% arba 77/108) parodė vartojo aktyvacijos savo kinazės receptorių nariams. Visi mėginiai su fosforilintos cMet parodė cMet
amplifikacijos (duomenys neparodyti). Mes tyrėme pageidaujamą JOS ašių receptorius, kryžminio kalbėtis su cMet keliu. Iš 77 GC mėginių, kurie kelia cMet coactivation su JAI narys, 66 mėginių (~86%) buvo su HER1. Bendras per, cMet buvo pirmenybė coactivated su HER1 (15,2%), lyginant su HER2 (10,1%) arba HER3 (9,7%). Šios pastabos rodo galimą kryžminį kalbėti tarp cMet ir HER1 signalizacijos stažuočių GCS. cMet aktyvacijos niekada bendrai egzistavo su aktyvuota HER3 nebent HER1 ir /ar HER2 taip pat buvo fosforilinamos į to paties mėginio. Maždaug 7% GC pacientų parodė visų trijų JOS ašis receptorių nariams cMet coactivation. Aktyvuotas cMet bendrai egzistavo su p95HER2 išreikšti mėginius 5/24 ir 1/10 HER2 (+) ir HER2 (-) GCS, atitinkamai

IGF1R aktyvuotos skrandžio vėžio (4 lentelė & lentelė S1)..

"Panašus į HER3 aktyvavimo, signalizacijos kelias varomas IGF1 receptorių buvo aktyvus didesnis procentas HER2 (+) gCS (30%), nei HER2 (-) gCS (24,7%). Be to, kaip pastebėjo fosforilintu HER3, aktyvuotos IGF1R buvo analogiškai paskirstyta tarp žarnyno (26%) ir pasklidųjų taršos tipo (~24%) GCS. Šis paskirstymas veda mus ištirti, ar ten buvo IGF1R: HER3 coactivation į GC pacientų kohortos. IGF1R iš tiesų buvo maksimaliai coactivated su p-HER3 ypač HER2 (+) GCS kur 22% ar 11/50 HER2 (+) GCS parodė IGF1R: HER3 coactivation. Tačiau HER2 (-) GCS, procentas IGF1R coactivation su HER3 (į 51/384 pavyzdžius ar 13,8%) buvo panašus į IGF1R coactivation su HER1 (į 53/384 pavyzdžius ar 13,3%). IGF1R: HER2 coactivation (į 45/384 pavyzdžius ar 11,7%), po beveik užmirštas. Apskritai, 34/434 GC mėginiai parodė coactivation visų yra Jos kinazės ašies nariams IGF1R kurių 28 mėginiai taip pat įrodė cMet coactivation. Tačiau cMet retai buvo bendrai aktyvuota IGF1R esant JAI kinazės receptorius narys coactivation nėra. Be to, C-RER: IGF1R coactivations pirmiausia buvo pastebėtas HER2 (-) GCS

GC mėginiai buvo hierarchiškai sugrupuotos pagal jų decilinis pagrindu žymeklis aktyvacijos profilius (2b pav.). Analizė parodė, kad cMet: HER1, HER2: HER3 ir IGF1R: PI3K aktyvavimo modeliai buvo glaudžiai koreliuoja su cMet: HER1 klasteris formuojant atskirą pogrupį.

• PLoS ONE: išraiška AFP ir STAT3 dalyvauja Arseno trioksidas sukeltos Apoptozė ir slopinimas platinimu AFP gaminančios skrandžio vėžio ląsteles
• PLoS ONE: Funkcinis Rėmėjas -308G > variantas naviko nekrozės faktoriaus alfa genas, susijusio su rizikos ir progresavimo skrandžio vėžio Kinijos Population