PLoS ONE: RhoC regelt de verspreiding van maagkanker cellen door interactie met IQGAP1

Abstract

Onze vorige onderzoeksresultaten toonden aan dat zowel Ras homoloog familielid C (RhoC) en IQ-domein-GTPase activerend eiwit 1 ( IQGAP1) werden tot overexpressie gebracht bij maagkanker weefsels en cellen, maar hun rol in tumorigenensis is niet duidelijk aangepakt. Dit formulier we de proliferatie stimulerende effect van RhoC en IQGAP1 op maagkanker cellen en de interactie tussen twee eiwitten bij het reguleren van de proliferatie van maagkanker cellen. Plasmiden en virale constructen die coderen doel siRNA en DNA werden gebruikt om de expressie van RhoC en IQGAP1 veranderen. MTT werkwijze en BrdU incorporatie assay werd gebruikt voor het analyseren van het effect van RhoC en verschillende structuren van IQGAP1 op proliferatie. Eiwit niveaus van IQGAP1 en RhoC in cellijnen werden gedetecteerd door Western blotting. Immunofluorescentie en co-immunoprecipitatie assays werden toegepast op de lokalisatie te onderzoeken en binding tussen RhoC en IQGAP1. De resultaten toonden aan dat RhoC, IQGAP1 en het C-terminale fragment van IQGAP1 beduidend stimuleerde de proliferatie van maagkanker cellen en verhoogde de expressie van cycline E en cycline D1. Daarentegen reductie van endogene IQGAP1 of RhoC door siRNA verzwakt celproliferatie. De uitputting van IQGAP1 expressie door siRNA aanzienlijk blokkeerde de proliferatieve activiteit van constitutief actieve RhoC, terwijl RhoC zwijgen op te leggen door siRNA geen effect op IQGAP1-geïnduceerde proliferatie bij maagkanker cellen hadden. Co-immunoprecipitatie en immunofluorescentie assays toonden dat RhoC en IQGAP1 elkaar verbonden. Tot slot, onze resultaten suggereren dat RhoC stimuleert de proliferatie van maagkanker cellen door het werven IQGAP1 als een effector

Visum:. Wu Y, Y Tao, Chen Y, Xu W (2012) RhoC Regelt de verspreiding van Gastric Kankercellen door interactie met IQGAP1. PLoS ONE 7 (11): e48917. doi: 10.1371 /journal.pone.0048917

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Oostenrijk |

Ontvangen: 26 juni 2012; Aanvaard: 2 oktober 2012; Gepubliceerd: 7 november 2012 |

Copyright: © 2012 Wu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd gesteund door de Specialized Research Fund voor hoger personeel Programma van Jiangsu University (No. 11JDG114) en de National Natural Science Foundation of China (nr. 31040002). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Rho GTPases kunnen bepaalde intracellulaire signaaltransductie induceren en invloed verscheidene cellulaire activiteiten, waaronder reorganisatie van het actine cytoskelet, gentranscriptie, overleving en proliferatie [1], [2]. Hoewel drie isovormen Rho, RhoA, RhoB en RhoC, vertonen meer dan 85% aminozuur identiteit, verlenen zij verschillen in functie in cellen [3]. RhoA en RhoC eiwitten is aangetoond dat een positieve rol in proliferatie en kwaadaardige transformatie hebben [4], [5], [6], terwijl de rol van RhoB bij deze processen lijkt divergent te zijn [7], [8]. De meeste studies aangetoond dat RhoC hadden meerdere functies in tumormetastase, georkestreerde werking van verschillende effectoren, afbraak en reconstructie van de extracellulaire matrix (ECM). Toch blijft er enige controverse over de rol van RhoC bij het reguleren van celproliferatie [9], [10], [11], [12]. De resultaten van de stapel het laboratorium bleek dat RhoA en RhoC siRNA vertegenwoordigen krachtige tools voor het remmen kankercel proliferatie, invasiviteit en angiogenese zowel In vitro Kopen en In vivo
[9]. Zon et al, vond dat intratumorale injectie van RhoA of RhoC siRNA om naakt muizen tumorgroei [13] kan remmen. In tegenstelling Faried et al
gemeld dat RhoA bevordert de groei van de tumor meer dan RhoC, terwijl RhoC induceert metastasen op afstand in vergelijking met RhoA [11], in overeenstemming met de opmerkingen van Clark en collega's [14]. Een studie van Ikoma en collega's toonden aan dat RhoC geen invloed op de tumorgroei, maar juist metastatische aard van longkanker door het stimuleren van celmotiliteit [10]. Daarom is verder onderzoek nodig om de rol van RhoC identificeren reguleren van biologische activiteiten van tumorcellen.

IQ-domein GTPase-activerende eiwitten (IQGAPs) zijn belangrijke regulatoren van de cellulaire processen die herschikkingen van het cytoskelet in celmigratie onder , proliferatie en cytokinese [15], [16], [17]. IQGAP1 is een van de leden van de drie verbonden zoogdier IQGAPs en veranderen in intracellulaire IQGAP1 expressie of functie gemeld celactiviteiten wijzigen [17], [18], [19], [20]. Als scaffold eiwit bindt IQGAP1 meerdere eiwitten, zoals oncogenen β-catenine en Src, tumor suppressor E-cadherine en Rho GTPases Cdc42 en Rac1, en veroorzaakt de verandering van cellulair gedrag, met name kankercellen. Onze eerdere studie toonde aan dat de hogere uitingen van RhoC en IQGAP1 bij maagkanker weefsel significant omgekeerd gecorreleerd met de differentiatie van maagkanker cellen [21]. Bovendien, de eiwitniveaus werden ook de proliferatie en migratie van kankercellen relevant. Daarom veronderstellen wij dat zowel RhoC en IQGAP1 belangrijke rol in kanker celtransformatie en proliferatie kunnen spelen en er is een mogelijke associatie tussen hen. In het onderhavige onderzoek onderzochten we de invloed van RhoC en verschillende structuren van IQGAP1 op de proliferatie van kankercellen en celcyclus verwante proteïnen. We onderzochten ook de relatie tussen de twee moleculen door gezamenlijke toepassing van siRNA interferentie en virale infectie techniek.

Materialen en methoden

reagentia

De maagkanker cellijnen BGC-823 [22] en de Afrikaanse groene aap nier fibroblast cellijnen COS-7 werden verstrekt door het Institute of Cell Biology (Shanghai, China). The Green Fluorescent Protein (GFP) plasmide en cel transfectiereagens Lipofectamine ™ 2000 waren van Invitrogen (Carlsbad, CA); De plasmiden die coderen Flag tag IQGAP1 (pFlag-IQGAP1), Flag tag IQGAP1 C-terminale fragment (pFlag-IQGAP1-C) en Flag tag IQGAP1 N-terminale fragment (pFlag-IQGAP1-N) en adenovirale vectoren die coderen β-galactosidase (pAD-LacZ), een constitutief actieve vorm van RhoC (pAD-RhoC-V14), full length IQGAP1 (pAD-IQGAP1) en de C-terminale fragment van IQGAP1 (pAD-IQGAP1-C) aardig giften van Dr. Gerry Boss en Dr. Renate Pilz in de University of California, San Diego, USA. Human-EGF, BrdU, muis anti-BrdU antilichaam, DNase I, MTT, Hoechst 33342, FITC en Cy3-geconjugeerde secundaire antilichamen waren van Sigma (St. Louis, MO). De anti-IQGAP1 antilichaam (tegen N-terminaal fragment, aa 314-422), anti-RhoA-antilichaam, anti-IgG-antilichaam, anti-CDK1 /CDK2 antilichaam korte interfererende RNA's (siRNA) voor RhoC en negatieve controle werden uit Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). De Rho C siRNA is een pool van 3 doelgroep-specifieke 20-25 nt siRNA's ontworpen voor het neerslaan van de expressie van genen met de sequenties als volgt: Reeks1, voelen 5'-CUACUGUCUUUGAGAACUAtt-3'- antisense 5'-UAGUUCUCAA- AGACAGUAGtt-3 '; Reeks2, voelen 5'-GCAGGAAGACUAUGAUCGAtt-3 'en antisense 5'-UCGAUCAUAGUCUUCCUGCtt-3'; sequence3, voelen 5'-CAC-ACCAGCACUUUAUACAtt-3 'en antisense 5'-UGUAUAAAGUGCUGGUGUG- tt-3'. De anti-IQGAP1 antilichaam (tegen C-terminaal fragment overeenkomend met aminozuren 863-1657 van menselijke IQGAP1 amino) was van Millipore (Billerica, MA). De anti-RhoC antilichaam van Abcam (Cambridge, MA). De anti-cycline B antilichaam uit Bioworld Technology (St. Louis Park, MN). De anti-cycline D1 antilichaam en anti-cycline E antilichaam waren afkomstig Boster (Wuhan, China). De siRNA voor IQGAP1 werd gesynthetiseerd door Qiagen (Valencia, CA), de doelsequentie was IQGAP1 5'- AAGTTCTACGGGAAGTAATTG-3 '(5058-5078 bp). Mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd secundair antilichaam was van Rockland Immunochemicals (Gilbertsville, PA). Protein G Plus /proteïne A-agarose bij Calbiochem (San Diego, CA). Elektrochemiluminescentie (ECL) reagentia waren van Millipore (Billerica, MA). Alle reagentia die in dit onderzoek waren van analytische kwaliteit.

Celkweek, transfectie en infectie

BGC-823 en COS-7-cellen werden gekweekt in 1 x Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in 5% CO _{2 atmosfeer. Het medium werd om de dag vervangen en de cellen werden gekweekt bij sub-confluentie. Voor transfectie werden de cellen gekweekt onder de dag voor het proces en de transfectie van maagkanker cellen met plasmiden of siRNA werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Voor infectie werden 293A-cellen getransfecteerd met adenovirale vectoren pAd-LacZ, pAd-RhoC-V14, pAd-IQGAP1 en pAd-IQGAP1-C, en de virale deeltjes die door de cellen geoogst en geamplificeerd. De virussen werden genoemd Ad-LacZ, Ad-RhoC-14, Ad-IQGAP1 en Ad-IQGAP1-C respectievelijk en werden gebruikt om BGC-823 cellen te infecteren. Op de dag voor de infectie werden BGC-823 cellen vers geënt bij 70-80% confluentie en het infectieproces werd uitgevoerd volgens de aanwijzingen van de fabrikant op de tweede dag.}

Western Blotting

Gekweekte cellen werden driemaal gewassen in PBS en gelyseerd met RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptine, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 10 mM NaF , 1 mM Na _{3VO 4). Gelijke hoeveelheden eiwitten werden gescheiden met 8% of 12% SDS-PAGE volgens de proteïne molecuulgewicht. De primaire antilichamen werden geïncubeerd gedurende de nacht bij 4 ° C, en het overeenkomstige secundaire antilichamen werden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Drie wassingen werden uitgevoerd met TBS /T na elk antilichaam incubatie. ECL reagentia werden toegepast om de positieve banden weergegeven op het membraan.}

MTT assay

0,5-1 x 10 ^{3cells in 150 gl medium werden uitgeplaat in de well van 96-well platen. Na hechting werden de cellen geïnfecteerd met adenovirus overeenkomstige gedurende 48 uur, of getransfecteerd met siRNA voor 72 uur, respectievelijk. In combinatie groepen werden cellen getransfecteerd met siRNA gericht RhoC of IQGAP1 gedurende 24 uur en vervolgens geïnfecteerd met Ad-IQGAP1-C /Ad-IQGAP1 of Ad-RhoC-V14 gedurende nog 48 uur bij 37 ° C in 5% CO _{2. De gekweekte cellen werden gewassen met PBS, behandeld met 20 ul MTT (0,5 mg /ml), en vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 1 uur. Het medium werd verwijderd en 100 gl dimethylsulfoxide (DMSO) toegevoegd aan elk putje. De absorptie werd bepaald bij 490 nm met behulp microplaat reader. Alle assays werden in drievoud uitgevoerd.}}

BrdU Incorporatie Test

De DNA-synthese werd gemeten met BrdU incorporatie door immunofluorescentie. Het zaaien hoeveelheid cellen werd ingesteld op een dichtheid van 70-80% confluentie bereiken op de dag van transfectie. Het plasmide pFlag-IQGAP1, pFlag-IQGAP1-C of pFlag-IQGAP1-N werd gecotransfecteerd met GFP plasmide BGC-823 cellen met gebruikmaking van Lipofectamine ™ 2000 zoals hierboven beschreven. 24 uur na transfectie werden de cellen serum verhongerd gedurende de nacht, behandeld met 200 μ
M BrdU en gedurende ongeveer 16 uur. De cellen werden vervolgens gewassen met PBS, gefixeerd in vers bereide 4% (v /v) paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 10 min, en gepermeabiliseerd met 0,5% (v /v) Triton X-100, gevolgd door incubatie met DNase I (0,5 U /ul) gedurende 30 minuten bij 37 ° C. De cellen werden geïncubeerd met primair antilichaam tegen BrdU overnacht bij 4 ° C gevolgd door Cy3-geconjugeerd secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Tenslotte kernen werden tegen gekleurd met Hoechst 33342 gedurende 15 minuten, gespoeld met PBS driemaal en gevisualiseerd onder fluorescentiemicroscopie. Elke test werd uitgevoerd in vierling en drie keer herhaald.

Co-immunoprecipitatie

Om de interactie tussen RhoC en IQGAP1, COS-7 en onderzoeken BGC-823 cellen werden co-geïnfecteerd met Ad- IQGAP1 of Ad-IQGAP1-C, en Ad-RhoC-V14 gedurende 48 uur en vervolgens werden gelyseerd met RIPA buffer zoals beschreven. Het antilichaam tegen RhoC, IQGAP1 of isotype IgG werd gebruikt voor immunoprecipitatie, respectievelijk. De immunoprecipitaten werden geanalyseerd door Western blotting zoals onder toepassing van anti-RhoC of anti-IQGAP1 antilichaam.

Immunofluorescentiemicroscopie

De cellen gekweekt op dekglaasjes werden gefixeerd met vers bereide 4% (v /v ) paraformaldehyde in PBS gedurende 15 min gepermeabiliseerd met 0,3% Triton X-100 in PBS gedurende 10 min, en geblokkeerd met 3% (w /v) runderserumalbumine (BSA) in PBS. Voor immunofluorescentie werden de cellen op dekglaasjes achtereenvolgens geïncubeerd met konijn polyklonaal antilichaam tegen IQGAP1 bij 4 ° C overnacht, FITC-geconjugeerd geit anti-konijn IgG gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, muizen monoklonaal antilichaam tegen RhoC gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en tenslotte geit anti-muis IgG geconjugeerd met Cy3 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Drie wassingen werden uitgevoerd na elk antilichaam incubatie. De kernen werden contra-gekleurd met Hoechst 33342. Het resultaat werd waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop geassembleerd met een CCD-camera (Leica).

Statistische analyse

De gegevens werden geanalyseerd met behulp van een tweezijdige ANOVA of student t
-test met SPSS statistische software, en uitgedrukt als gemiddelden ± standaarddeviatie (SD). P
. ≪ 0,05 werd beschouwd als significant

Resultaten

RhoC Bevorderd de verspreiding van BGC-823 Cells

Het effect van RhoC op celproliferatie was onderzocht. BGC-823 cellen werden geïnfecteerd met adenovirus dat codeert constitutief actieve RhoC en celproliferatie werd gedetecteerd door MTT assay. De resultaten toonden aan dat RhoC ook bevorderde de proliferatie van maagkanker cellen BGC-823. Overexpressie van RhoC-V14 in BGC-823 cellen veroorzaakte 48,7% toename van celproliferatie (Fig. 1A en B). Ondertussen, uitputting van RhoC door siRNA verlaagde de proliferatie van BGC-823 cellen met 43,1% (Fig. 1C en D).

IQGAP1 Verbeterde de verspreiding van BGC-823 cellen

(1) resultaten van MTT assay.

om de bijdrage van IQGAP1 om proliferatie te beoordelen, werd MTT-assay toegepast om de levensvatbaarheid van maagkanker cellijn BGC-823 detecteren. De resultaten toonden aan dat in vergelijking met controlecellen (Ad-LacZ groep), hoge expressie van het C-terminale fragment van IQGAP1 (Ad-IQGAP1-C-groep) of full length IQGAP1 (Ad-IQGAP1 groep) verhoogde celproliferatie door 116% en respectievelijk 39%, ( *
P < 0,05, *
P. < 0,05, figuur 2A en B). In tegenstelling, het N-terminale fragment van IQGAP1 heeft geen duidelijk effect op celproliferatie. Aan de andere kant, bemoeienis van IQGAP1 expressie met siRNA verlaagde celproliferatie met 43%, in vergelijking met de negatieve controle ( *
P. ≪ 0,05, figuur 2C en D). Deze resultaten gaven aan dat IQGAP1 kon celproliferatie te versnellen; de actieve domeinnaam is gelegen in het C-terminale fragment van het eiwit.

(2) De resultaten van BrdU incorporatie assay.

De BrdU incorporatie test leverde een patroon van de reactie vergelijkbaar met die waargenomen in MTT assay. Expressie van vlag-IQGAP1 en vlag-IQGAP1-C sterk bevorderd DNA-synthese om de niveaus bijna 1-flod en 2-voudige dan die waargenomen met Vlag-D1 (* P < 0,05, * P. ≪ 0,05, figuur 2E en F) , terwijl IQGAP1-N geen gevolgen hebben voor de DNA-synthese heeft aangetoond, wat erop wijst dat IQGAP1 anders regelt DNA-synthese via verschillende domeinen.

Associatie tussen RhoC en IQGAP1 in het stimuleren van proliferatie van BGC-823 Cells

(1) RhoC en IQGAP1 elkaar niet beïnvloeden de expressie.

de bovenstaande resultaten suggereren sterk dat zowel RhoC en IQGAP1 bijgedragen aan de toename van BGC-823 cellen. Om de mogelijke associatie tussen RhoC en IQGAP1 ontrafelen bij het reguleren van celproliferatie, we eerst onderzocht of IQGAP1 en RhoC beïnvloeden hun expressie elkaar. BGC-823 cellen werden getransfecteerd met siRNA de expressie van RhoC of IQGAP1 knockdown, en vervolgens respectievelijk geïnfecteerd met adenovirus dat codeert IQGAP1, IQGAP1-C of constitutief actieve RhoC. Western blotting werd toegepast om te detecteren of veranderen van de expressie en activiteit van een eiwit een invloed op de expressie van andere eiwitten of niet. De resultaten toonden aan dat het verhogen van exogene of endogene knockdown van IQGAP1 of IQGAP1-C, beïnvloedde de RhoC expressie. Evenzo toenemende constitutief actieve RhoC of interferentie van endogene RhoC beïnvloedde de expressie van IQGAP1 of IQGAP1-C (Fig. 3A).

(2) IQGAP1 is een effector van RhoC bij het stimuleren van celproliferatie.

MTT-bepaling werd toegepast om de relatie tussen RhoC en IQGAP1 ontrafelen in het stimuleren van proliferatie. De resultaten toonden aan dat RhoC-siRNA had geen duidelijk effect op de proliferatie door IQGAP1 (** P < 0,01, figuur 3B.). Echter, depletie van IQGAP1 expressie door siRNA blokkeerde de proliferatie veroorzaakt door expressie van constitutief actieve RhoC (* P < 0,05, ** P < 0,01, figuur 3C.). Dit gaf aan dat tijdens het proces van het stimuleren van proliferatie van BGC-823 cellen, RhoC vereist deelname van IQGAP1. Aangezien RhoC de verplichting inhoudt IQGAP1 terwijl IQGAP1 het effect RhoC vergde, RhoC kan het stroomopwaarts van IQGAP1 en nam IQGAP1 als effector.

Effect van RhoC en IQGAP1 de expressie van celcyclus verwante proteïnen

om verder te bevestigen proliferatie stimulerende effect van RhoC en IQGAP1 en onderzoek de mogelijke mechanisme waarmee deze eiwitten reguleren celproliferatie, pasten wij Western blotting om de expressie van celcyclus verwante proteïnen in cellen behandeld met werkwijzen detecteren het verhogen of verlagen RhoC en IQGAP1. De resultaten toonden aan dat de toename van RhoC en IQGAP1 stimuleerde de expressie van cycline E en cycline D1, terwijl het geen effect van de expressie van cycline B CDK1 /2 hebben. Anderzijds was de daling van RhoC en IQGAP1 remde de expressie van cycline E en cycline D1. Ondertussen, bij RhoC silencing door siRNA verhogen IQGAP1 of IQGAP1-C nog versterken de expressie van cycline E en cycline D1 (Fig. 4). Scripties resultaten bleek dat RhoC en IQGAP1 de wildgroei kan reguleren door middel van het veranderen van de expressie van celcyclus-gerelateerde eiwitcomplexen en het veroorzaken van meer cellen naar de S-fase in te voeren.

RhoC en IQGAP1 Co-gelokaliseerde en Bound elkaar in Cells

Immunofluorescentie en Co-immunoprecipitatie methode werd toegepast om de mogelijke binding tussen RhoC en IQGAP1 verder te onderzoeken. Beide BGC-823 en COS-7-cellen werden co-geïnfecteerd met Ad-IQGAP1 en Ad-RhoC-V14 of Ad-IQGAP1-C en Ad-RhoC-V14 gedurende 48 uur, en de totale cellysaat werd immunogeprecipiteerd met anti-RhoC antilichaam en gemerkt met antilichaam tegen IQGAP1 of immunogeprecipiteerd met anti-IQGAP1 antilichaam en gemerkt met antilichaam tegen RhoC respectievelijk. De resultaten toonden RhoC en IQGAP1 verbonden elkaar, met C-terminale fragment van IQGAP1 als de bindingsplaats met RhoC (Fig. 5A en C). Bovendien immunofluorescentie assay bleek dat IQGAP1 voornamelijk verspreid in het cytoplasma waar het co-gelokaliseerd met RhoC (Fig. 5B en D).

Discussie

Ongecontroleerde kankercelproliferatie vereist de gecoördineerde en strak gereguleerd functie van veel eiwitten [23], [24], [25], [26]. Het is daarom van essentieel belang het mechanisme van hoe deze eiwitten interageren bij het reguleren van de proliferatie van kankercellen te bestuderen. Onze eerdere resultaten hebben aangetoond dat de expressie van IQGAP1 en RhoC bij maagkanker weefsels en kankercellijnen [21] verhoogd. Het niveau van hun uitingen een significante correlatie met de slechte differentiatie van maagkanker. Het is echter niet duidelijk over of IQGAP1 en RhoC zijn geassocieerd met celproliferatie in tumorigenensis. In deze studie, de expressie van IQGAP1 en RhoC en hun biologische activiteiten bij maagkanker cellijn BGC-823 werden aangepast door middel van een infectie met adenovirale constructen of transfectie met plasmide DNA of siRNA. De proliferatie van de cellen werd vervolgens onderzocht met behulp van BrdU incorporatie assay en MTT methode. De resultaten toonden aan dat constitutief actieve RhoC aanzienlijk bevorderde de proliferatie activiteit van maagkanker cellijn BGC-823 en uitputting van RhoC door siRNA remde de eigenschappen. Onderzoeksgegevens blijkt dat RhoC had een belangrijke rol bij celmigratie en metastase [27], [28], [29], [30], [31], maar er waren enkele tegenstrijdigheden over of RhoC regelen het transformatieproces en proliferatie in tumorcellen [27], [29], [32]. Onze resultaten tonen dat RhoC hebben proliferatie stimulerend effect op maagkanker cellen. Dit zal nuttig zijn bij het ophelderen van de rol van RhoC bij het reguleren van de proliferatie van kankercellen.

De resultaten toonden aan dat vergelijkbaar RhoC, over-expressie van exogene IQGAP1 en IQGAP1-C ook bevorderde de proliferatie van BGC-823 cellen, dat knockdown van endogene IQGAP1 verzwakt het vermogen proliferatie van de cellen, wat aangeeft dat IQGAP1 ook bijdraagt ​​tot celproliferatie regeling. Gezien het feit dat zowel RhoC en IQGAP1 zijn rol in het reguleren van de proliferatie van kankercellen en hun uitingen waren sterk gecorreleerd, we verder onderzocht de functionele associatie tussen RhoC en IQGAP1. De resultaten toonden aan dat in BGC-823 cellen met knock-down van IQGAP1 expressie infectie met adenovirus dat codeert constitutief actieve RhoC kan de proliferatie activiteit niet meer te stimuleren; terwijl in BGC-823 cellen met knock-down van RhoC expressie, overexpressie IQGAP1 of IQGAP1-C door middel van het infecteren van de cellen met adenovirus dat codeert voor het overeenkomstige DNA nog steeds veroorzaakt hogere proliferatie activiteit. Dit gaf aan dat RhoC reed tumorproliferatie tot IQGAP1, met name door het C-terminale fragment van IQGAP1. Deze functionele verband tussen RhoC en IQGAP1 werd verder ondersteund door co-immunoprecipitatie en immunofluorescentie. Deze resultaten suggereerden dat RhoC heeft IQGAP1 als effector bij het reguleren van de proliferatie van kankercellen, gooien nieuwe hint over de relatie van deze eiwitten.

primair staand stroomafwaartse mechanisme waardoor RhoC /IQGAP1 regelen de proliferatie van kankercellen maag we onderzochten het effect van RhoC /IQGAP1 op de expressie van celcyclus verwante proteïnen, met inbegrip van cycline E, cycline D1, cycline B en cycline afhankelijke kinase (CDK). De resultaten toonden dat zowel RhoC en IQGAP1 stimuleerde de expressie van cycline E en cycline D1, maar had geen effect op de expressie van cycline B CDK. De proliferatie van eukaryotische cellen wordt gecontroleerd op bepaalde punten in de celcyclus, met name in de eerste fase spleet (G1) naar de DNA synthetische fase (s) en de tweede spleet fase (G2) mitose (M) overgangen. Waarvan de G1-S overgang is de voornaamste regelpunt van de celcyclus. Cycline D1 en cycline E bestuurt de cel voortgang door bevordering G1 naar S-fase van de celcyclus. Onze resultaten suggereren dat wanneer RhoC werd geactiveerd door extracellulaire of intracellulaire signaal niet gebonden aan IQGAP1 en beïnvloedde de expressie van celcyclus verwante proteïnen die direct of indirect via onduidelijkheden signaaltransductie stappen, die uiteindelijk kunnen leiden tot de verandering van cel progressie proliferatie (fig. 6).

Kortom, deze signalen van huidige studie, tezamen met eerder gepubliceerde gegevens [21], ondersteunen de hypothese dat RhoC deelneemt in zowel migratie en proliferatie van maagkanker cellen. IQGAP1 ook de regulering van de kankercel proliferatie deelnemen als een stroomafwaartse effector van RhoC. Deze gegevens kunnen lichten schijnen op de ontwikkeling van therapeutische benaderingen voor maagkanker.

Dankwoord

Wij danken Dr Gerry Boss en Dr. Renate Pilz in de University of California, San Diego, CA, USA, voor het soort geschenken van de adenovirale constructen.

• PLoS ONE: Polymorfismen in ERCC1 en XPF Genen en risico van maagkanker in een Oost-Chinese Population
• PLoS ONE: Reg IV is een directe doel van Intestinal transcriptiefactor CDX2 bij maagkanker