PLOS ONE: Identificação da HSA-miR-335 como uma assinatura prognóstico em gástrica Cancer

Abstract

Fundo

O câncer gástrico (GC) é um dos malignidade mais comum e causa primária da morte em pacientes com câncer chineses. A recorrência é um importante fator que leva à falha do tratamento e baixo nível de taxa de sobrevida de 5 anos em pacientes GC após ressecção cirúrgica. Portanto, a identificação de biomarcadores com potencial em predizer o risco de recorrência é o principal problema do prognóstico em pacientes GC.

Pacientes e Métodos

Foram selecionados um total de 74 pacientes GC para análise sistemática, que consiste de 31 pacientes com recidiva e 43 pacientes sem recorrência. Em primeiro lugar, os métodos de miRNAs microarray e bioinformática foram utilizados para caracterizar diferenciais miRNAs expressos de amostras de tumores primários. A seguir, usamos um método ROC para selecionar assinatura com melhor sensibilidade e especificidade. Por fim, validada a assinatura em amostras de GC (amostras frescas e congeladas de sangue) usando PCR quantitativo.

Resultados

Nós identificamos 12 miRNAs diferenciais, incluindo 7 5 miRNAs regulada para baixo-regulado e no grupo recorrência. Usando o método ROC, nós ainda mais apurado hsa-miR-335 como uma assinatura para reconhecer casos de recorrência e de não-retorno nas amostras de treinamento. Além disso, validado esta assinatura utilizando o método de PCR quantitativo em 64 amostras de teste com resultado consistente com o conjunto de treinamento. A recorrência de alta frequência e baixa sobrevida foram observados em casos de GC com alto nível de hsa-miR-335 ( P Art < 0,001). Além disso, avaliou-se que HSA-miR-335 foram envolvidos na regulação de genes alvo em vários sinais-vias oncogénicos, tais como p53, MAPK, TGF-β, Wnt, erbB, mTOR, Toll-like receptor e de adesão focal.

Conclusão

os nossos resultados indicam que a HSA-miR-335 tem o potencial de reconhecer o risco de recorrência e se relacionam com o prognóstico dos pacientes GC

Citation:. Yan Z, Xiong Y, W Xu, Gao J, Cheng Y, Z Wang, et al. (2012) Identificação de hsa-miR-335 como uma assinatura prognóstico no câncer gástrico. PLoS ONE 7 (7): e40037. doi: 10.1371 /journal.pone.0040037

editor: Alfons Navarro, da Universidade de Barcelona, ​​Espanha |

Recebido: 21 de fevereiro de 2012; Aceito: 30 de maio de 2012; Publicação: 03 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Yan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Atualmente, a cirurgia ainda é a principal opção para o tratamento câncer gástrico (GC), no entanto, mesmo após a realização de ressecção curativa, aproximadamente 40-65% dos pacientes GC vai experimentar uma recorrência da doença, possivelmente abrangendo recorrência local, disseminação peritoneal ou metástase hematogênica [1], [2]. Por esta razão, a taxa de sobrevida em 5 anos dos pacientes GC ainda estava em um nível baixo. Um grande desafio para melhorar os resultados clínicos é entender melhor os mecanismos moleculares e reconhecer assinaturas robustos para o prognóstico da GC.

Vários fatores de risco, incluindo o estado serosa patológico, status da margem, mudanças de densidade de microvasos de tumores e de expressão de genes relacionados com recorrência foram relatados [3], [4]. Além disso, alguns métodos de previsão ou diagnóstico têm sido usados ​​para avaliar o risco de recorrência com base no perfil de expressão do gene ou um conjunto de variáveis ​​clínicas [5] - [8]. No entanto, estas observações múltiplas, incluindo várias alterações no gene ou proteína podem dificultar a sua aplicação clínica. marcadores moleculares confiáveis ​​e convenientes para os profissionais clínicos são necessários para o prognóstico em GC.

Um recém-descoberto de miRNAs são altamente conservadas nos genomas de invertebrados, vertebrados e plantas. Eles servem funções críticas em vários processos biológicos [9] incluindo o tempo de desenvolvimento, padronização e embriogênese, diferenciação, organogênese, e apoptose [10]. Dadas as suas múltiplas funções biológicas essenciais, não é de estranhar que a expressão miRNAs anormais vai levar a doenças e até mesmo câncer [11].

miRNAs têm sido apresentados como potenciais biomarcadores eficazes para rastrear a origem dos tecidos em tumores malignos de origem primária desconhecida [12]; perfis miRNAs expressão são capazes de refletir a linhagem desenvolvimento e estado diferenciado dos tumores [11]. análise sistemática sobre a estabilidade dos miRNAs, bem como condições otimizadas para análise de expressão utilizando amostras embebidos em parafina e sangue fixados em formol foram relatados anteriormente [13] - [15], lançando luz sobre o seu potencial de diagnóstico inesperado. Há um número limitado de miARNs [16] no genoma humano que são conhecidas por regular a cerca de 30% dos genes [17]. Estes atributos de miRNAs pode nos fornecer um método simples para prever o risco de recorrência para pacientes com câncer.

Neste estudo, identificamos um miRNA (HSA-miR-335), que tem potencial para prever o risco de recorrência de GC baseado em microarray e os dados clínicos de uma amostra de tamanho pequeno em pacientes GC chineses. Nossos resultados mostraram que hsa-miR-335 pode ser ato como uma assinatura prognóstico clínico para GC.

Métodos

amostras clínicas

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Wuhan Hospital Geral de Guangzhou Comando, PLA. Todos os pacientes de câncer gástrico e pacientes não-cancerosas com doenças digestivas forneceram consentimento informado em nosso estudo.

Os pacientes submetidos à gastrectomia para CG potencialmente curável no hospital geral do comando militar Guangzhou Wuhan foram sujeitos deste estudo. A elegibilidade para a inclusão neste estudo incluiu confirmado histologicamente adenocarcinoma da junção estômago ou gastroesofágico. Todos os pacientes tinham recebido ressecções completas, incluindo uma tentativa de remoção completa do tumor com inclusão de margens negativas de largura e linfadenectomia retroperitoneal estendida (tipo D2). Informações sobre clínico-patológico, terapêutico, e parâmetros de resultados de pacientes a partir de maio de 2005 a fevereiro 2012 foram coletados retrospectivamente. estadiamento do câncer foi realizada de acordo com a quinta edição do American Joint Commission on Cancer critérios TNM.

A recorrência foi definida como qualquer recorrência do câncer, incluindo linfonodo, estômago remanescente, local, peritoneal e metástases hematogênicas. Todos os pacientes que apresentaram recorrência de câncer foram diagnosticados clinicamente ou radiologicamente, e confirmado por biópsia através de endoscópio gastrointestinal superior ou punção percutânea. O padrão radiográfico para o diagnóstico de recorrência incluiu tomografia computadorizada ou ressonância magnética dos scans tórax, abdômen, pelve, cabeça e osso, ou outros testes de diagnóstico que foram utilizados apenas em circunstâncias especiais. Todas as amostras foram obtidas a partir de amostras cirúrgicas de pacientes com adenocarcinoma gástrico e todos os pacientes deram consentimento escrito para o uso desses tecidos para fins de investigação. Nós selecionamos amostras (incluindo amostras frescas e congeladas de sangue) de 74 pacientes com e sem recorrência GC.

miRNA Microarray

A análise microarray miRNA foi realizada como descrito em detalhes no site da CapitalBio ( http://www.capitalbio.com) e também de acordo com o procedimento de Hua [18]. Resumidamente, 50-100 ug de ARN total foi usada para extrair miARNs utilizando um kit de isolamento de miARN AM1560 (Ambion, EUA). miARNs marcado com fluoresceína foram usadas para hibridação em Affymetrix miARN chip contendo 1075 sondas. O sinal de fluorescência foram digitalizados por GeneChip Scanner 3000 7G (Affymetrix, EUA). Os dados brutos foram normalizados e analisados ​​em GeneChip Command Console 1.1 software (Affymetrix, EUA).

Extração de RNA a partir Congelado Fresco e amostras de sangue

RNA foi extraído de tecidos GC frescos congelados usando uma Trizol padrão Protocolo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Para amostras de sangue, miARN foram extraídos utilizando o estojo miRNease (Qiagen). Em resumo, a 700 ul de reagente QIAzol foi adicionada a 200 ul de amostra de plasma e incubou-se durante 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, 140 ul de clorofórmio foi adicionada, agitada em vórtice durante 15 seg e incubou-se durante 3 minutos à temperatura ambiente. Isto foi seguido por uma centrifugação de 14.000 rpm a 4 ° C durante 15 min. A fase superior, aquosa foi removida e 1,5 vezes o seu volume adicionado em 100% de etanol. Cada 700 ul de mistura foram colocados numa coluna e centrifugou-se a 13.000 rpm, à temperatura ambiente durante 15 seg. A seguir, 500 ul de tampão de RPL foi adicionado à coluna e foi centrifugado a 13.000 rpm a temperatura ambiente durante 2 min. A coluna foi em seguida centrifugada a 13.000 rpm, à temperatura ambiente para secá-la. O seguinte foi o passo de eluição com 20 ul de água isenta de nuclease. O RNA eluído foi armazenado a -70 ° C.

Real-time PCR quantitativa

sequências de miRNA maduro foram adquiridos a partir da base de dados Sanger Institute miRBase Sequence (http://microrna.sanger.ac .uk /sequências /). transcrição reversa (RT) iniciadores de haste-laçada foram concebidos de acordo com Chen [19]. As condições de reacção de RT utilizado envolvidas incubações a 16 ° C durante 30 min; 37 ° C durante 30 minutos e depois 72 ° C durante 10 min. O protocolo de ciclos térmicos para a PCR envolvido um passo de desnaturação inicial a 95 ° C durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 30 s, 57 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 30 s. As curvas de fusão para cada PCR foram cuidadosamente analisados ​​para determinar qualquer amplificação não específica. A expressão de cada miRNA foi calculada usando a ^{-ΔΔ C
_{fórmula 2 T e normalizadas para expressão U6 snRNA [20].}}

Unsupervised Algoritmo

SAM [21] foi usado para realizar o cálculo de agrupamento sem supervisão. O ponto de corte para significância foi determinada por um delta parâmetro de ajuste, escolhido pelo usuário com base na taxa de falso positivo e representado pelo valor q. Nós escolhemos uma mudança vezes maior do que 2, e q = 0 como os critérios de selecção para a expressão diferencial de miRNAs.

ROC e Kaplan-Meier Sobrevivência análise da curva
foi conduzido

análise da curva ROC usando os pacotes de software MedCalc (verison 8.2.1.0; Mariakerke, Bélgica). As curvas de AUC fornecida uma medida do desempenho global de um teste de diagnóstico. A relação entre as intensidades de sinal de miARN e valor de Ct de cada miARN foram usadas para o cálculo ROC em amostras. Survival análises também foram realizadas pelo pacote de software MedCalc.

Análise Estatística

Os dados clínicos foram analisados ​​utilizando o teste do qui-quadrado. A curva de sobrevida cumulativa foi comparadas pelo teste de log-rank. Para todas as análises, a diferença com o P
. ≪ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

miRNA alvejado Previsão Gene e Análise de Sinais Caminho

Nós utilizamos uma base de dados de previsão gene alvo miRNA TargetScan (http://www.targetscan.org) para selecionar alvos plausíveis dos miRNAs diferenciais expressa. Um gene de banco de dados ontologia sistema de anotação molecular integrado (MAS3.0, http://www.capitalbio.com) foi utilizada para investigar os genes miRNA-alvo e seu envolvimento em várias vias de sinalização.

Resultados

Características clínicas de GC pacientes

Um total de 74 pacientes com /sem recorrência foram selecionados para análise sistemática. 31 pacientes tinham recorrentes GC, que foi comprovada patologicamente por biópsia nos locais de anastomose, através de endoscopia. 43 pacientes sem recidiva foram selecionados como grupo de controlo com fósforos em sexo, idade no momento do diagnóstico, estadiamento TNM, o tratamento eo número de linfonodo envolvido (Tabela 1).

Não houve diferença significativa no sexo ( P
= 0,469), idade ( P
= 0,502), localização do tumor ( P
= 0,299), Diferenciação ( P
= 0,511) , Linfonodo ressecção ( P
= 0,217) e Situação da quimioterapia adjuvante ( P
= 0,214). Houve diferença significativa na fase UICC ( P
= 0,108) e razão de sobrevivência /morte observou (23/8 em recorrência grupo vs. 34/9 no grupo não-retorno, P <
; 0,001), com tempo de sobrevida mediana de 18,9 meses em reincidência versus 43,9 meses no grupo sem recorrência respectivamente ( P
. < 0,001) (Tabela 1)

miRNA Expressão perfis associados com GC recorrência

Foi utilizado um chip miRNAs microarray para medir os níveis de expressão de miRNAs em 10 amostras de GC com /sem recorrência (5/5) como conjunto de treinamento. Ao comparar a expressão de miARN entre os grupos, 7 regulada para cima e para baixo 5 miARNs-regulados foram encontrados que foram estatisticamente significativa no grupo GC recorrente (Tabela 2). Estes 12 miRNAs poderia ser usado para discriminar entre GC com e sem recorrência com base em uma análise de agrupamento hierárquico (Figura 1).

hsa-miR-335 é a melhor assinatura para classificar GC com e sem recorrência no Conjunto de Treinamento

Utilizamos o método ROC para analisar a sensibilidade e especificidade dos biomarcadores candidatos com base em dados de microarrays miRNA. Obtivemos 2 miRNAs hsa-miR-335 e miR-HSA-128B com melhor sensibilidade e especificidade na classificação das amostras de GC com e sem recorrência (Figura 2, Tabela 3). Combinado com o valor FC (FC _{hsa-miR-335 = 4.675; FC hsa-miR-128b = 1.453) de cada biomarcador, selecionamos hsa-miR-335 para um estudo mais aprofundado}

a validação da assinatura em amostras de teste por PCR em tempo real

o nível de HSA-miR-335 de expressão foi detectada por PCR em tempo real em 64 amostras de ensaio de GC em comparação com o tecido adjacente combinados como controlo. Os resultados mostraram que em 26 casos com recorrência, 21 casos (21/26, 80,8%) eram de alta expresso de hsa-miR-335; e em 38 casos sem recorrência, 29 casos (29/38, 76,3%) eram de baixa expresso de hsa-miR-335 (Figura 3). Os mesmos resultados foram observados em amostras de sangue através de uma amostra de sangue mista de 20 pacientes não-cancerosas com doenças digestivas como controle: Em 26 casos com recorrência, 19 casos (19/26, 73,1%) eram de alta expresso de hsa-miR -335; e em 38 casos sem recorrência, 30 casos (30/38, 78,9%) eram de baixa expresso de hsa-miR-335 (Figura 3). Houve 11 casos (11/64, 17,2%) não correspondidas no nível de expressão de HSA-miR-335 em comparação dos resultados entre as amostras frescas e congeladas de sangue.

Além disso, detectamos o nível de expressão de HSA-miR-128b em 64 amostras de sangue GC usando PCR em tempo real. Os resultados mostraram que em 26 casos com recorrência, 18 casos (18/26, 69,2%) eram de alta expresso de hsa-miR-128b; e em 38 casos sem recorrência, 27 casos (27/38, 71,1%) eram de baixa expresso de hsa-miR-128b. O valor de FC, da HSA-miR-128b e de HSA-miR-335 foram 1,647 e 3,589, quando recorrência em comparação com amostras não-retorno, respectivamente (Figura 4A). Também foi avaliada a sensibilidade e especificidade do conjugado de HSA-miR-335, HSA-miR-128b e de HSA-miR-335 /128b (combinado com miR-335 e miR-128b como uma assinatura) com base nos dados de PCR em tempo real. Os resultados mostraram que a HSA-miR-335 foi mais sensível e específica com um valor de AUC de 0,88 de HSA-miR-128b (AUC = 0,79) e HSA-miR-335 /128b (AUC = 0,84) na classificação de recorrência e não- amostras de recorrência (Figura 4B, Tabela 3).

hsa-miR-335 como uma assinatura progressão da doença para prever o risco de recorrência em pacientes GC

Os 74 pacientes do GC foram divididos em dois grupos, incluindo 31 pacientes com recorrência como um grupo e 43 pacientes sem recorrência como um grupo. Os pacientes que apresentaram uma recorrência do GC tiveram uma taxa de sobrevivência média significativamente reduzida ( P Art < 0,001; Figura 5A). Nós detectados os níveis de HSA-miR-335 de expressão em todas as amostras de GC 74. Uma diferença significativa observada foi em dois grupos que representam alta expresso de HSA-miR-335 e grupo de baixa expresso de grupo HSA-miR-335 como se segue: o miR-335 (+) e miR-375 (-). pacientes do GC (n = 35) com o miR-335 (+) tinha reduzido significativamente a sobrevida média em comparação com aqueles (n = 39) com o miR-375 (-) ( P Art < 0,001; Figura 5B).

via de sinalização e Ontologia Gene Análises de hsa-miR-335 genes alvo

a fim de investigar os possíveis mecanismos de regulação do HSA-miR-335 no processo de recorrência GC, utilizamos um banco de dados de bioinformática para selecionar alvos plausíveis desse miRNA. Um total de 255 genes foram previstos como os genes alvo do conjugado de HSA-miR-335. Via de sinalização análises mostraram que a maioria dos genes alvo que foram regulados pela HSA-miR-335 foram envolvidos nas mesmas vias, tais como p53, MAPK, TGF-β, Wnt, erbB, mTOR, receptor de tipo Toll, adesão focal ( tabela 4, Figura 6). Propusemos que essas alterações de vias múltiplas podem estar envolvidos em características patológicas clínicos e os resultados da GC dos pacientes. Enquanto isso, foi utilizado um banco de dados ontologia gene integrado para anotar a função molecular dos genes miRNA-alvo. Os resultados mostraram que os genes regulados por hsa-miR-335 participou na maior parte do processo biológico importante associado com câncer humano (Tabela 5).

Discussão

A recorrência é frequente em pacientes GC após a cirurgia; portanto, é importante para identificar casos com elevado risco de recorrência. fatores patológicos clínica tradicional são por vezes inadequados para a previsão de recorrência em indivíduos e vários grupos de pesquisa têm tentado identificar biomarcadores usando novas tecnologias que possam distinguir estes casos de alto risco. Uma série de estudos recentes documentaram alterações de miARN que estão envolvidos na iniciação e progressão de cancros humanos. expressão miRNA perfil de tumores humanos identificaram assinaturas de expressão associados com diagnóstico, estadiamento, progressão, prognóstico e resposta ao tratamento.

Neste estudo, foram analisados ​​casos GC primária, a fim de prever a recorrência da doença e definida não recorrente casos que os livre de GC durante pelo menos um ano após a ressecção curativa. Identificamos hsa-miR-335 como uma assinatura prognóstico plausível de GC com base nos dados de microarranjos de 10 amostras de GC como conjunto de treinamento. Além disso, esta assinatura que validou em 64 amostras de ensaio com mais do que uma média de 85% de sensibilidade e especificidade. A sobrevivência analisa resultados mostraram que os pacientes com níveis de expressão elevados de HSA-miR-335 tinha reduzido a taxa de sobrevida global em comparação com aqueles com baixos níveis de expressão de HSA-miR-335. Estes resultados indicam que esta assinatura tinha o potencial para prever a recorrência de GC.

A tecnologia Microarray desenvolveu-se significativamente e tornar-se um método abrangente e útil para nos ajudar a melhor compreender cânceres [22]. É agora amplamente utilizado para estudar o papel funcional de miARNs em muitos tipos de cancro [23], com vários efeitos significativos de miARN sobre oncogenes e genes supressores de tumor identificados. Dos 12 miARNs identificados neste estudo, HSA-miR-373 foi uma das miARNs regulada de deslocamento do grupo recorrente. Este pode ser um oncogene funcionando através da via do p53 bem conhecido que está envolvido na carcinogénese [24]. Alguns miRNAs, como HSA-miR-19a e hsa-miR-32, estão localizados em regiões genômicas associadas a cancro, que podem estar envolvidos em doenças malignas através da exclusão, amplificação, ou mecanismos de modificação epigenética [25]. Além disso, HSA-miR-429 foram regulados positivamente em casos recorrentes e agrupados no cromossoma 1, confirmando que alguns miARNs tais como HSA-miR-200b estão agrupados com HSA-miR-429 e capaz de co-regular os seus genes alvo [26 ].

até agora, o miRNA designado neste estudo de predizer o risco de recorrência GC não foram bem caracterizados. HSA-miR-335, que é transcrito a partir do cromossoma 7q32.2 região genómica, tem sido relatada a diferenciais expressos em tumores malignos e benignos [27]. É importante notar que também é demonstrado que o miR-335 regula a proliferação celular Rb1 e os controlos em uma maneira dependente da p53 [28]; participa no desenvolvimento de cancro da mama [29]; regula o crescimento e invasão de células malignas [30]. A última pesquisa relata que miR-335 pode funcionar como um supressor de metástase em GC, visando Bcl-2 e SP1, e poderia continuar a ser desenvolvido como um potencial fator prognóstico [31]. Para resumir os pontos de vista acima, a função de miR-335 foi controversa. Os nossos resultados mostram que HSA-miR-335 foi regulada em amostras de GC de recorrência e envolvido na maioria das vias de sinalização oncogénicos, tais como p53, MAPK, TGF-β, Wnt, erbB, mTOR, receptor de tipo Toll, adesão focal . Estas múltiplas alterações da via de sinal, especialmente incluindo a via p53, pode razoavelmente afetar o resultado clínico incluindo o risco de recorrência GC [32]. Embora o papel prognóstico do HSA-miR-335 no câncer gástrico é desconhecido, os nossos resultados são encorajadores.

O sangue é a amostra mais acessíveis nos hospitais. O significado clínico da identificação de biomarcadores que poderia ser fácil detectados apenas como HSA-miR-335 é obviamente. Além disso, os espécimes embebidos em parafina e arquivadas são também um dos materiais prontamente disponíveis em hospitais, que são muitas vezes mantidos com dados clinicopatológicas bem documentados. Eles representam excelentes fontes para a aplicação de prognóstico tanto na pesquisa básica e estudos clínicos. miARNs variam em tamanho de 19-25 nt e eles são protegidos por o complexo de silenciamento induzido por ARN, o que pode torná-los menos susceptíveis de degradação de ARN em comparação com o ARNm nestes tecidos [33]. Assim, fomos capazes de detectar a expressão miRNA em amostras embebidos em parafina e focado na análise sistemática utilizando esta assinatura de valor prognóstico relevante. O método de classificação baseado em PCR, portanto, aparece para nos fornecer uma maneira, usando amostras clínicas facilmente disponíveis, para prever a recorrência da doença.

Em resumo, nós identificamos um miRNA relacionado com o prognóstico que pode prever o risco de recorrência de pacientes CG. Combinando esta assinatura com fatores clínico-patológicas convencionais, deveríamos ser capazes de prever a evolução da doença de um paciente com mais precisão. Além disso, a identificação de pacientes de alto risco levaria à consideração de intervenção terapêutica adicional e assim poderá informar o médico de um melhor programa de acompanhamento.

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Li Wang (Instituto Nacional de Ciências de Saúde ambiental, EUA) para comentários visão e edição do manuscrito.

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