PLoS ONE: Entdeckung von Tumormarker für Magenkrebs von Proteomics

Abstrakt

Magenkrebs (GC) hat eine hohe Rate von Morbidität und Mortalität bei verschiedenen Krebserkrankungen weltweit. Die Entwicklung von nicht-invasiven diagnostischen Methoden oder Technologien zur Verfolgung das Auftreten von GC dringend ist, und auf der Suche zuverlässige Biomarker ist considered.This Studie soll direkt Differential entdecken Biomarker von GC Gewebe durch zwei-dimension-Differential-Gelelektrophorese (2D-DIGE), und weitere Proteinexpression durch Western Blot (WB) und Immunhistochemie (IHC) .Pairs von GC Gewebe (Magenkrebsgewebe und den angrenzenden normalen Geweben) validiert von der Operation erhalten wurde für 2D-DIEG.Five Proteine ​​untersucht wereconfirmed von WB und IHC, einschließlich Glucose -regulierten protein 78 (GRP78), Glutathion-s-Transferase-pi (GSTpi), Apolipoprotein AI (ApoAI), alpha-1-Antitrypsin (A1AT) und Gastrokine-1 (GKN-1). Zu den Ergebnissen, GRP78, GSTpi und A1ATwere significantlyup reguliert und nach unten reguliert bzw. in Magenkrebs-Patienten. GRP78 und ApoAI Darüber hinaus wurden korreliert mit A1AT für Protein expressions.This Studie diese Proteine ​​setzt voraus Kandidaten zuverlässiger Biomarker für Magenkrebs sein könnte

Citation:. Wu JY, Cheng CC, Wang JY, Wu DC, Hsieh JS Lee SC, et al. (2014) Entdeckung von Tumormarker für Magenkrebs durch Proteomics. PLoS ONE 9 (1): e84158. doi: 10.1371 /journal.pone.0084158

Editor: Salvatore V. Pizzo, der Duke University Medical Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 19. August 2013; Akzeptiert: 12. November 2013 beginnen; Veröffentlicht am: 3. Januar 2014

Copyright: © 2014 Wu et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit NSC96-3111-P-042A-004-Y, NSC100-2314-B-037-040, und von der National Science Council der Republik China wurde durch Zuschüsse unterstützt. Diese Arbeit wurde auch von Kaohsiung Medical University Hospital (KMUH97-7R32, KMUH98-8R33) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Obwohl theprevalence von Magenkrebs ist rückläufig und unterschiedlichen geographisch, bleibt es eine der häufigsten Krebserkrankungen in den asiatischen Ländern und ist die vierte am häufigsten auftretende Krebs (9% aller Krebserkrankungen) weltweit. Die altersstandardisierte Inzidenzraten (ASR) sind größer als 20 pro 100.000 in Hochrisikoländern wie China, Japan und Korea [1], [2], [3]. Es ist auch die zweithäufigste Ursache für Krebstod bei beiden Geschlechtern weltweit (737.000 Todesfälle, 9,7% der Gesamtzahl). In Ostasien haben die Mortalitätsraten als etwa 28,1 pro 100.000 bei Männern und 13,0 pro 100.000 bei Frauen, whilein Nordamerika geschätzt worden, sie sind etwa 2,8 bzw. 1,5 [4].

Fünf-Jahres-Überlebensraten reichten haben von 90% auf weniger als 5 Prozent, vor allem in Abhängigkeit von der Phase der Diagnose [5], [6] .Wenn können Magenkrebs festgestellt und als 90%, die fünf-Jahres-Überlebens rateis besser in frühen Stadien zu behandeln; jedoch isno es offensichtlich oder spezifisches Symptom in der Frühphase des Magens cancer.Thus, frühe detectionof Magenkrebs becomesmore difficult.Although Pepsinogen (PG) testssuch so günstig PGI-Konzentration und /oder niedrige PGI /II-Verhältnis waren suggestiv Screening-Tests in Hoch Risikoländern wie Japan, weregood sie Indikatoren der atrophischen Gastritis eher als diagnostische markersof Magenkrebs [7] - [9] .Essentially, Endoskopie wurde mit 2,7 bis 4,6-mal höhere Erkennungsrate als Barium-Studien beenthe vielversprechendes Werkzeug [10]. Magenfrühkarzinomen Diagnose von endoscopydependson professionelle Fähigkeiten jedoch.

Einige nicht-invasive Biomarker für die Diagnose oder Follow-up in Magen-Darm-und Leber tumorshave berichtet. Zum Beispiel Alpha-Fetoprotein (AFP) eines der klinisch nützliche Biomarker für die Diagnose und Follow-up des hepatozellulären Karzinoms (HCC) .AFP wurde über 20 ng /ml in einer Studie in mehr als 70% der Patienten mit HCC erhöht [11]. Gemäß den Schlussfolgerungen des Barcelona-2000 Europäische Vereinigung für das Studium der Leber (EASL) Konferenz könnte HCC ohne biopsyin Fälle diagnostiziert werden, wo AFP mehr als 400 ng /ml mit einem Knötchen größer als 2 cm ist der Nachweis der arteriellen zeigt Hypervaskularisation bei Zirrhose-Patienten [12] .Incolorectal Karzinom (CRC), ist die präoperative carcinoembryonales Antigen (CEA) Ebene eine hochsignifikante prognostische Kovariable und es wird von der American Society of Clinical Oncology (ASCO) empfohlen, dass sie getestet werden sollte präoperativ zu bieten prognostische Informationen [13]. Serielle Erhebungen von CEA zeigen höhere Wahrscheinlichkeit eines erneuten Auftretens von CRC. Allerdings gibt es keine verlässliche Biomarker für Magenkrebs.

Daher ist für zuverlässige Biomarker für Magenkrebs die Suche ist sehr wichtig für die klinische Praxis. Ziel dieser Studie war zuverlässige Protein-Biomarkern aus angepaßten Gewebe (Tumor und benachbarten normalen Geweben) von zwei-dimension-Differenz-Gelelektrophorese (2D-DIGE) zu entdecken und die Proteine, die durch Matrix-unterstützte Laser-Desorption /Ionisations-Abbilden Massenspektrometrie (MALDI identifizieren -IMS).

Materialien und Methoden

Gewebeproben

Die Gewebeproben wurden nach informieren Zustimmungen wurden unterzeichnet. Gepaart samplesincluding Tumor und benachbarten normalen tissuesfrom Patienten wurden aus endoskopische Biopsien oder surgery.The Tumor-Typen abgeleitet wurden, ermittelt nach der amerikanischen Joint Commission on Cancer Staging (AJCCS) -System von Pathologen unter Methylenblau staining.Clinical Information der Patienten aufgenommen wurde, einschließlich Alter, Geschlecht, Art des Tumors, die Invasion und das Überleben. Zusätzlich wurde die CEA-Konzentration im Serum auch durch radioaktive Immunoassay in der medizinischen Routine diagnosis.The gemessen in der vorliegenden Studie individualsenrolled haben eine schriftliche Einwilligung erteilt diese Fall den Daten, Studie zu veröffentlichen, von der Institutional Review Board von Kaohsiung Medical University Chung- genehmigt wurde Ho Memorial Hospital (KMUH-IRB-980382).

Zwei Dimension-Differenz-Gelelektrophorese

Ein (Tabelle 1) Paar von Gewebeproben washomogenized (PRO 200, Bertec, Taiwan) in mäßiger Lautstärke Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, 8 m Harnstoff, 4% (w /v) 3 - [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat und pH 8,5). Die einzelnen 50 ug Probenprotein wurde mit 400 pmol von Cy3 markiert oder Cy5 separat für 30 Minuten (Fig. 1B). Zusätzlich wurde die gepoolte Probengemisch (100 &mgr; g) mit 800 pmol von Cy2 als interner Standard zur gleichen Zeit beschriftet. Anschließend reactionswere die Markierung durch Inkubation von 1 ul 10 mM Lysin-Puffer für 30 Minuten gestoppt, dann eine fachen Volumen an Probenpuffer (8 M Harnstoff, 20 mM Dithiothreitol, 4% (w /v) 3 - [(3 -Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat, 0,5% (v /v) IPG-Puffer und einige Bromphenolblau) wurde zusetzt.Verfahren erste Trennung, isoelektrische Fokussierung, wurde auf die Gelstreifen unter Verwendung Kappe Beladung (7 cm, pI 4- 7) bei 20 ° C gehalten wurde unter 15000voltage Stunden (IPGphor System, GE Healthcare). Nach Äquilibrierung mit Natriumdodecylsulfat durchgeführt, wobei die zweiten separationwas using4-12% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Die Gel-Bilder erworben wurden (Typhoon TRIO Variable Modus Imager, GE Healthcare) mit 488, 532 und 633 nm-Laser mit einem Emissionsfilter von 520, 532 und 670 nm auf. Alle Bilder wurden mit DeCyder 6.5-Software (GE Healthcare) analysiert, um die Differenz Proteine ​​auszuwählen, die onthe Platzierung unter einen signifikanten Wert von 0,05 nach Studenten wereselected je t
-test.

In-Gel tryptischen Verdau

Die Gele gefärbt mit Sybro Rubin (Sigma) wurden anschließend mit 10% Methanol und 7% Essigsäure in entionisiertem Wasser für genau 30 min beträgt.Verfahren sichtbaren Flecken Gelen unter einem UV-Transilluminator (Spectroline) entfärbt waren verwendet für die interessanten Proteine ​​manuell zu graben. Diese Gelpartikel wurden in 100 ul 25 mM Ammoniumbicarbonat in 50% Acetonitril für 15 min gewaschen und dann in 200 ul 25 mM Ammoniumbicarbonat in deionisiertem Wasser für 15 min zweimal gewaschen, und anschließend wurde ausreichend Acetonitril die schrumpfen Gelteilchen. Nach dem Trocknen nach unten werden die einzelnen Gel mit 3 &mgr; l 20 ng /&mgr; l Trypsin in 25 mM Ammoniumbicarbonat bei 4 ° C für 1 Stunde und anschließend 3 &mgr; l 25 mM Ammoniumbicarbonat particleswereincubated wurden die Proteine ​​bei 56 ° C verdauen hinzugefügt für 1 Stunde. Nach In-Gel-Verdauung, 2 ul 100% Acetonitril mit 1% Trifluoressigsäure wurden zu den Lösungen gegeben, und dann wurden die Proben beschallt für 10 min Peptide von Gelteilchen zu lösen.

massenspektrometrische Analyse zur Proteinidentifizierung

Jede Proteinlösung mit Trypsin verdaut wurde 01.01 Uhr gemischt mit 10 mg /mlof α-cyano-4-hydroxyzimtsäure in 50% Acetonitril gelöst /0,1% Trifluoressigsäure und aufgeträufelt AnchorChip MALDI Target (Bruker Daltonics GmbH , Bremen, Deutschland), bis sie trocken. Die Peptide wurden durch MALDI-TOF /TOF UltraflexIII (Bruker Daltonics) unter 20 KV mit Positivmodell analysiert, und die Spitzendaten wurden auf FlexAnalysis übertragen ™ 3.0 Software (Bruker Daltonics) für fortgeschrittene Berechnung und Kalibrierung. MASCOT 2.2 (Matrix Science) wurde verwendet, um die Peptide mit NCBI oder Swiss-Prot-Datenbank für die Proteinidentifikation entsprechen. Die Einstellung beschränkt war auf die menschliche Taxonomie parameters.Meanwhile wurde carbamidomethyl Cystein als feste Modifikation verwendet, und Methionin als variable Modifikation oxidiert. Die Wahrscheinlichkeit (P) wurde auf Mowse Basis-Score von -10 × Log (P) berechnet. Protein-Score von mehr als 56 war signifikant ( p
< 0,05). Darüber hinaus eines der wichtigsten Peptidpeaks auf dem Spektrum verwendet wurde erscheint das gleiche Ergebnis zu bestätigen, indem die Aminosäuresequenz zu identifizieren, das Peptidfragment Fingerprinting-Verfahren genannt wird.

Western-Blot

Die Paare Gewebeproben wurden homogenisiert (Pro 200, Bertec) in Lysepuffer (10 mM Natriumphosphat, 0,9% Natriumchlorid, 1% Triton-X100, pH 7,4) und inkubiert über 1 Stunde bei 4 ° C schütteln. Nach der ausgefällten Pellets Loswerden von Hochgeschwindigkeitszentrifugation (10.000 rpm, 5 Minuten), die pipettierten Stände wurden hinzugefügt Puffer Probe (10 mM Natriumphosphat, 0,9% Natriumchlorid, 8 M Harnstoff, 30% Glycerin, 2 % Natriumdodecylsulfat, 0,1% β-Mercaptoethanol und 0,1% Bromphenolblau) durch 1: 1-Verhältnis und 5 min für Protein bei 100 ° C gekocht denature.Approximately 20 ug jeder Probe Protein auf die einzelnen Gitter 4- geladen wurden, 12% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE, Invitrogen). Das iBlot Dry-Blotting-System (Invitrogen) wurde für die Transformation der Proteine ​​an Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran auf Basis von Ionen verwendet, zusammen mit einer Kupferelektrode fließt. Nach der Verwendung von 0,5% Milch die PVDF-Membran für 30 min Die einzelnen primären Antikörper (2 ug /ml) zu Blot wurde für 2 Stunden zur Inkubation hinzugefügt beim Schütteln. Die konsequente Sekundärantikörper, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) (2 ug /ml) wurden beim Schütteln nacheinander für 1 Stunde inkubiert. Zwischen den Inkubieren Prozessen repeatedlywashings von PBS-Puffer (10 mM Natriumphosphat, pH 7,4 und 0,9% Natriumchlorid) weredone. Die ECL-Detektionssystem (Millipore) durchgeführt wurde, und die Bilder wurden von Imaging System (Gel Doc XR-System, Bio-Rad) in Abhängigkeit von der moderaten Erkundung der Zeit erworben.

Immunhistochemie

Die Immunhistochemie wurde performedusing eine Standard-Peroxidase-Basis-Färbung. Die Gewebeproben wurden mit einem Kryostat geschnitten (HM525, microM) .Fresh Gewebeschnitte (10 um) auf den Lysin-beschichtete Objektträger wurden driedon einer Heizung auf 37 ° C und nacheinander durch aufeinanderfolgende 75%, 95% und 100% Ethanol eingetaucht 1 Minute Proteinfixierung. Kurz gesagt, wurde die endogene Peroxidase-Aktivität für 10 Minuten mit 3% Wasserstoffperoxid gequencht. Das Antigen Folge wurde durch Eintauchen des Gewebes Schieber in 10 mM Citrat-Säure ausgesetzt Wasser für 25 Minuten in siedendes. Aufeinander folgende Inkubationen mit den einzelnen Primär antibodyandthe HRP-konjugierten sekundären Antikörper wurden beim Schütteln für einzelne 1 Stunde durchgeführt. Der AEC-Kit (Sigma) wurde verwendet, um die Gewebe zu färben, und die Operation folgte dem beigefügten Handbuch. Kurz gesagt, wasperformed themixed Lösung von 2,5 M Acetatpuffer, AEC chromogene (3-amino-9ethylcarbazole) und 3% Wasserstoffperoxid sofort und nacheinander mit Gewebe slides.The Bildfärbungs Dias inkubiert wurden unter einem Mikroskopie (BX51, Olympus) beobachtet und erworbenen .

Statistik Analyse

die Statistik-Software SPSS die Bedeutung zu berechnen nach: Student wurde durchgeführt, t
-test und Korrelation zwischen GRP78, GSTpi, A1AT, ApoAI und GKN- 1. Die significantdifference ( p
Wert) war akzeptabel, da weniger als 0,5.

Ergebnisse

• PLoS ONE: abnehmend Kern-Fukosylierung zu Malignität in Gastric Cancer
• PLoS ONE: MYC Deregulation in Magenkrebs und seine Clinicopathological Implications