PLoS ONE: RhoC Regelt die Proliferation von Magenkrebszellen durch die Interaktion mit IQGAP1

Abstrakt

Unsere bisherigen Forschungsergebnisse zeigten, dass sowohl Ras Homolog Familienmitglied C (RhoC) und IQ-Domäne GTPase-aktivierendes Protein 1 (IQGAP1) waren bei Magenkrebs Gewebe und Zellen überexprimiert, aber ihre Rolle in tumorigenensis wurde nicht eindeutig festgelegt werden. Hierin berichteten wir über die Proliferation auf Magenkrebszellen und die Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen in der Regulation der Proliferation von Magenkrebszellen Wirkung RhoC und IQGAP1 stimulieren. Plasmide und virale Konstrukte kodieren Ziel siRNA und DNA wurden verwendet, um die Expression von RhoC und IQGAP1 zu verändern. MTT-Methode und BrdU-Einbau-Assay wurde zur Analyse der Wirkung von RhoC und unterschiedliche Strukturen IQGAP1 auf die Proliferation verwendet. Proteinspiegel von IQGAP1 und RhoC in Zelllinien wurden durch Western-Blot nachgewiesen. Immunofluoreszenz und Co-Immunopräzipitation Assays wurden angewandt, um die Lokalisierung und die Bindung zwischen RhoC und IQGAP1 zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass RhoC, IQGAP1 und das C-terminale Fragment von IQGAP1 signifikant die Proliferation von Magenkrebszellen stimuliert und erhöhte die Expression von Cyclin E und Cyclin D1. Im Gegensatz dazu Reduktion der endogenen IQGAP1 oder RhoC durch siRNA abgeschwächten Zellproliferation. Die Erschöpfung der IQGAP1 Expression durch siRNA blockiert signifikant die Proliferationsaktivität von konstitutiv aktiven RhoC, während RhoC von siRNA zum Schweigen zu bringen hatte keine Wirkung auf IQGAP1-induzierte Proliferation in Magenkrebszellen. Co-Immunpräzipitation und Immunfluoreszenz-Tests zeigten, dass RhoC und IQGAP1 einander gebunden. Abschließend unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass RhoC die Proliferation von Magenkrebszellen durch Rekrutierung IQGAP1 als Effektor stimuliert

Citation:. Wu Y, Tao Y, Chen Y, Xu W (2012) RhoC die Proliferation von Magen Reguliert Krebszellen durch die Interaktion mit IQGAP1. PLoS ONE 7 (11): e48917. doi: 10.1371 /journal.pone.0048917

Editor: Zoran Culig, Medizinische Universität Innsbruck, Österreich

Empfangen: 26. Juni 2012; Akzeptiert: 2. Oktober 2012; Veröffentlicht: 7. November 2012

Copyright: © 2012 Wu et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Studie wurde von der Specialized Research Fund Senior Personalprogramm der Jiangsu University (Nr. 11JDG114) unterstützt und der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31040002). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Rho GTPasen können bestimmte intrazelluläre Signaltransduktion induzieren und verschiedene zelluläre Aktivitäten auswirken, einschließlich der Reorganisation des Aktin-Zytoskelett, Gen-Transkription, Überleben und Proliferation [1], [2]. Obwohl drei Rho-Isoformen, RhoA, RhoB und RhoC, zeigen mehr als 85% Aminosäureidentität, verleihen sie Unterschiede in Funktion in Zellen [3]. RhoA und RhoC Proteine ​​wurden eine positive Rolle bei der Proliferation und der malignen Transformation zu haben gezeigt, [4], [5], [6], während die Rolle der RhoB in diesen Prozessen erscheint mehr divergent zu sein [7], [8]. Die meisten Studien haben gezeigt, dass RhoC mehrere Funktionen in Tumormetastasen hatte, die Wirkung von mehreren Effektoren orchestriert, Abbau und Wiederaufbau der extrazellulären Matrix (ECM). Es besteht jedoch weiterhin einige Kontroversen über die Rolle der RhoC bei der Regulierung der Zellproliferation [9], [10], [11], [12]. Die Ergebnisse aus Pile Labor zeigten, dass RhoA und RhoC siRNA repräsentieren leistungsfähige Werkzeuge zur Hemmung der Vermehrung von Krebszellen, Invasivität und die Angiogenese sowohl In-vitro-
und in vivo
[9]. Sun et al
gefunden, dass die intratumorale Injektion von RhoA oder RhoC siRNA an Nacktmäusen kann das Tumorwachstum [13] hemmen. Im Gegensatz dazu Faried et al
berichtet, dass RhoA als RhoC mehr Tumorwachstum fördert, während RhoC im Vergleich zu RhoA Fernmetastasen induziert [11], in Übereinstimmung mit den Beobachtungen von Clark und Kollegen [14]. Eine Studie von Ikoma und Kollegen zeigten, dass RhoC nicht das Tumorwachstum beeinflussen hat, sondern verbessert die metastatischen Natur von Lungenkrebs durch Zellbeweglichkeit stimulieren [10]. Daher wird die weitere Untersuchung erforderlich, um die Rolle von RhoC bei der Regulierung der biologischen Aktivitäten von Tumorzellen zu identifizieren.

IQ-Domäne GTPase-aktivierende Proteine ​​(IQGAPs) sind wichtige Regulatoren der zellulären Prozesse, die Zytoskelett-Rearrangements in der Zellmigration umfassen , Proliferation und Zytokinese [15], [16], [17]. IQGAP1 ist eines der Mitglieder der drei verwandten Säugetier IQGAPs und Veränderung der intrazellulären IQGAP1 Expression oder Funktion berichtet Zellaktivitäten zu verändern [17], [18], [19], [20]. Als Gerüstprotein, bindet IQGAP1 mehrere Proteine, wie Onkogene β-Catenin und Src, Tumorsuppressor-E-Cadherin und der Rho-GTPasen Cdc42 und Rac1, und veranlasst die Veränderung der zellulären Verhalten, insbesondere für die Krebszellen. Unsere frühere Studie zeigte, dass die höheren Ausdrücke RhoC und IQGAP1 in Gewebe Magenkrebs signifikant umgekehrt mit der Differenzierung der Magenkrebszellen [21] korreliert. Darüber hinaus wurden die Proteinspiegel auch die für die Proliferation und Migration von Krebszellen. Daher wir die Hypothese auf, dass sowohl RhoC und IQGAP1 wichtige Rolle bei der Krebszelle spielen Transformation und Proliferation und es gibt eine potentielle Verbindung zwischen ihnen. In der vorliegenden Forschung, untersuchten wir den Einfluss von RhoC und unterschiedliche Strukturen von IQGAP1 auf Krebszellproliferation und Zellzyklus-verwandte Proteine. Wir untersuchten auch die Beziehung zwischen den beiden Molekülen durch die gemeinsame Anwendung von siRNA Interferenz und Virusinfektion Technik.

Materialien und Methoden

Reagenzien

Die Magenkrebszelllinien BGC-823 [22] und der afrikanischen grünen Affen-Nieren-Fibroblasten-Zelllinien COS-7 wurden vom Institut für Zellbiologie (Shanghai, China) zur Verfügung gestellt. Das grün fluoreszierende Protein (GFP) Plasmid und Zell Transfektionsreagenz Lipofectamin ™ 2000 wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA); Die Plasmide kodieren Flagge markiert IQGAP1 (pFlag-IQGAP1), Flagge markiert IQGAP1 C-terminale Fragment (pFlag-IQGAP1-C) und Flagge markiert IQGAP1 N-terminale Fragment (pFlag-IQGAP1-N), und adenovirale Vektoren, die β-Galactosidase (pAVK-LacZ), eine konstitutiv aktive Form von RhoC (pAVK-RhoC-V14), in voller Länge IQGAP1 (pAVK-IQGAP1) und das C-terminale Fragment von IQGAP1 (pAVK-IQGAP1-C) waren solche Geschenke von Dr. Gerry Boss und Dr. Renate Pilz in der Universität von Kalifornien, San Diego, USA. Mensch-EGF, BrdU, Maus anti-BrdU-Antikörper, DNase I, MTT, Hoechst 33342, FITC- und Cy3-konjugierten sekundären Antikörper waren von Sigma (St. Louis, MO). Die anti-IQGAP1 Antikörper (gegen N-terminales Fragment, 314-422 aa), anti-RhoA Antikörper, anti-IgG-Antikörper, anti-CDK1 /CDK2 Antikörper, kurze interferierende RNAs (siRNA) für RhoC und Negativkontrolle wurden von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Der Rho C siRNA ist ein Pool von 3 zielspezifische 20-25 nt siRNAs die Genexpression mit den Sequenzen zu klopfen wie folgt aufgebaut: Sequence1, spüren 5'-CUACUGUCUUUGAGAACUAtt-3 'und Antisense-5'-UAGUUCUCAA- AGACAGUAGtt-3 '; Sequence2, erfassen 5'-GCAGGAAGACUAUGAUCGAtt-3 'und Antisense 5'-UCGAUCAUAGUCUUCCUGCtt-3'; sequence3, erfassen 5'-CAC-ACCAGCACUUUAUACAtt-3 'und Antisense 5'-UGUAUAAAGUGCUGGUGUG- tt-3'. Die anti-IQGAP1 Antikörper (gegen C-terminales Fragment Säuren 863-1657 menschlicher IQGAP1 zu Aminogruppen entspricht) war von Millipore (Billerica, MA). Der Anti-Antikörper wurde von RhoC Abcam (Cambridge, MA). Die Anti-Cyclin B-Antikörper wurde von Bioworld Technologie (St. Louis Park, MN). Die Anti-Cyclin D1-Antikörper und anti-Cyclin-E-Antikörper waren von Boster (Wuhan, China). Die siRNA für IQGAP1 synthetisiert wurde von Qiagen (Valencia, CA) wurde die Zielsequenz IQGAP1 5'-AAGTTCTACGGGAAGTAATTG-3 '(5058-5078 bp). Meerrettichperoxidase (HRP) -konjugiertem sekundärem Antikörper wurde von Rockland Immunochemicals (Gilberts, PA). Protein G Plus /Protein-A-Agarose wurde von Calbiochem (San Diego, CA). Elektrochemilumineszenz (ECL) Reagenzien wurden von Millipore (Billerica, MA). Alle Reagenzien, die in dieser Studie verwendet wurden, waren von analytischer Qualität.

Zellkultur, Transfektion und Infektion

BGC-823 und COS-7-Zellen wurden in 1 × Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ° C in 5% CO _{2 -Atmosphäre. Das Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt und die Zellen wurden subkultiviert bei Konfluenz. Zur Transfektion wurden die Zellen subkultiviert, am Tag vor dem Prozess und die Transfektion von Magenkrebszellen mit Plasmiden oder siRNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Zur Infektion wurden 293A-Zellen mit Adenovirus-Vektoren transfiziert Foulard-LacZ, polster RhoC-V14, polster IQGAP1 und polster IQGAP1-C, und die viralen von den Zellen produziert wurden Partikel geerntet und verstärkt. Die Viren wurden Ad-LacZ, Ad-RhoC-14, Ad-IQGAP1 und Ad-IQGAP1-C jeweils benannt und wurden verwendet, BGC-823-Zellen zu infizieren. Am Tag vor der Infektion, BGC-823-Zellen wurden frisch bei 70-80% Konfluenz ausgesät und die Infektion Prozess wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers auf den zweiten Tag durchgeführt.}

Western Blotting

Cultured Zellen wurden dreimal in PBS gewaschen und lysiert, mit RIPA-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM Leupeptin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 mM NaF gewaschen , 1 mM Na _{3VO 4). Gleiche Mengen an Protein wurden durch 8% oder 12% SDS-PAGE nach der Protein-Molekulargewicht getrennt. Die primären Antikörper wurden bei 4 ° C über Nacht inkubiert, und die entsprechenden Sekundärantikörper wurden für 1 h bei RT inkubiert. Drei Waschungen wurden mit TBS /T nach jeder Antikörper-Inkubation durchgeführt. ECL verwendeten Reagenzien wurden auf der Membran, die die positiven Banden zu zeigen.}

MTT Assay

0,5-1 × 10 ^{3cells in 150 ul Medium wurden in den Brunnen von plattierten 96-Well Platten. Nach der Befestigung wurden die Zellen mit entsprechenden Adenovirus für 48 h infiziert sind, oder für 72 h mit siRNA transfizierten, respectively. In Kombination Gruppen wurden die Zellen, transfiziert mit siRNA RhoC oder IQGAP1 für 24 h Targeting und dann mit Ad-IQGAP1-C /Ad-IQGAP1 oder Ad-RhoC-V14 für weitere 48 h bei 37 ° C in 5% CO _{2. Die kultivierten Zellen wurden mit PBS gewaschen, behandelt mit 20 &mgr; l MTT (0,5 mg /ml), und dann 1 h bei 37 ° C inkubiert. Das Medium wurde entfernt und 100 ul Dimethylsulfoxid (DMSO) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Extinktion wurde bei 490 nm unter Verwendung von Mikrotiterplatten-Lesegerät bestimmt. Alle Assays wurden dreifach durchgeführt.}}

BrdU Inkorporationstest

Die DNA-Syntheserate mit BrdU-Einbau durch Immunofluoreszenz gemessen. Die seeding Menge an Zellen wurde eingestellt, um eine Dichte von 70-80% Konfluenz am Tag der Transfektion zu erreichen. Das Plasmid pFlag-IQGAP1, pFlag-IQGAP1-C oder pFlag-IQGAP1-N wurde mit GFP-Plasmid in BGC-823-Zellen cotransfiziert 2000 unter Verwendung von Lipofectamin ™ wie oben beschrieben. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen serumausgehungerten über Nacht behandelt, mit 200 μ
M BrdU und für etwa 16 h inkubiert. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen, fixiert in frisch hergestelltem 4% (v /v) Paraformaldehyd bei RT für 10 min, und permeabilisiert mit 0,5% (v /v) Triton X-100, gefolgt von einer Inkubation mit DNase I (0,5 U /&mgr; l) bei 37 ° C 30 Minuten. Die Zellen wurden über Nacht bei 4 ° C, gefolgt von Cy3-konjugiertem sekundärem Antikörper für 1 h bei RT mit primärem Antikörper gegen BrdU inkubiert. Schließlich Kerne wurden gegengefärbt mit Hoechst 33342 für 15 Minuten, gespült mit PBS dreimal und unter Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Jeder Test wurde in quadruplet und dreimal wiederholt durchgeführt.

Co-Immunpräzipitation

Um die Interaktion zwischen RhoC und IQGAP1, COS-7 und BGC-823-Zellen wurden zu untersuchen-Koinfektion mit Ad- IQGAP1 oder Ad-IQGAP1-C, und Ad-RhoC-V14 für 48 h und dann wurden mit RIPA-Puffer, wie beschrieben. Der Antikörper gegen RhoC, IQGAP1 oder Isotyp IgG wurde für die Immunpräzipitation verwendet wurden. Immunpräzipitate wurden wie oben durch Western-Blotting analysiert, unter Verwendung von anti-RhoC oder Anti-Antikörper IQGAP1.

Immunofluoreszenzmikroskopie

Die kultivierten Zellen auf Deckgläser mit frisch hergestelltem 4% fixiert waren (v /v Paraformaldehyd) in PBS für 15 min mit 0,3% Triton X-100 in PBS für 10 min, und blockiert mit 3% (w /v) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS permeabilisiert. Für Immunfluoreszenz, die Zellen auf Deckgläsern wurden nacheinander mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen IQGAP1 bei 4 ° C über Nacht inkubiert, FITC-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG für 1 h bei RT, Maus monoklonaler Antikörper gegen RhoC für 2 h bei RT und schließlich Ziege-anti-Maus-IgG 1 h bei RT mit Cy3 konjugiert. Drei Waschungen wurden nach jeder Antikörper-Inkubation durchgeführt. Die Kerne wurden gegengefärbt mit Hoechst 33342. Das Ergebnis unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einer CCD-Kamera (Leica) montiert beobachtet wurde.

Statistische Analyse

Die Daten wurden eine two-tailed analysiert ANOVA oder Student t
-test mit SPSS Statistik-Software, und als Mittelwert ± Standardabweichung (SD). P
. ≪ 0,05 wurde als signifikant angesehen

Ergebnisse

• PLoS ONE: Polymorphismen in ERCC1 und XPF Gene und Risiko von Magenkrebs in einer ostchinesischen Population
• PLoS ONE: Reg IV ein direktes Ziel der intestinalen Transkriptionsfaktor CDX2 in Gastric Cancer