PLoS ONE A Novel Proteomiikka-Based Clinical Diagnostics Technology Tunnistaa heterogeenisuus in Aktivoitu signaalireaktioteissä mahasyövistä

tiivistelmä

Tarkoitus

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli hyödyntää proteomiikkaa-pohjainen Collaborative Enzyme Enhanced Reaktiivinen (CEER) immunomääritys tutkimaan Proteiinityrosiinin fosforylaatiot diagnostisina merkkiaineiden syöpien (GC ).

Experimental suunnittelu

Protein lysaatit tuoreista-jäädytetty 434 pitkälle GC analysoitiin fosforylaatioon HER1, HER2, p95HER2, HER3 cMET, IGF1 R ja PI3K. Reitti aktivointi kuvioita erillisiä perustuu kasvaimen HER2 tila. Hierarkkinen klusterointi käytettiin määrittämään polku coactivations in GC. Prognostiset arvo reitin aktivaatio kuviot määritettiin vertaamalla tautivapaan elinajan aikoina eri GC alaryhmien käyttäen Kaplan-Meier selviytymisen analyysi. CEER käytettiin myös läsnäolon määrittämiseksi tyrosiinifosforyloidun signa- kiertävien tuumorisolujen (CTC) ja askites kasvainsolujen (ATC).

Tulokset

Käyttäen uutta diagnostiikka immunomääritys, CEER, me osoittavat läsnäolo p95HER2 ja samanaikaisesti aktivoidaan signalointireittien GC kasvainkudoksissa, CTC ja ATC: t eristettiin GC potilailla ensimmäisen kerran. p95HER2 ilmaistaan ​​~77% HER2 (+) GC. Noin 54% GC on aktivoitu HER1, HER2, HER3 cMET tai IGF1 R ja osoittaa huonompi ennuste kuin jos nämä reseptori (RTK: t) eivät ole käytössä. Hierarkkinen klusterointi RTK paljastaa yhteistyön klusterointi fosforyloidun HER1: cMET, HER2: HER3 ja IGF1 R-PI3K. Koaktivaatio HER1 kanssa cMET tekee GC lyhyemmällä tautivapaan elinajan verrattuna vain cMET aktivoitu GC.

Johtopäätökset

Tutkimuksemme korostetaan hyödyllisyys uusi kumppani diagnostiikan tekniikka, CEER joka on vahvat vaikutukset lääkekehityksen ja hoidon seurantaa. CEER käytetään antamaan ymmärtämystä aktivoitua signalointireittien pitkälle GC jotka voivat parantaa merkittävästi kliinisen hoidon kautta tarkka potilaan valinnan kohdennettua terapeuttisten.

Citation: Lee J, Kim S, Kim P, Liu X, Lee T, Kim KM, et ai. (2013) romaani Proteomiikka-Based Clinical Diagnostics Technology Tunnistaa heterogeenisuus in Aktivoitu signaalireaktioteissä mahasyövistä. PLoS ONE 8 (1): e54644. doi: 10,1371 /journal.pone.0054644

Editor: Anthony W. I. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 20 syyskuu 2012; Hyväksytty: 13 joulukuu 2012; Julkaistu: 25 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Lee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: Vaikka PK, XL, TL, NH, GH, AK, AJ, GM, GL ja SS työskentelevät Prometheus Laboratories, tämä ei muuta kirjoittajien noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

molekyylirakennetta suunnattu aineet ovat kiihdyttäneet onkologian alalla. Ottaen huomioon, että noin puolet tyrosiinikinaasi osa ihmisen kinome on liitetty ihmisen syövissä, ei ole yllättävää, että suuri osa nykyisen terapeuttisten kohdistaa eri kinaasien [1], [2]. Koaktivaatio reseptorityrosiinikinaasien (RTK: t) on havaittu osajoukkoja useiden syöpien, kuten glioblastoma multiformen [3], rintasyöpä [2], [4], [5], [6], [7], keuhkosyöpä [8 ], [9], pään ja kaulan alueen syöpä [7] ja mahasyövän [4], [5], [6] siten syytetään niitä välttämättömiä kasvaimen etenemistä ja eloonjäämistä. Nämä havainnot tarjoavat riittävästi kliinistä perustelu seulontaan aktivoitu RTK syövät, jotka voitaisiin sitten ohjata terapeuttisia kohdentamista ja mahdollisesti antaa tiedon järkevään kombinatorisista hoitostrategioita. Kuitenkin yksinkertaisesti analysoimalla ilmentyminen tai aktivointi tilan yhden RTK, joka voi olla erityinen kohdeproteiinin tietyn terapeuttisen on riittämätön valitaan potilailla usein kertaa potilaat eivät reagoi hoitoja, vaikka ilmentymisen kohteena. Useita mahdollisia ongelmia voisi olla vastuussa tällaisesta puutteesta terapeuttista hyötyä kohdennettuja aineita, esimerkiksi 1) samanaikainen aktivointi rinnakkain tai vaihtoehtoisen reittejä, jotka ohittavat perin suunnattu proteiini (t), ja 2) jatkuva muutos molekyyli- ja patologinen ominaisuudet neoplastisten kudosten aikana syövän etenemisessä. Siksi olisi ihanteellista saada kumppani diagnostinen työkalu, joka voitaisiin soveltaa rajoitetun määrän kliinisistä näytteistä kaapata kattava monimutkaisuuden fosforyloidun signalointi verkkojen kasvainkudoksessa lisäksi suoran tavoite RTK proteiinia seurata "kehittyvä" tauti .

Kohdennetut fosforylaatiota analysointi kliinisistä näytteistä on haitannut puutteen vuoksi on helposti käytettävissä kliiniset analyysit, jotka ovat riittävän herkkiä toimiviksi rajoitetusti kliinistä kudoksiin. Olemme aiemmin raportoitu kehittää uusia läheisyyteen-immunomääritys, Collaborative Enzyme Enhanced Reaktiivinen-immunomääritys (CEER, kuvio S1) [6], joka on sopiva analysoimalla sekä koko ilmaisua ja aktivoinnin tilasta proteiinin signa-. CEER voidaan suorittaa multipleksoidun tavalla suoraan kliinisistä näytteistä, jotka voivat olla käytettävissä rajallinen määrä. CEER määritys käyttää muodostumista ainutlaatuinen immuno-kompleksi edellyttää kolokalisaation kahden ilmaisimen entsyymi-konjugoituneen vasta-aineita sen jälkeen, kun kohde-proteiinit on kaapattu microarray. Tämä muoto mahdollistaa tehokkaan ja herkkä havaitsemiseen RTK sekä alavirran polku proteiinit alas yksittäisen solun tasolla (herkkyys on noin 100 zeptomoles). Tässä tutkimuksessa olemme hyödyntäneet CEER määritys tutkia signalointireitille monimutkaisuutta syöpien (GC).

GC ovat suurin syy syövän kuolemaan maailmanlaajuisesti ilmaantuvuus oli 18,9 /100000 tapausta vuodessa ja kuolleisuus nopeudella 14,7 /100,000 vuodessa [10] ja ovat yleisimpiä maligniteetti Koreassa [11]. Metastaattinen GC edelleen terapeuttinen haaste onkologian koska sen huonoon ennusteeseen. Tällä hetkellä trastutsumabi on ainoa aktiivinen kohdennettu aine, joka on osoittautunut olevan tehokas GC Satunnaistetussa vaiheen III tutkimuksessa [12]. Vaikka aktivointi useita RTK on raportoitu GC, niiden vaikutus GC ennusteeseen ei tunneta. Tämä on tärkeää kehittämistä ja soveltamista hoitomuotoja kliinisessä hoidossa GC.

Tässä tutkimuksessa olemme käyttäneet multipleksoidun CEER alustan tasojen määrittämiseksi aktivoitua RTK (HER1, HER2, typistettyjä variantteja HER2, eli p95HER2, HER3 cMET, PI3K, ja IGF1 R) in 434 tuore GC kudoksia ja yrittänyt luokitella GC potilaita mahdollisia alaryhmiin perustuu niiden proteiini-reitin aktivointi kuvioita. Olemme havainneet useita signaali proteiinin aktivointia alaryhmissä GC kasvaimia, jotka korreloivat tautivapaan elinajan (DFS) näillä potilailla. Siksi oletamme, että tarpeeton reitin aktivaatio tulot voivat johtaa jäljellä alavirran signalointia GC, mikä rajoittaa antituumoritehoon of monoterapioita kohdistettu yhden RTK. Lopuksi, olemme kehittäneet potentiaalisesti voimakas menetelmiä, jotka voivat mahdollistaa kliinikot seurata perustason ja kehittyvä muutoksia kasvaimen RTK aktivointi profiilit aikana hoidon avulla verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) ja pahanlaatuisten solujen eristetyt peritoneaalinestettä (askites kasvainsoluja tai ATC ). Yhdessä meidän tutkimus antaa näyttöä samanaikaisesti RTK aktivoitumista GC ihmisen kudoksissa paitsi perustamisesta CEER tehokkaana kliininen työkalu diagnosoimaan ja valvomaan RTK aktivoinnin aikana GC hoidon tai sairauden etenemistä.

Materiaalit ja menetelmät

Patient kohortti ja kudosnäyte Procurement

tutkimus suoritettiin hyväksymisen jälkeen Samsungin Medical Center Institutional Review Board (SMC IRB) ja tietoon perustuvan suostumuksen pidättämistä käyttäen arkistointia kudoksia taannehtivasti kliinistä tietoa. Primaarikasvaimen Näytteet kaikki kerätyt Samsung Medical Center. Kaikki potilaat saivat gastrectomy radikaaleja imusolmukedissektiossa kanssa parantava tarkoitus. Maaliskuun 2001 ja helmikuussa 2005 447 tuore kudoksista saatuja 434 potilasta kerättiin kirurgisesti resektoitiin ensisijainen mahalaukun kasvaimet ja oli saatavilla kädessä. Kaikki tuore kudokset kerättiin (vajaan < 30 minuuttia) leikkausalueella ja otettiin heti jäädytettiin ja varastoitiin nestemäisessä typessä seen myöhempää käyttöä varten. Kasvaimen näytteet vahvistettiin läsnäolo > 70% kasvaimen alueella patologi. Analyysiä varten, pieniä paloja jäädytettyjen kudosten (10 um jakso x 3) valmistettiin käyttäen esijäähdytetty partakoneen terä ja hajotettiin 100 ul: aan lyysipuskuria. Tuloksena lysaatit säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes myöhempää analyysiä.

Histopathology tarkistus ja HER2 aseman määrittelyn

Kaikki saatavilla H &E-värjättyjen Levyjä keskitetysti tarkastelleet kaksi patologit (ID, KKM ) kokeiluasteella patologian ydin Samsung Cancer Research Institute. Kaikki kasvain näytteet olivat kirurgisesti resektoitiin ensisijainen mahalaukun kasvaimet. HER2 tila määritettiin IHC ja FISH. IHC-analyysi suoritettiin käyttäen HercepTest ™ (Dako, Glostrup, Tanska). HER2-proteiinin ekspressiotasoja pisteytettiin 0 3+, konsensuksen mukaan paneelin suosituksia HER2 Tilanne GC [13], [14]. Kaloille, PathVysion HER2 DNA koetinpakkauksen (Abbott, Des Plaines, IL) käytettiin. Ariol kuva analysointijärjestelmä käytettiin laskemaan hybridisaatiosignaaleista (Genetix, San Jose, USA). Kaikki näytteet suhteissa HER2 /CEP17 välillä 1,8 ja 2,2 pisteytettiin manuaalisesti laskemalla yli 60 ei-päällekkäisiä soluja. Suhteet > 2,2, 1,8-2,2, tai < 1,8 luokiteltiin positiivisiksi, epäselvä tai negatiivinen vahvistus, tässä järjestyksessä. Kromosomi-17 polysomy määriteltiin CEP17 signaalin, joka oli enemmän kuin kuusi kappaletta keskimäärin solu. Niistä 447 yksilöitä, 434 näytteet olivat mukana kädessä.

Collaborative Entsyymi Tehostettu Reaktiivinen-immunomääritys (CEER) B

CEER dioja painettiin, inkuboitiin GC lysaatit ja käsitellään kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],6]. Dioja skannattiin neljä valomonistinta (PMT) vahvistusasetuksilla tehostamiseksi dynaaminen alue. Tiedot sovitettiin viiden parametrin yhtälö johdettu funktiona capture-vasta-aineen pitoisuuden ja PMT ja esitetään lasketut yksiköissä (CU).

Multipleksoidut-mikrosirujen tulostusta.

Capture vasta tulostettiin nitroselluloosapohjaisia ​​päällystettyjä lasilevyjä (ONCYTE®, Grace Bio-Labs) käyttäen ei-yhteys tulostimet (Nanoplotter, GeSiM). Paikalla halkaisija oli noin 175 um. Objektilasit säilytetään kuivunutta kammiossa 4 ° C: ssa. Noin 500 pL talteenotto Abs painettiin kolmena rinnakkaisena sarjalaimennosta pitoisuuksina 1 mg /ml, 0,5 mg /ml, ja 0,25 mg /ml. Puhdistettua hiiren-IgG: t toimi negatiivisena kontrollina. Immuno-array slide konfiguraatiot on esitetty kuvassa S1.

Vasta konjugaatio ja puhdistus.

Target-spesifisten vasta-aineiden (hiiren monoklonaalinen vastaan ​​epitoopit ihmisten signaalitransduktion proteiinit) ja vastaava ilmaisin entsyymit, glukoosioksidaasi (GO) tai piparjuuriperoksidaasi (HRP), aktivoitiin kaksitoimisen ristisitojaa, sukkinimidyyli-4- (N-maleimidometyyli) sykloheksaani-1-karboksylaatti (SMCC), ja joka on kytketty jolloin saatiin vasta-aine-entsyymi-konjugaatteja. Konjugaatit puhdistettiin HPLC: llä. Vasta-aine toimintaa puhdistetussa konjugaattien määritettiin kompetitiivinen ELISA ja post-konjugointi entsyymiaktiivisuudet havaittiin funktionaalisia määrityksiä spesifisiä kullekin ilmaisimen entsyymiä.

CEER määrityksissä.

Immuno-mikrosirujen leikkeet huuhdeltiin 2X TBST: llä (50 mM Tris /150 mM NaCl /0,1% Tween-20, pH 7,2-7,4), blokattiin 80 ul: Whatman estopuskuria 1 h RT: ssa, sitten pestiin 2 kertaa TBST: llä. Sarjalaimennettua lysaattia valvontaa tai näytteiden 80 ui laimennuspuskuria (2% BSA /0,1% Triton X-100 /TBS, pH 7,2-7,4) lisättiin nimetty aliryhmille objektilaseille ja inkuboitiin 1 tunnin ajan RT: ssä. Objektilasit pestiin 4X (3 min. Kunkin), ja ilmaisin Abs lisättiin 80 ui reaktiopuskuria ja inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen objektilasit TBST: llä poistamaan sitoutumaton ilmaisimen Abs, 80 ui biotiini-tyramide liuosta (5 ug /ml 50 mM glukoosi /PBS) valmistettiin 400 ug /ml etanoliliuosta (Perkin-Elmer Life Science) lisättiin ja inkuboitiin 15 min pimeässä. GO /HRP-välitteisen tyramide signaalin vahvistus prosessi lopetettiin pesemällä TBST: llä 4X, 3 min kukin. Paikallisesta kertymisestä biotiini-tyramide havaittiin inkuboimalla streptavidiini (SA) -Alexa647 (Invitrogen) on 0,5 ug /ml 2% BSA /0,1% Triton /TBS: ssa 40 minuuttia. Päätyttyä inkuboinnin levyjä pestiin 4X TBST: llä, kuivataan ja säilytetään pimeässä kunnes ne kuvattiin kautta microarray skanneri.

CEER data-analyysi, diat skannattiin neljä PMT vahvistusasetuksilla tehostamiseksi dynaaminen alue. Taustaa korjattu signaali intensiteetit laskettiin keskiarvo paikkoja painettu kolmena kappaleena. Useita kriteereitä käytettiin suodattaa tietoja jatkotutkimuksiin, kuten rajat päällä jalanjäljet, variaatiokerroin spot rinnakkaisnäytteiden ja yleinen pad tausta. Kutakin määritystä varten standardikäyrä muodostettiin sarjalaimennettiin ohjaus solulysaatteja valmistettiin solulinjoja, joissa on hyvin tunnettu signaalitransduktion proteiineja. Tiedot sovitettiin viiden parametrin yhtälö johdettu funktiona capture-vasta-aineen pitoisuuden ja PMT. Standardikäyrä kutakin markkeri sovi funktiona log-signaalin voimakkuus, mitataan suhteellinen fluoresenssin yksikkö (RFU) vs. log konsentraatio solulysaateista ja viitataan standardin solulinjoja. Esimerkiksi standardikäyrä sarjalaimennettua solulysaateista valmistettu BT474 käytettiin normalisoimaan HER2 ilmaisun ja fosforyloitumisaste kussakin näytteessä (kuva S2). Siten näyte 1 CU HER2 ilmaisun on RFU arvo vastaa RFU arvoon 1 standardivertailulannoitteita BT474 soluun. Vertailuna solut ovat 1~2 × 10 ^{6 HER1 tai HER2 reseptoria solua kohti, noin 10% fosforyloitua reseptoreita, 1 CU edustaa ilmaus 1~2 x 10 6 RTK tai 1~2 x 10 5 fosforyloitua RTK [6]. Toteamisrajan (LOD) arvo CU määritettiin olevan alle 1 CU sekä ilmaisun ja aktivointi HER2. Yksittäiset ennusteet kustakin laimentaminen ja voitto laskettiin keskiarvot yhdeksi lopullinen ennustaminen.}

Katkaistu HER2 rikastus

Täyspitkä p185-HER2 reseptoreihin depletoitiin kasvainkudoksen lysaateista käyttäen magneettisia-helmi kytketty vasta spesifinen solunulkoisen domeenin (ECD) HER2, kuten kuviossa S3. Saatu p185-HER2 köyhdytettyä lysaatit, jotka sisälsivät rikastettu typistetty HER2 (t-HER2) reseptoriproteiinit puuttuu ECD, käytettiin myöhemmin kvantifiointia t-HER2-ilmaisun ja fosforylaatiota käyttäen vastaavaa CEER määrityksissä. Käytettiin raja-arvoa 500 CU käytettiin pääsi p95HER2 positiivisuus per 20 ug kudosta analysoitiin. Yhteensä p95HER2 määrityksen lukema oli suhteessa generoidut standardi käyrät muodostettiin käyttäen kontrollina solulysaatti päässä BT474 rintasyövän solulinjassa.

Soluviljely ja reagenssit

CEER määrityksessä ohjaus solulinjoja , MDA-MB-468, T47D, HCC827 ja BT474 soluja vaihtelevalla erbB-RTK ilmentyminen saatiin ATCC ja kasvatettiin 37 ° C: ssa 5% CO _{2 - MDA-MB-468 (Dulbeccon minimal essential (DMEM) + 10% FBS), BT474 (DMEM + 10% FBS), ja HCC827 ja T47D (RPMI 1640 + 10% FBS, 0,2 U /ml naudan insuliinia). Solut laskettiin ja pestiin 1 x PBS: llä, ennen kuin kasvutekijä stimulaatiota. MDA-MB-468-soluja stimuloitiin 100 nM epidermaalisen kasvutekijän (EGF) tai transformoiva kasvutekijä a kappale (TGFa), T47D-soluja stimuloitiin 20 nM hereguliinin β (HRGβ) tai 100 ng /ml Insulin-like Growth factor-1 (IGF1) seerumittomassa kasvatusväliaineessa 5 tai 15 min. Stimuloidut solut pestiin 1 x PBS: llä ja sitten lyysattiin (hajotuspuskuria: 50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Trition X-100 ja 2 mM Na 3Vo 4) ja pidettiin jäillä 30 min ennen supernatantti myöhempää määritystä tai pidetään -80 ° C: ssa.}

CEER merkki päättäväisyyttä ja lämmön kartta klusterointi

Positivity tietylle biomarker määriteltiin suurempi kuin kolmas neljännekseen yksittäisen biomarkkerin potilaspopulaatiossa tämän tutkimuksen. Potilaat rankattiin perustuu CU arvon CEER määritys tietyn biomarker. Ne potilaat suurempi kuin kolmas neljännekseen raja pidettiin suurin riski saada kohonnut biomarkkereiden tasoja ja siten mahdollisesti aktivoitu signaalien kulkureiteillä. Myöhempi eloonjääminen analyysi tehtiin arvioimaan predicative laatua näiden cutoffs.

biomarkkereiden profiili Tuumorinäytteissä edustaa lämpöä kartan. Jokainen solu on colorized perustuu kymmenesosa sijoitus aktivoinnin että merkki. Kukin markkeri oli paremmuusjärjestykseen desiilin, jota edustaa erillinen sävy, jossa asteikko osoittaa värin. Sekä rivi (potilas) ja sarake (merkki) klusterointi näytettiin. Täydellinen sidos algoritmia käytettiin saamiseksi hierarkkinen klusteri (tai dendrogrammissa) ryhmittelemällä peräkkäisesti eniten korreloi havainnot käyttämällä hclust toimintoa R, kutsumassa heatmap.2 toiminto saatavana gplots kirjaston tilastollisen ympäristöä R: A Kieli ja ympäristö tilastollinen tietojenkäsittely (http://www.r-project.org/). Alaryhmiä markkereita määriteltiin ryhmittely jotka mahdollistivat vertailut merkki profiileja potilaille.

CTC ja ATC eristäminen

CTC arviointi, 7,5 ml otettiin verinäytteet otetaan 10 ml: n evakuoitu etyleenidiamiinia (EDTA) putket. CellSearch System (Veridex) käytettiin immuno-magneettisella CTC eristäminen protokollan mukaisesti aikaisemmin kuvatulla tavalla [6] käytetään ferrofluids konjugoitu Ab vastaan ​​epiteelisolujen adheesiomolekyyli. ATC arviointi, solun sisältö oli rikastettu 50-100 ml askites-nesteestä sentrifugoimalla ja immuno-magneettisella kasvainsolujen eristäminen suoritettiin samalla tavalla. Useita sarjaa ATC hoidettiin cocktailien kasvutekijöiden (EGF, HRG, HGF ja IGF1) kanssa tai ilman lapatinibi ja PHA-665752 estäjän yhdistelmä.

Tulokset ja keskustelut

Potilaan ominaisuudet

Ominaisuudet 434 GC potilaille annetaan taulukossa 1. Kaikki potilaat saivat gastrectomies D2 imusolmukedissektiossa kanssa 242 (55,8%) potilaista, jotka saivat välisumma gastrectomies. Mukaan AJCC 2002 pysähdyspaikan järjestelmä, 86 potilaalla oli patologisen vaihe I, 116 oli vaiheen II, 126 oli vaiheen III ja 106 oli vaiheen IV (35 Metastasoivassa M1) GC. Tuolloin analyysin, 226 potilasta oli kuollut ja 237 potilasta oli dokumentoitu toistumisen. 70 potilaalla oli sinettisormus cell carcinoma. 5 vuoden yleistä ja taudista vapaan eloonjäämisprosentti oli 52,4% ja 50,0%, tässä järjestyksessä. Kaikki ensisijainen GC kudokset hankittiin aikaan leikkauksen ja välittömästi jäädytettiin myöhempää molekyylitason analyysi.

CEER perustuvissa määrityksissä paljastaa heterogeenisyys HER2 ilmaisun ja läsnäolo HER2 katkaistun muunnelman, p95HER2, HER2 (+) mahalaukun syövät

Olemme aiemmin raportoitu kehitystä immunologiseen microarray perustuva CEER määritykset [6], [15]. Käytimme CEER perustuvan HER2 määritys tutkimaan HER2 tila HER2 (+) ja HER2 (-) näytettä meidän GC potilaan kohortin jotka erillisiä perustuu standardiin IHC HercepTest /FISH-analyysi. Etuna CEER perustuvissa määrityksissä on niiden korkeampi herkkyys ja spesifisyys verrattuna IHC perustuvissa määrityksissä [6]. Tämänhetkisen HER2 (+) määritelmät GC [13], [14], eli näytteitä HER2-IHC pisteet 3+ tai 2+ ja positiivinen HER2
geenimonistuksen asema, 50 434 (11,5%) näytteistä meidän GC potilaan kohortin oli HER2 (+) IHC HercepTest /FISH-analyysi (taulukko S1). Sen sijaan mukaan IHC ohjeiden spesifinen rintasyöpiä, vain 78% (39/50) näistä potilaista oli HER2 (+) (taulukko S1), joka osoittaa erot pisteytys kriteerit HER2 positiivisuuden välillä maha- ja rintasyöpiä. Enemmistö HER2 (+) GC (36 ulos 50 näytettä (72%)) oli suolen alatyyppiä sijaan levinnyttä tai sekamuotoinen GC kanssa julkaistu raportteja [13], [16], [17].

CEER-pohjainen HER2 määrityksessä osoitti merkittävästi korkeammat HER2 ekspressiotasot IHC /FISH HER2 (+) kasvaimissa verrattuna on HER2 (-) kasvaimet (, jonka keskiarvo on 77,9 CU vs. 4,3 CU, p-arvo 8.18E-10), kuten on esitetty kuviossa 1A. CEER perustuva HER2 tiedot esitetään CU, standardi toiminnallinen yksikkö perustuu solulinjaan ohjaa joilla tiedetään HER2 ilme [6], joka mahdollistaa vertailun HER2 ilmaisun poikki näytteitä. Vain 32/50 tai 64% IHC /FISH HER2 (+) GC osoitti HER2 ilmentyminen CEER ja oli merkittävää heterogeenisyyttä HER2 ilmaisun näiden otosten paljastui kvantitatiivisen CEER lukemat. Heterogeenisyys HER2 ilmentyminen voi selittää syyn vain kohtalaisesta vastaavuustaulukkoa (87,5%) välillä IHC ja FISH lukemat HER2 että Toga tutkimuksessa [12]. Tämä ristiriita voisi suoraan vaikuttaa lopputulokseen HER2 kohdistettavan terapeuttisten kuten trastutsumabi in GC. Lisäksi koska suuri herkkyys CEER määrityksen, havaittiin, että -20%: n IHC /FISH HER2 (-) GC riitti yhteensä HER2 joskin selvästi alhaisempi kuin HER2 (+) potilasryhmässä.

käyttäminen CEER-pohjainen p95HER2 määrityksen alusta, lyhennettyjä muotoja HER2 havainnut, lisäksi täyspitkä HER2, ja GC ensimmäistä kertaa. p95HER2 ilmentyminen analysoitiin 31/50 HER2 (+) näytteet ja 27/384 HER2 (-) näytettä), joka osoitti merkittävää täyspitkä HER2 ilmentymisen CEER (kuvio 1 B). Ilmaantuvuus p95HER2 HER2 (+) GC oli ~77% (vuonna 24/31 näytettä) (taulukko S1). Samanlainen kuin täyspitkä HER2 ilmaisu, että suurin osa p95HER2 lauseke (79% of p95HER2 ilmaistuna HER2 (+)) havaittiin suoliston tyyppi GC. p95HER2 ilmentyminen havaittiin myös pieni osa HER2 (-) GC (37%: n tai 10/27 näytettä), jotka osoittivat täyspitkän HER2 ilme. Kuitenkin keskimääräinen p95HER2 ilmaisua HER2 (+) GC näytteissä oli merkittävästi suurempi kuin havaittu HER2 (-) GC (5083,6 CU in HER2 (+) vs. 437,0 CU in HER2 (-), p-arvo = 1.27e-05 ). p95HER2 voi osaltaan trastutsumabille kuin reagointikykyä GC kasvaimissa tapaan kuin 70-80% HER2 yli-ilmentävät rintasyövistä [18]. Trastutsumabi plus tavanomaisen kemoterapian sulatettu kokonaisvasteeksi vain 47% vuonna HER2 (+) GC on Toga tutkimuksessa [12] osoittaa, onko mahdollista trastutsumabin resistenssimekanismeja ja meidän kyvyttömyys tarkasti valita trastutsumabi vasteen. Jotta kliinisesti vahvistaa p95HER2 ilmaisutapoja trastutsumabi vastus, joka on kiistanalainen erityisesti koska viime ristiriitaisia ​​havainnot GeparQuattro rintasyöpätutkimuksissa [19], tiukka p95HER2 määritys tarkentaminen kannalta kliinisesti relevantti diagnostisen määrityksen raja-määritykset ja sovellettavuutta kliinisissä puitteissa on tarpeen. Validoinniksi p95HER2 ilmaisun suunnitellaan vaiheen II neoadjuvant lapatinib plus kemoterapia kliinisessä tutkimuksessa GC potilailla useat tutkimukset viittaavat käytön lapatinibi vuonna p95HER2 (+) syövät [20], [21].

Yhdessä tietomme selkeästi määritellä HER2 tila GC ja osoittavat hyödyllisyys CEER perustuvien HER2 diagnostiikan GC potilasnäytteistä määrittämiseksi niiden tarkka koko pituudeltaan ja katkaistun HER2 ilme. Kehittää sellaisia ​​diagnostiikan voimakkaasti vaikuttaa tarkka valinta HER2 (+) GC jotka ovat vaste trastutsumabille ja muut HER2 kohdentamisaineita. Olemme aiemmin raportoitu käytön CEER perustuvien HER2 diagnostiikka syöpäpotilaista [6], [15], että osoitti suurempi herkkyys ja spesifisyys verrattuna IHC-diagnostiikan.

mahasyövistä osoittavat samanaikainen aktivointi signalointipolkujen

Käytimme CEER määritys suoraan GC näytteiden arvioida läsnäolo koko ja fosforyloidun (aktivoitu) muodot useiden signalointimolekyylien, joiden tiedetään lääkekohteita: näihin kuuluivat useat RTK (HER1, HER2, HER3 cMET, IGF1 R) ja PI3K. Edustavat kuvat multipleksoidun CEER reittiin paneelit kahdeksasta eri näytteistä on esitetty kuviossa 2A. Nämä kuvat osoittavat selvästi heterogeenisyys aktivoitu koulutusjakson allekirjoitukset on vallalla GC. Esimerkiksi sekä HER1 /HER2 ovat coactivated näytteissä 1 ja 6, kun taas vain HER2 aktivoidaan näytteessä 2 vaikka HER1, HER2 ja cMET ilmaistaan ​​korkeille tasoille. Näyte 5 osoittaa aktivoitumisen kaikki 5 analysoitu RTK lukien loppupään PI3K ja Shc polkuja. Seuraavassa jaksossa kuvataan signalointireitille heterogeenisyys havaittiin meidän GC potilaan kohortin määritettynä CEER määrityksissä.

Kasvaimet 202 potilasta (46,5%) ei ollut havaittavaa aktivointi RTK testattu tutkimuksessamme. Pathway aktivointi kaavoja muun kasvainten, kuten kuvataan koulutusjakson klusterointi analyysi (kuvio 2B), vaihtelivat suuresti joidenkin GC osoittavat samanaikainen aktivointi useita RTK kuten HER2 /HER3 HER1 /2/3, HER1 /3 /cMET tai HER3 /cMET toiset fosforyloitiin ainoastaan ​​yhden proteiinin. Kasvain sisältö kaikista analysoiduista näytteistä oli > 70% perustuen niiden histologinen tutkimus. Kuitenkin yleiseurooppalainen sytokeratiini (pan-CK) ilmentyminen oli selvästi vaihteleva viittaa heterogeenisuus epiteelin sisällön GC. Tämän perusteella profilointia, me luokiteltu 434 GC näyte kohortti niiden RTK aktivointi allekirjoituksia ja HER2 tila.

HER akselin syöpien (taulukko 2 & taulukko S1).

Vähintään yksi reseptori jäsen HER akselin aktivoitiin 41% GC potilaista. HER2 fosforylaatio havaittiin paitsi 50% HER2 (+) GC potilaiden lisäksi myös ~22% HER2 (-) syövät yhteisymmärryksessä havaittu koko HER2 ilme on kuvattu aikaisemmin. 16/25 HER2 (+) näytteet, jotka osoittivat aktivoida HER2 ilmaisi myös p95HER2. Samoin, HER3 myös fosforyloitiin suurempi osuus HER2 (+) GC (36%) verrattuna HER2 (-) syöpiä (~24%). Kuitenkin fosforyloitu HER1 ei ole tällaista etusija ja sen vastaavasti käyttää molemmissa GC tyypit (26% HER2 (+) ja 25% HER2 (-)). Lisäksi useimmat HER jäsenen käytössä GC kasvaimia (~64%) osoitti samanaikaisesti aktivoinnin muita RTK: iden, toisin sanoen, cMET tai IGF1 R. Histologisesti, suurin osa HER2 (+), suoliston tyyppi GC ilmaisi aktivoitu HER2 (in 22/36 tai ~61%) ja sen jälkeen HER3- (in 13/36 tai ~36%) joiden kokonaispituus 36% suoliston tyyppiä GC ilmentävät aktivoitua HER2-reitin. Kaiken HER2 aktivointi oli keskittynyt enemmän suolen tyyppiä (55/154 eli 35,7%) verrattuna hajanainen-tyypin syöpiä (43/225 eli 19,1%). Sen sijaan aktivoitu HER1 oli yhtä havaittiin sekä suolen-tyyppinen (38/154 eli 24,7%) ja diffuusi tyyppi (58/225 eli 25,8%) GC. Aktivoidut HER3- oli myös vastaavasti läsnä (29,9% ja 21,8%) välillä sekä Lauren luokitus alatyyppejä.

Koska signalointi funktio HER-kinaasin akselille riippuu aktivoiman reseptorin dimerisaation, tarkastelimme eri paria HER jäsen coactivations. Koaktivaatio HER2 kanssa HER3- pidettiin parempana HER2 (+) syöpiä (13/50 eli 26%) ja 7/13 HER2: HER3- aktivoitu GC ilman HER1 koaktivaatio. Noin 54%: n HER2: HER3- coactivated HER2 (+) GC ekspressoidaan p95HER2. Toisaalta, HER2 (-) GC eivät osoittaneet suosivat mitään erityistä HER-kinaasin dimeeriä pari kaikki kolme mahdollista aktivoida dimeeriä paria (HER1: HER2, HER1: HER3 ja HER2: HER3-) ilmaistuna -15% kussakin HER2 (-) näytteitä. Triple aktivoituminen HER1 /2/3-reseptorien havaittiin 11,1% GC kanssa hieman korkeampi jakauma HER2 (-) syöpiä.

cMET aktivoitu syöpien (taulukko 3 & taulukko S1).

Samanlainen HER1, cMET fosforylaatio oli vastaavasti jaettiin HER2 (+) (22%) ja HER2 (-) (-25%) GC. Lisäksi aktivoitu cMET jakelu perustuu Lauren histotype oli samankaltainen suoliston (48/154 eli 31,2%) ja diffuusi-tyypin (55/225 eli 24,4%) GC.

Suurin osa cMET aktivoitua GC näytteitä (~ 71%: n tai 77/108) osoittivat, samanaikaisen aktivaation HER-kinaasin reseptori jäsentä. Kaikki näytteet, joiden fosforyloidun cMET osoitti cMET
vahvistusta (tuloksia ei ole esitetty). Olemme tutkineet ensisijainen HER akselin reseptoreja että ylikuuluminen kanssa cMET polku. Niistä 77 GC näytteet osoittaisivat cMET koaktivaatio kanssa HER jäsen, 66 näytettä (~86%) olivat HER1. Kaiken Myös cMET oli ensisijaisesti coactivated kanssa HER1 (15,2%) verrattuna HER2 (10,1%) tai HER3- (9,7%). Nämä havainnot viittaavat siihen, että ylikuuluminen välillä cMET ja HER1 signaalireaktioteissä GC. cMET aktivointi koskaan rinnalla oli aktivoitu HER3 ellei HER1 ja /tai HER2 myös fosforyloidun samasta näytteestä. Noin 7% GC hoidetuista potilaista koaktivaatio kaikkien kolmen HER akselin reseptorin jäsenille cMET. Aktivoitu cMET rinnalla oli p95HER2 ilmentävien näytettä 5/24 ja 1/10 HER2 (+) ja HER2 (-) GC, vastaavasti.

IGF1 R aktivoitu syöpien (taulukko 4 & taulukko S1).

Samanlainen HER3- aktivoinnin signalointireitin ohjaavat IGF1- reseptori oli aktiivinen suurempi prosenttiosuus HER2 (+) GC (30%) kuin HER2 (-) GC (24,7%). Lisäksi, kuten havaitaan fosforyloidun HER3 aktivoitu IGF1 R on vastaavasti jaettu suolen (26%) ja diffuusi-tyyppi (~24%) GC. Tämä jakelu johtaa meidät tutkimaan, jos siellä oli IGF1 R: HER3- koaktivaatio GC potilaan kohortissa. IGF1 R todellakin maksimaalisesti coactivated p-HER3- erityisesti HER2 (+) GC jossa 22% tai 11/50 HER2 (+) GC osoitti IGF1 R: HER3- koaktivaatio. Kuitenkin HER2 (-) GC, prosenttiosuus IGF1 R koaktivaatio kanssa HER3- (in 51/384 näytteet tai 13,8%) oli samanlainen IGF1 R koaktivaatio kanssa HER1 (in 53/384 näytteet tai 13,3%). IGF1 R: HER2 koaktivaatio (in 45/384 näytteet tai 11,7%) ja sen jälkeen perässä. Kaiken 34/434 GC näytteet osoittivat koaktivaatio kaikkien jäsenten HER-kinaasin akselille IGF1 R joista 28 näytteitä myös osoittanut cMET koaktivaatio. Kuitenkin cMET oli harvoin yhteistyössä aktivoitu IGF1 R puuttuessa HER kinaasireseptoriakti- jäsen koaktivaatio. Lisäksi c-MET: IGF1 R coactivations olivat pääasiassa havaittu HER2 (-) GC.

GC näytteet hierarkkisesti ryhmittyneet perustuu niiden desiili perustuva merkki aktivointi profiileja (kuvio 2B). Analyysi osoitti, että cMET: HER1, HER2: HER3 ja IGF1 R: PI3K aktivointi kuvioita läheisesti korreloi cMET: HER1 klusteri muodostaa erilliset osajoukko.

• PLoS ONE: n ilmentyminen AFP ja STAT3 osallistuu Arseenitrioksidi indusoiman apoptoosin ja Kasvun inhibitio in AFP-tuottaminen mahasyövän Cells
• PLoS ONE: Functional Promoottori -308G > muunnos, tuumorinekroositekijä a Gene liittyy riski ja eteneminen mahasyövän kiinalainen Population