PLOS Genetics: nedärvda mutationer i MAP3K6 är associerade med Familial Gastric Cancer

Abstrakt

Gastric cancer är bland de främsta orsakerna till cancerrelaterade dödsfall i världen. Även om ärftliga former av magcancer är relativt sällsynta, identifiera de gener som är ansvariga för sådana fall kan informera diagnos och behandling för både ärftliga och sporadiska fall av magsäckscancer. Mutationer i E-cadherin-genen, CDH1
, står för 40% av den vanligaste formen av familjär magcancer (FGC), ärftlig diffus magcancer (HDGC). De gener som är ansvariga för de återstående former av omskärelse är för närvarande okända. Här har vi undersökt en stor familj från Maritime Kanada med FGC utan CDH1
mutationer, och identifierat en könsceller kodande variant (p.P946L) i mitogenaktiverat proteinkinas-kinaskinas 6 ( MAP3K6
) . Baserat på bevarande, förutspådde patogenicitet och en känd roll av genen i cancer anlag var MAP3K6
vara en stark kandidat och undersöktes ytterligare. Screening av ytterligare 115 obesläktade individer med icke CDH1
FGC identifierade p.P946L MAP3K6
variant, samt fyra ytterligare kodnings varianter i MAP3K6
(sid. F849Sfs * 142, p.P958T, p.D200Y och p.V207G). En somatisk andra drabbade variant (p.H506Y) var närvarande i DNA erhållet från en av de tumörprover, och bevis på DNA hypermethylation i MAP3K6
genen observerades i DNA från tumören av en annan drabbade individen. Dessa fynd, tillsammans med tidigare bevis från musmodeller som MAP3K6
fungerar som en tumörsuppressor och studier som visar förekomsten av somatiska mutationer i MAP3K6
i icke-ärftliga gastric cancer och magcancer cell linjer, pekar mot MAP3K6
varianter som en predisponerande faktor för FGC.

Författare Sammanfattning

Den underliggande genetiska mutationer som är inblandade i 60% av ärvda fall magcancer fortfarande okända. Här presenterar vi en stor, utökad stamtavla med familjär magcancer och en förening i en del av familjen med en mutation i MAP3K6
. Bevarande, förutspådde patogenicitet av varianten, vävnadsdistribution och känd funktion av MAP3K6
gjort detta till en stark kandidat som motiverade ytterligare utredning. Undersökning av ytterligare 115 obesläktade probander identifierat ytterligare mutationer i MAP3K6
, inklusive en trunke mutation

Citation. Gaston D, Hansford S, Oliveira C, Nightingale M, Pinheiro H, MacGillivray C, et al. (2014) nedärvda mutationer i MAP3K6
är associerade med Familial Gastric Cancer. PLoS Genet 10 (10): e1004669. doi: 10.1371 /journal.pgen.1004669

Redaktör: Marshall S. Horwitz, University of Washington, USA

Mottagna: 3 mars 2014. Accepteras: 14 augusti 2014. Publicerad: 23 october 2014

Copyright: © 2014 Gaston et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Följande organ finansierat projektet: Genome Canada, Genome Atlanten, Nova Scotia Health Research Foundation, Nova Scotia forskning och innovation Trust, Dalhousie Medicinska fakulteten, Dalhousie Ögonkliniken, Health Canada, Centrum för läkemedelsforskning och utveckling, Capital District Health myndighet, IWK Health Centre Foundation, Capital Health Research Fund, och The BEHÖRIGHETS /FEDER portugisiska Stiftelsen för vetenskap och teknik (FCT), projekt Ref. FCT PTDC /SAU-GMG /110785/2009 och Post-doc stipendium SFRH /BPD /79499/2011 HP "financiados ingen Ambito do Prog Operacional Temático factores de Competitividade (av konkurrens) e comparticipado pelo fundo Comunitario Europeu Feder." MES stöds av CHU Ste-Justine Centre de Recherche. Författarna vill tacka för bidrag: Genome Quebec hög genomströmning sekvensering plattform; och Sónia Sousa och José Carlos Machado från IPATIMUP Diagnosenheten, Porto, Portugal. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer är den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i hela världen med 738,000 dödsfall per år [1]. Primär behandling består av kirurgisk resektion av tumören och kan följas av kemoterapi och /eller strålbehandling. 5-årsöverlevnaden efter kirurgisk resektion är höga om sjukdomen upptäcks tidigt (71% för steg 1A), men släpper de ut snabbt när diagnosen ställs i senare skeden (46% steg III A, 20% steg III, 4% stadium IV) (National Cancer Institute siare databas, oktober 2013). Tyvärr, eftersom tidiga symtom på magcancer liknar andra sjukdomar, upptäckt ofta inte förrän avancerade stadier har redan uppnåtts [2]

Klassiskt har magcancer delats in i två typer:. Intestinal och diffus [ ,,,0],3]. Tarm form uppstår spontant och är vanligare hos äldre personer, medan den diffusa formen förekommer ofta hos yngre individer och kan vara förenad med en familjehistoria av magcancer. Populationer med högre prevalens av kronisk Helicobacter pylori
infektion tenderar att ha högre magcancer bördor [4]. Majoriteten av magcancer (90%) är sporadisk, men cirka 10% visar familjär klustring [5]. Endast 1% till 3% orsakas av en ärftlig syndrom, i motsats till miljöfaktorer som delade kostvanor [5]. Den mest väletablerade familjär form av magcancer är ärftlig diffus magcancer (HDGC [MIM ​​137.215]), där cirka 40% av fallen tillskrivs nedärvda mutationer i E-cadherin gen som kodar för, CDH1
[6 ] - [9].

Vi konstaterade en stor familj från Maritime Kanada med en historia av Familial ventrikelcancer (FGC) visar en uppenbar autosomalt dominant arv, men med några varianter i den kodande regionen av CDH1
genen. Medan familjen uppvisar många funktioner som är typiska för HDGC fanns mångfald i den kliniska presentationen inom familjen samt en hög ålder för debut, därför har vi valt att helt enkelt hänvisa till villkoret FGC över mer strikt definierade HDGC. Genomisk kartläggning av gemensamma ärvda regioner bland de drabbade familjemedlemmar, följt av hel-exome sekvensering ledde till identifieringen av en könsceller single nucleotide variant (SNV) i mitogenaktiverat proteinkinas-kinaskinas 6 ( MAP3K6
ASK2
, MAPKKK6
, MEKK6
, ENSG00000142733), en gen som kodar för en medlem av serin /treonin-proteinkinas familj. Flera in silico
metoder förutspådde SNV i MAP3K6 vara skadligt för proteinet, och tidigare studier med MAP3K6
brist möss [10], liksom förekomsten av mutationer i denna gen i både primära gastriska cancertumörer och magsäckscancer cellinjer [11], överensstämde med mutationer i MAP3K6
gen som den orsakande mutationen. Sekvensering av DNA som isolerats direkt från en fast tumör exemplar av en individ påvisat en de novo
andra drabbade varianten i MAP3K6
. Screening av ytterligare 115 obesläktade FGC prover, även negativ för CDH1
mutationer avslöjade fem personer med ytterligare fyra SNVs i MAP3K6
som också förväntas vara patogena, samt en obesläktad individ med SNV identifierats i familjen från Maritime Kanada. Åldern på debut varierade mellan MAP3K6
SNV bärare i fem familjer, och man inte hade utvecklat cancer även vid sent skede av livet, vilket tyder på ofullständig penetrans. Detta är den första rapporten av en ärftlig cancer till följd av SNVs i MAP3K6
.

Resultat

klinisk och patologisk bedömning

Vi konstaterade en stor sjöfarts kanadensisk familj av europeisk härkomst i samband med rutinmässig klinisk bedömning i ärftlig cancer kliniken som en del av Maritime medicinsk genetik service på IWK Health Centre i Halifax, Nova Scotia, Kanada (Figur 1). Saliv, blod, eller formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) prover erhölls från 6 familjemedlemmar med magcancer, såväl som 27 ej angripna släktingar och en gift-in individ. Ingen blodsband misstänktes i denna stamtavla.

proband, drabbade individen 1884, fick diagnosen med metastaserad magsäckscancer och genomgick en total gastrektomi på ålder 51. Patologisk undersökning visade en dåligt differentierad adenokarcinom som uppstår i antrum i magen i en bakgrund av intestinal metaplasi och kronisk gastrit. Tumören bestod av ett ark av klackring celler (Figur 2C och D). Karcinomet trängt igenom hela tjockleken av muscularis propria som involverar den serosala skikt. Inga tecken på H. pylori
sågs.

proband s moster, individ 1826, fick diagnosen magcancer vid 80 års ålder och genomgick en partiell gastrektomi. Patologisk undersökning visade en måttligt till dåligt differentierade adenocarcinom invaderar i muscularis propria (Figur 2A). Tumören var större delen består av sammanhängande bon av neoplastiska celler med enstaka körtelbildning. Tumörceller med signetring cellformer sågs i fasta områden (Figur 2B). Magslemhinnan intill tumören visade fokal intestinal metaplasi utan tecken på H. pylori
.

På ålder 76 magen biopsi av en annan moster till proband individuell 1841, rapporterades ha en måttligt differentierad adenokarcinom med körtelbildning. H. pylori
identifierades i bakgrunden magslemhinnan. En liten biopsi avsnittet var tillgängliga för omprövning. Även detta prov var för liten för en fullständig klassificering, visade det sammanhängande bon av neoplastiska celler med små härdar av körtelbildning i linje med en dåligt differentierad adenokarcinom. Det fanns vissa tumörceller i provet visar klara cytoplasman, men dessa kan inte slutgiltigt klassificeras som signetring celler.

En magen biopsi på ålder 82 av patientens 1844, det proband mor, visade en dåligt differentierad adenokarcinom med signetring funktioner. Bakgrunden slemhinna visade tecken på H. pylori Köpa och ojämn intestinal metaplasi.

Patient 1845, en första kusin-gång bort till proband, fick diagnosen vid en ålder av 59 med en odifferentierad carcinoma utan klackring funktioner. Tumören var associerad med tät lymfoida infiltrat och var bäst klassificeras som lymphoepithelial carcinoma. H. pylori
sågs inte i den intilliggande normal slemhinna. Tumören var positivt för två intron varianter i CDH1
vilka båda förväntas vara godartad (NM_004360.3: c.688-83G > A och c.2439 + 52G > A) katalog <. p> Patient 2447, en tredje kusin, fick diagnosen vid 44 års ålder med en dåligt differentierad adenokarcinom utan signetring cellfunktioner. Den intilliggande magslemhinnan visade omfattande intestinal metaplasi. Det fanns inga tecken på H. pylori
.

Efter screening av en panel av 115 probander med icke- CDH1
familjär magcancer, var en obesläktad familj från Portugal läggas till vår studie (figur 3A). Individuella II-6 fick diagnosen magcancer vid 62 års ålder, har dåligt differentierad adenokarcinom i magen och närvaron av signetring celler. Immunohistokemi analys visade positiv membranös färgning av E-cadherin i neoplastiska celler (Figur 3C), inklusive klackring-celler (figur 3B). De relaterade individer I-4, II-1, och II-7 diagnostiserades med magcancer (histologi detaljer okända) vid åldrarna 53, 62 och 52 respektive. Alla fyra personer i den portugisiska stamtavla dött av sjukdomen inom 5 år efter diagnos i denna familj. I Maritime kanadensisk familj, 1884, 1844 och 1841 dog av sjukdomen inom ett år efter diagnos.

magcancer beskrivs för patienter 1845 och 2447 hade ingen fingerringar observeras och fick diagnosen vid en tidigare medelålder ( 52 mot 72, trots att proband fick diagnosen vid 51 års ålder). Baserat på skillnader i histologi, särskilt bristen på signetring celler i 1845 och 2447 jämfört med de andra berörda personer, är det möjligt att sjukdomen i dessa två individer utgör en distinkt tillstånd. Alternativt är det möjligt att familjen visar ett mer komplext fenotypisk mönster drivs av två (eller fler) gener.

Molecular Kartläggning och Uteslutning av kända och kandidatgener

Trots att 30-40% av HDGC fall kan tillskrivas mutationer i CDH1
, inga mutationer i proteinkodande exoner av CDH1
hittades i drabbade individer från sjöfarts~~POS=TRUNC kanadensisk familj. För att identifiera den patogena loci i denna familj, hög densitet SNP-genotypning med hjälp av Illumina arrayer utförs på fem drabbade individer: den prob mor (1844), två drabbade moderns mostrar (1826 och 1841), och två avlägsna kusiner (1845 och 2447) liksom flera besläktade individer utan rapporterade förekomsten av cancer vars tillgivenhet status behandlades som okända (1907, 1924, 1821, och 1822). För alla personer utom 1845 genotypning uppgifter var tillgängliga på 2,5 miljoner markörer. Individuella 1845 hade tidigare genotypas vid en densitet av 660K, och var inte i stånd att åter genotypas vid den högre densiteten. Inget DNA lämplig för SNP-genotypning erhölls från FFPE prov av probanden (1884). Med hjälp av dessa uppgifter, utförde vi både icke-parametrisk och parametrisk kopplingsanalys med användning av Merlin [12]. Med tanke på den sena debutåldern i många drabbade familjemedlemmar, är penetrans i sjöfarts stamtavla okänd. För att vara konservativ i att identifiera genomiska regioner av intresse, två dominerande penetrans modeller (50% och 99% penetrans) med drabbade personer 1826, 1841, 1844 och 2447 (och privatpersoner 1907, 1924, 1821, och 1822 med okänd tillgivenhet status ) var använda. Genomregioner som identifieras under parametrisk kopplingsanalys var i allmänhet i linje med varandra oberoende av penetrans parametern väljs (tabell 1). Analysen upprepades med individuell 2447 behandlas som okända att analysera bara reducerade stamtavlan där 2447 och 1845 behandlades som potentiella phenocopies (tabell 2). Detta resulterade i lägre totala LOD-värden för samtliga regioner som identifierats, samt fler och större regioner i genomsnitt, som omfattar en större del av genomet.

Vi utförde också icke-parametrisk bindning (NPL), en metod med färre underliggande antaganden om den underliggande arvsmodellen, med drabbade personer 1826, 1841, 1844, och 2447 (stamtavla omfattande) eller med avlägsnande av 2447 som en potentiell phenocopy genom att ange att de är av okänd status (sub-stamtavla). Stamtavla omfattande iska intervaller var mestadels i linje med dem som identifierats med hjälp av de två parametriska modeller (tabell 3). Uteslutande av 2447 resulterade i en lägre total maximal poäng (1.204), vilket konstaterades på flera intervall under genomet (tabell 3).

Iska intervall identifierats på detta sätt användes för att filtrera exome sekvensdata för att identifiera potentiella orsakande mutationer. För att vara bred för att identifiera möjliga orsaks mutationer, både i stamtavlan omfattande och under stamtavla fall intervallen från respektive parametriska och icke-parametriska analyser kombinerades. För omfattande stamtavla analyserar detta var föreningen av intervall som anges i tabell 1 tillsammans med lämpliga intervall i tabell 3 (inklusive 2447) och för under stamtavla analys unionen av intervaller i tabell 2 med lämpliga intervall i tabell 3 ( exklusive 2447).

Whole exome Sequencing

Vi nästa fullbordat allt-exome sekvense på två av de drabbade moderns mostrar till proband (1826 och 1841) och den drabbade tredje kusin (2447). Vi prioriterade och filtreras varianter baserat på deras frekvens bland europeiska-härkomst populationer (< 2% och en strängare filter på < 1%) från 1000 genom och exome sekvenseringsprojekt dataset samt andra exomes sekvense på samma sekvense leverantör plats inom en genomregion av intresse, och den funktionella konsekvensen av mutationen (ändring av det proteinkodande sekvensen eller splitsstället av åtminstone ett protein kodande transkript). Varianter av intresse sekvenserades sedan genom Sanger-sekvensering i andra drabbade individer. Variant filtrering baserad på genomiska intervaller utfördes separat för varje hypotes (hel-stamtavla och reducerad stamtavla) (tabell S1 och S2). Förutom identifiering och filtrering av genetiska varianter, bedömde vi sekvensdjup täckning av exoner (som definieras av Consensus CDS set) inom iska områden av intresse och mellan enskilda exome sekvense resultat. Vidare har vi sökt efter potentiellt delade varianter som "maskerade" av täckningsproblem. För alla varianter som observerats i ett eller flera exomes, om ingen variant observerades i den återstående exome (s), utvärderade vi huruvida detta var på grund av låga luckor täckning eller täckning inom exonet. För varianter där detta var sant att vi filtreras med hjälp av standardkriterier (som ovan). Med hjälp av dessa filterkriterier, flera varianter med låg MAF och potentiellt ha en effekt på proteinkodande nivå observerades i stamtavlan omfattande iska regioner av intresse som hade identifierats av parametrisk kopplingsanalys; men ingen var närvarande i alla berörda individer. Vidare finns det inga "maskerade" kandidat varianter identifierades av samma kriterier.

Vi övervägt möjligheten att individer 1845 och 2447 har en distinkt kliniskt tillstånd, och undersökte varianter delas bland proband och närmaste familj. Med användning av samma filterkriterier som ovan, men med enbart exomes från enskilda 1826 och 1841, har totalt 127 varianter identifieras. Strängare filtrering för sällsynta varianter (MAF < 1%) reducerade detta till nummer 85 (Tabell S2). En undergrupp av dessa varianter, baserade på en kombination av faktorer (mutationer i COSMIC [13], förutsagda effekten av mutationen, bevarande av den kodade aminosyra, litteraturöversikt, kända uttrycksmönster i normala vävnader och tumörer, sjukdoms fenotyper associerade med gen) sekvenserades för uppföljning i proband och deras mor. En variant i MAP3K6
(Chr1, NM_004672) var av särskilt intresse. En mutation identifierats i MAP3K6
(c. [2837C > T], [=], p.P946L) ansågs vara en stark kandidat baserat på de kända sammanslutningar av andra MAP-kinaser med cancer, och flera publikationer belysa en roll MAP3K6 i tumörbildning [10], [11], [14], [15]. Denna variant har tidigare (rs141787524) rapporteras med en mindre allel frekvens på 0,7% under 1000 Genomes Project (europeisk härkomst grupp) och en frekvens på 0,4% i EU-amerikanska befolkningen (exome Variant Server (NHLBI GO exome Sequencing Project ( ESP). http://evs.gs.washington.edu/EVS [Accessed oktober 2013]) det sågs som en heterozygot variant 11 (av 1532) andra exomes sekvense vid Genome Quebec Innovation Centre, vilket motsvarar en MAF av 0,36%.

Detta SNV var närvarande i fyra drabbade individer i sjöfarts familjen (1884, 1826, 1844, 1841), varav tre visade tydligt närvaron av signetringen celler. Endast en liten punch biopsi var tillgänglig för moster, 1841, därför kunde vi inte att slutgiltigt bekräfta närvaron eller frånvaron av signetring celler. MAP3K6
SNV var också närvarande i fem av de 27 närvarande opåverkade släktingar i urvalet, och det var inte närvarande i gift-i relativ. En av bärarna var homozygot för SNV och var över 80 år gammal utan rapporterade cancer. Även om ingen blodsband rapporterades i familjen, och inga tecken på kopietal variation observerades i genotyp uppgifter SNP, denna person var också homozygot för en 10 Mb region som omfattar locus. De återstående bärarna varierade i ålder från 33 till 51, och som en ålder av uppkomsten av cancer i allmänhet senare var deras status betraktas som "okänd". Både enskilda, 1845 och 2447, med fenotypiskt distinkta magsäckscancer var negativa för MAP3K6
SNV.

Somatic Varianter inom tumören

Vi använde nästa DNA isolerades från en tumör del av FFPE prov av de drabbade MAP3K6
SNV bäraren 1884 (det proband) för att screena för ytterligare somatiska SNVs eller förlust av heterozygositet (LOH) inom själva tumören. Förutom den p.P946L varianten, identifierade vi en ny SNV i MAP3K6
genen vid position C [1516C > T]. Leder till en aminosyraändring p.H506Y (tabell 4), och kunde att dra slutsatsen att SNV somatiskt förvärvades baserat på sekvensdata från make och barn.

Verifiering i närstående FGC Fodral

• PLoS ONE: Jämförande Proteomics Analys för magcancer Stem Cells
• PLOS ONE: Minskade kärn fukosylering bidrar till malignitet hos Gastric Cancer