PLOS ONE: RhoC Regula a proliferação de células de câncer gástrico através da interação com IQGAP1

Abstract

Os resultados de pesquisas anteriores mostraram que tanto Ras membro da família homólogo C (RhoC) e IQ-domínio da proteína de activação de GTPase 1 (IQGAP1) foram sobre-expressos em tecidos de câncer gástrico e células, mas a sua papel na tumorigenensis não foi abordada de forma clara. Aqui relatamos a proliferação efeito de RhoC IQGAP1 e em células de cancro gástrico e a interacção entre duas proteínas na regulação da proliferação de células de cancro gástrico estimulante. Plasmídeos e construções virais que codificam alvo ARNsi e DNA foram usadas para alterar a expressão de RhoC e IQGAP1. método MTT e teste de incorporação de BrdU foram utilizados para analisar o efeito de RhoC e estruturas diferentes de IQGAP1 em proliferação. Os níveis de proteína de IQGAP1 RhoC e em linhas celulares foram detectados por Western blotting. imunofluorescência e Co-imunoprecipitação foram aplicados para investigar a localização e vinculativo entre RhoC e IQGAP1. Os resultados mostraram que RhoC, IQGAP1 e o fragmento C-terminal de IQGAP1 estimulou significativamente a proliferação de células de cancro gástrico, e aumentou a expressão de ciclina E e ciclina D1. Em contraste, a redução da IQGAP1 endógena ou RhoC por ARNsi atenua a proliferação celular. A depleção de expressão IQGAP1 por siARN bloqueou significativamente a actividade proliferativa de RhoC constitutivamente activa, enquanto RhoC silenciamento por ARNsi não teve nenhum efeito sobre a proliferação induzida por IQGAP1 em células de cancro gástrico. Co-imunoprecipitação e imunofluorescência mostrou que RhoC e IQGAP1 ligados uns aos outros. Em conclusão, nossos resultados sugerem que RhoC estimula a proliferação de células cancerosas gástricas através IQGAP1 de recrutamento como um efetor

Citation:. Wu Y, Tao Y, Chen Y, Xu W (2012) RhoC Regula a Proliferação de gástrico As células cancerosas através da interação com IQGAP1. PLoS ONE 7 (11): e48917. doi: 10.1371 /journal.pone.0048917

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 26 de junho de 2012; Aceito: 02 de outubro de 2012; Publicação: 07 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Fundo de Investigação especializada para o Programa Senior Pessoal da Universidade de Jiangsu (Sem. 11JDG114) ea National Science Foundation Natural da China (n. 31.040.002). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

GTPases Rho podem induzir certos transdução de sinal intracelular e impacto diversas atividades celulares, incluindo a reorganização do citoesqueleto de actina, a transcrição de genes, a sobrevivência, a proliferação e [1], [2]. Embora três isoformas de Rho, RhoA, RhoB, e RhoC, exibem mais de 85% de identidade de aminoácidos, que conferem diferenças na função das células [3]. proteínas RhoA e RhoC têm mostrado ter um papel positivo na proliferação e transformação maligna [4], [5], [6], ao passo que o papel de RhoB nestes processos parece ser mais divergente [7], [8]. A maioria dos estudos demonstrou que RhoC tinha múltiplas funções em metástase tumoral, orquestrar a acção de vários efectores a jusante, a degradação e a reconstrução da matriz extracelular (ECM). No entanto, continua a existir alguma controvérsia sobre o papel de RhoC na regulação da proliferação celular [9], [10], [11], [12]. Os resultados de laboratório Pilha indicou que RhoA e RhoC siRNA representam ferramentas poderosas para inibir a proliferação de células do cancro, invasão e angiogénese tanto in vitro
e in vivo
[9]. Sun et ai, achou que a injecção intratumoral de RhoA RhoC ou siRNA para ratinhos nus pode inibir o crescimento de tumores [13]. Em contraste, Faried et al
informou que RhoA promove o crescimento do tumor mais de RhoC, enquanto RhoC induz metástases à distância em comparação com RhoA [11], de acordo com essas observações por Clark e colegas [14]. Um estudo realizado por Ikoma e colegas mostraram que RhoC não afetou o crescimento do tumor, mas melhora a natureza metastática do câncer de pulmão, estimulando a motilidade celular [10]. Portanto, mais estudos são necessários para identificar o papel de RhoC na regulação das actividades biológicas de células tumorais.

IQ-domínio GTPase-activating proteínas (IQGAPs) são importantes reguladores dos processos celulares que incluem rearranjos do citoesqueleto na migração celular , proliferação e citocinese [15], [16], [17]. IQGAP1 é um dos membros das três IQGAPs de mamíferos e afins mudança na expressão ou função IQGAP1 intracelular foi relatado para alterar as actividades de células [17], [18], [19], [20]. Como uma proteína andaime, IQGAP1 liga-se múltiplas proteínas, tais como oncogenes β-catenina e Src, supressor tumoral de E-caderina e a Rho GTPases Cdc42 e Rac1, e faz com que a alteração de comportamentos celulares, especialmente para células cancerosas. O nosso estudo anterior mostrou que a expressão mais elevados de RhoC IQGAP1 e em tecido de cancro gástrico foram significativamente inversamente correlacionadas com a diferenciação das células de cancro gástrico [21]. Além disso, os níveis da proteína são também relevantes para a proliferação e a migração das células cancerosas. Por conseguinte, os autores sugerem que tanto RhoC IQGAP1 e pode desempenhar um papel importante na transformação de células de cancro e proliferação e há uma associação de potencial entre eles. Na presente pesquisa, estudamos a influência da RhoC e diferentes estruturas de IQGAP1 sobre a proliferação de células cancerosas e ciclo celular proteínas relacionadas. Nós também investigou a relação entre as duas moléculas através da aplicação conjunta de interferência siRNA e técnica de infecção viral.

Materiais e Métodos

Reagentes

As linhas celulares de cancro gástrico BGC-823 [22] e africanas verdes de rim de macaco linhas celulares de fibroblastos COS-7 foram fornecidos pelo Instituto de Biologia celular (Xangai, China). A proteína fluorescente verde (GFP) e o reagente de transfecção de plasmídeo de células Lipofectamin ™ 2000 eram da Invitrogen (Carlsbad, CA); Os plasmídeos que codificam Bandeira com etiquetas IQGAP1 (pFlag-IQGAP1), bandeira etiquetado fragmento IQGAP1 C-terminal (pFlag-IQGAP1-C), e Bandeira com etiquetas fragmento IQGAP1 N-terminal (pFlag-IQGAP1-N), e vectores adenovirais codificando β-galactosidase (pAD-LacZ), uma forma constitutivamente activa de RhoC (pAD-RhoC-V14), comprimento total IQGAP1 (pAD-IQGAP1) e o fragmento C-terminal de IQGAP1 (pAD-IQGAP1-C) foram presentes amáveis ​​de Dr. Gerry chefe e Dr. Renate Pilz na Universidade da Califórnia, San Diego, EUA. Humano-EGF, BrdU, o anticorpo anti-BrdU rato, ADNase I, MTT, Hoechst 33342, anticorpos secundários FITC e Cy3 foram conjugados a partir de Sigma (St. Louis, MO). O anticorpo anti-IQGAP1 (contra o fragmento N-terminal, aa 314-422), anticorpo anti-RhoA, anticorpo anti-IgG, anti-anticorpo CDK1 /CDK2, RNAs curtos interferente (siRNA) para RhoC e controlo negativo eram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). O Rho C siRNA é uma piscina de específica do destino marco 20-25 nt siRNAs projetado para derrubar a expressão gênica com as sequências da seguinte forma: sequence1, sentir antisense 5'-CUACUGUCUUUGAGAACUAtt-3'and 5'-UAGUUCUCAA- AGACAGUAGtt-3 '; Sequence2, sentido 5'-GCAGGAAGACUAUGAUCGAtt-3 'e anti-sentido 5'-UCGAUCAUAGUCUUCCUGCtt-3'; sequence3, sentido 5'-CAC-ACCAGCACUUUAUACAtt-3 'e anti-sentido 5'-UGUAUAAAGUGCUGGUGUG- TT-3'. O anticorpo anti-IQGAP1 (contra o fragmento C-terminal correspondente aos aminoácidos 863-1657 de IQGAP1 humana) foi de Millipore (Billerica, MA). O anticorpo anti-RhoC foi de Abcam (Cambridge, MA). O anticorpo anti-ciclina B foi de Bioworld Tecnologia (St. Louis Park, MN). O anticorpo anti-ciclina D1 e o anticorpo anti-ciclina E eram de Boster (Wuhan, China). O siRNA para IQGAP1 foi sintetizado pela Qiagen (Valencia, CA), a sequência alvo foi IQGAP1 5'-AAGTTCTACGGGAAGTAATTG-3 '(5058-5078 pb). A peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo secundário era de Rockland Immunochemicals (Gilbertsville, PA). Proteína G Plus /Proteína A-agarose foi de Calbiochem (San Diego, CA). Electroquimioluminescência (ECL) reagentes eram da Millipore (Billerica, MA). Todos os reagentes utilizados neste estudo foram de grau analítico.

cultura de células, transfecção e Infecção

BGC-823 e as células COS-7 foram cultivadas em 1 × meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) a 37 ° C em 5% de CO _{2 atmosfera. O meio foi mudado a cada dois dias e as células foram sub-cultivadas a confluência. Para a transfecção, as células foram sub-cultivadas um dia antes do processo e a transfecção de células gástricas cancerosas com plasmídeos ou siARN foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Para a infecção, as células 293A foram transfectadas com vectores adenovirais pAd-LacZ, pAd-RhoC-V14, pAd-IQGAP1 e DAP-IQGAP1-C, e as partículas virais produzidas pelas células foram colhidas e amplificado. Os vírus foram nomeados Ad-LacZ, Ad-RhoC-14, Ad-IQGAP1 e Ad-IQGAP1-C, respectivamente, e foram usadas para infectar as células BGC-823. No dia antes da infecção, BGC-823 células foram recém-semeadas a 70-80% de confluência e o processo de infecção foi realizada de acordo com as instruções do fabricante em segundo dia.}

Western Blot

Cultivadas As células foram lavadas três vezes em PBS e lisadas com tampão RIPA (Tris-HCl a 50, pH 7,4, 1% (v /v) de Triton X-100, EDTA a 1 mM, leupeptina 1 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, NaF 10 mM , Na 1 mM _{3VO 4). Quantidades iguais de proteína foram separadas por 8% ou 12% SDS-PAGE de acordo com o peso molecular de proteína. Os anticorpos primários foram incubados durante a noite a 4 ° C, e os correspondentes anticorpos secundários foram incubados durante 1 h a RT. Três lavagens foram realizadas com TBS /T após cada incubação do anticorpo. reagentes de ECL foram usadas para mostrar as bandas positivas na membrana.}

Ensaio MTT

0,5-1 × 10 ^{3cells em 150 uL de meio foram plaqueadas no poço de 96 poços pratos. Após a fixação, as células foram infectadas com adenovírus correspondente durante 48 h, ou transfectadas com ARNsi durante 72 h, respectivamente. Em grupos de combinação, as células foram transfectadas com ARNsi de segmentação RhoC ou IQGAP1 durante 24 h e, em seguida, infectadas com Ad-IQGAP1-C /Ad-IQGAP1 ou Ad-RhoC-V14 por um adicional de 48 h a 37 ° C em 5% de CO _{2. As células cultivadas foram lavadas com PBS, tratadas com 20 ul de MTT (0,5 mg /ml), e, em seguida, incubadas a 37 ° C durante 1 h. O meio foi removido e 100 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) foram adicionados a cada poço. A absorvância foi determinada a 490 nm usando o leitor de microplacas. Todos os ensaios foram realizados em triplicado.}}

Ensaio de Incorporação de BrdU

A taxa de síntese de ADN foi medida com incorporação de BrdU por imunofluorescência. A quantidade de semeadura das células foi ajustada para atingir uma densidade de 70-80% de confluência no dia da transfecção. O plasmídeo pFlag-IQGAP1, pFlag-IQGAP1-C ou pFlag-IQGAP1-N foi co-transfectado com o plasmídeo de GFP em células BGC-823 usando Lipofectamin ™ 2000, como descrito acima. 24 h após a transfecção, as células foram privadas de soro durante a noite, tratou-se com 200 μ M
BrdU e incubou-se durante cerca de 16 h. As células foram então lavadas com PBS, fixadas em recém-preparado de 4% (v /v) de paraformaldeído à temperatura ambiente durante 10 min, e permeabilizadas com 0,5% (v /v) de Triton X-100, seguida por incubação com ADNase I (0,5 U /ul) durante 30 minutos a 37 ° C. As células foram incubadas com o anticorpo primário contra BrdU durante a noite a 4 ° C seguido por anticorpo secundário conjugado com Cy3 durante 1 h a RT. Finalmente, os núcleos foram contra-coradas com Hoechst 33342 durante 15 minutos, lavado com PBS por três vezes e visualizados sob microscopia de fluorescência. Cada ensaio foi realizado em quádruplo e repetiu três vezes.

Co-imunoprecipitação

Para investigar a interação entre RhoC e IQGAP1, COS-7 e BGC-823 células foram co-infectados com Ad- IQGAP1 ou Ad-IQGAP1-C, e Ad-RhoC-V14 durante 48 h e depois foram lisadas com tampão RIPA como descrito. Utilizou-se o anticorpo contra RhoC, IQGAP1 ou isotipo IgG para imunoprecipitação, respectivamente. Os imunoprecipitados foram analisados ​​por Western blot como descrito acima, utilizando anticorpos anti-anti-RhoC ou IQGAP1 anticorpo.

Microscopia de imunofluorescência

As células cultivadas sobre lamelas foram fixadas com 4% preparado de fresco (v /v ) de paraformaldeído em PBS durante 15 min, permeabilizadas com 0,3% de Triton X-100 em PBS durante 10 min e bloqueadas com 3% (w /v) de albumina de soro bovino (BSA) em PBS. Para imunofluorescência, as células em lamelas foram sequencialmente incubadas com anticorpo policlonal de coelho contra IQGAP1 a 4 ° C durante a noite, conjugado com FITC de IgG de cabra anti-coelho para 1 h, à RT, o anticorpo monoclonal de ratinho contra RhoC durante 2 h à TA, e finalmente IgG anti-ratinho de cabra conjugado com Cy3 durante 1 h à TA. Três lavagens foram realizadas depois de cada incubação do anticorpo. Os núcleos foram contra-coradas com Hoechst 33342. O resultado foi observado sob um microscópio de fluorescência montado com uma câmera CCD (Leica).

Análise Estatística

Os dados foram analisados ​​usando um dois-atados ANOVA ou estudante do t
-teste com software estatístico SPSS, e expresso como média ± desvio padrão (SD). P
. ≪ 0,05 foi considerado significativo

Resultados

RhoC Promovido a Proliferação de BGC-823 Cells

O efeito da RhoC na proliferação celular foi também investigada. Células BGC-823 foram infectadas com adenovírus codificador RhoC constitutivamente activa e a proliferação de células foi detectada por ensaio MTT. Os resultados mostraram que RhoC também promoveu a proliferação de células de cancro gástrico BGC-823. A sobre-expressão de RhoC-V14 em células BGC-823 provocou um aumento de 48,7% na proliferação celular (Fig. 1A e B). Enquanto isso, o esgotamento dos RhoC por siRNA reduziu a proliferação de células BGC-823 por 43,1% (Fig. 1C e D).

IQGAP1 reforçada a Proliferação de BGC-823 Cells

(1) resultados do ensaio de MTT.

para avaliar a contribuição de IQGAP1 de proliferação, um ensaio MTT foi utilizado para detectar a viabilidade da linha celular de cancro gástrico BGC-823. Os resultados mostraram que, em comparação com células de controlo (Ad-LacZ grupo), de alta expressão do fragmento C-terminal de IQGAP1 (Ad-IQGAP1-grupo C) ou IQGAP1 comprimento completo (grupo Ad-IQGAP1) promoveu a proliferação de células de 116% e 39%, respectivamente ( *
P < 0,05, *
P <. 0,05, Fig 2A e B). Em contraste, o fragmento N-terminal de IQGAP1 tem nenhum efeito óbvio sobre a proliferação celular. Por outro lado, a interferência de expressão IQGAP1 com siRNA reduziu a proliferação celular em 43%, comparado com o controlo negativo ( *
P <. 0,05, Fig 2C e D). Estes resultados indicaram que IQGAP1 foi capaz de acelerar a proliferação das células; o domínio activo foi localizado no fragmento C-terminal da proteína.

(2) Resultados do ensaio de incorporação de BrdU.

O ensaio de incorporação de BrdU produziu um padrão de resposta semelhante à observada em ensaio MTT. Expressão da Bandeira-IQGAP1 e Flag-IQGAP1-C acentuadamente promovida a síntese do ADN para níveis quase 1-flod e duas vezes do que o observado com a bandeira-D1 (* P < 0,05, * P <. 0,05, Fig 2E e F) , enquanto IQGAP1-N não mostraram efeitos sobre a síntese de DNA, sugerindo que IQGAP1 diferente regula a síntese de DNA através de diferentes domínios.

Associação entre RhoC e IQGAP1 na estimulação da proliferação da BGC-823 Cells

(1) e RhoC IQGAP1 não afectou a expressão entre si.

os resultados acima sugerem fortemente que ambos RhoC IQGAP1 e contribuíram para a proliferação de células BGC-823. A fim de elucidar a possível associação entre RhoC e IQGAP1 na regulação da proliferação celular, que, em primeiro lugar investigado se IQGAP1 e RhoC afectar a sua expressão entre si. Células BGC-823 foram transfectadas com ARNsi de knockdown da expressão de RhoC ou IQGAP1, e, em seguida, foram infectadas com adenovírus codificador IQGAP1, IQGAP1-C ou RhoC constitutivamente activa, respectivamente. Western blotting foi aplicado para detectar se a alteração da expressão e actividade de uma proteína pode afectar a expressão da proteína ou outra não. Os resultados mostraram que o aumento exógeno ou endógeno knockdown de IQGAP1 ou IQGAP1-C, não afectou a expressão RhoC. De modo semelhante, aumentando RhoC constitutivamente activa ou interferência de RhoC endógena não afectou a expressão de IQGAP1 ou IQGAP1-C (Fig. 3A).

(2) IQGAP1 era um efector de RhoC na estimulação da proliferação das células.

ensaio MTT foi utilizado para elucidar a relação entre RhoC IQGAP1 e na estimulação da proliferação. Os resultados mostraram que RhoC siRNA teve efeito sobre a proliferação não é óbvio causada por IQGAP1 (** P < 0,01, Figura 3B.). No entanto, a depleção de expressão IQGAP1 por siARN bloqueou a proliferação causada por expressão de RhoC constitutivamente activa (* P < 0,05, ** P < 0,01, Figura 3C.). Isto indicou que, durante o processo de estimular a proliferação de células BGC-823, RhoC necessária a participação de IQGAP1. Além disso, uma vez que o efeito do RhoC necessária IQGAP1 enquanto o efeito da IQGAP1 não requerem RhoC, RhoC pode ser a montante de IQGAP1 e levou IQGAP1 como um efector.

Efeito do RhoC e IQGAP1 sobre a expressão do ciclo celular As proteínas relacionadas

para confirmar ainda mais o efeito de proliferação estimulante de RhoC e IQGAP1 e investigar o possível mecanismo através do qual estas proteínas regulam a proliferação das células, foi aplicado transferência de Western para detectar a expressão de proteínas relacionadas com o ciclo celular em células tratadas com métodos de aumentando ou diminuindo RhoC e IQGAP1. Os resultados mostraram que o aumento de RhoC e IQGAP1 estimulou a expressão de ciclina E e ciclina D1, ao mesmo tempo que não teve nenhum efeito da expressão de ciclina CDK1 e B /2. Por outro lado, a diminuição do RhoC e IQGAP1 inibiu a expressão de ciclina E e ciclina D1. Entretanto, no caso de RhoC silenciamento por ARNsi, aumentando IQGAP1 ou IQGAP1-C ainda aumentar a expressão de ciclina E e ciclina D1 (Fig. 4). Estes resultados indicaram que RhoC e IQGAP1 pode regular a proliferação através da alteração da expressão da proteína ciclo relacionado celular e causar mais células para entrar na fase S.

RhoC e IQGAP1 Co-localizados e encadernado uns aos outros em células

imunofluorescência e método de co-imunoprecipitação foram aplicados a analisar a possível ligação entre RhoC e IQGAP1. Ambos BGC-823 e COS-7 foram co-infectadas com Ad-IQGAP1 e Ad-RhoC-V14 ou Ad-IQGAP1-C e Ad-RhoC-V14 durante 48 h, e o lisado de células totais foram imunoprecipitados com anticorpo anti-RhoC anticorpo e sondadas com anticorpo contra IQGAP1, ou imunoprecipitados com anticorpo anti-IQGAP1 e sondadas com anticorpo contra RhoC, respectivamente. Os resultados mostraram RhoC e IQGAP1 ligados uns aos outros, com o fragmento C-terminal de IQGAP1 como o sítio de ligação com RhoC (Fig. 5A e C). Além disso, teste de imunofluorescência revelou que IQGAP1 foi distribuído principalmente no citoplasma, onde ele co-localizada com RhoC (Fig. 5B e D).

Discussão

proliferação de células cancerígenas descontrolado requer a coordenação e função fortemente regulada de muitos proteínas [23], [24], [25], [26]. É, portanto, crucial para estudar o mecanismo de como essas proteínas interagem na regulação da proliferação de células cancerosas. Os nossos resultados anteriores têm documentado que a expressão de IQGAP1 e RhoC foram aumentadas em tecidos de cancro gástrico e linhas celulares de cancro [21]. O nível de suas expressões tinha uma correlação significativa com os pobres diferenciação de câncer gástrico. No entanto, não é bastante clara sobre se IQGAP1 RhoC e estão associados com a proliferação de células em tumorigenensis. Neste estudo, o nível de expressão de IQGAP1 e RhoC e as suas actividades biológicas na linha celular de cancro gástrico BGC-823 foram ajustados através de infecção com construções adenovirais ou transfecção com ADN de plasmídeo ou ARNsi. A proliferação das células foi então investigada utilizando um ensaio de incorporação de BrdU e método de MTT. Os resultados mostraram que RhoC constitutivamente activa promovida de forma significativa a actividade de proliferação de linha celular de cancro gástrico BGC-823, e depleção de RhoC por siARN inibiu os traços. Os dados da pesquisa mostraram que RhoC teve um papel importante na migração celular e metástase [27], [28], [29], [30], [31], mas houve algumas contradições sobre se RhoC regular o processo de transformação e proliferação em células de tumor [27], [29], [32]. Nossos resultados fornecem evidências de que RhoC têm efeito estimulante sobre a proliferação de células cancerosas gástricas. Isto irá ser útil para elucidar o papel do RhoC na regulação da proliferação de células cancerosas.

Os nossos resultados mostraram que a RhoC semelhante, a sobre-expressão de IQGAP1 exógeno e IQGAP1-C também promoveu a proliferação de células BGC-823, Considerando knockdown de IQGAP1 endógena atenuou a capacidade de proliferação da célula, indicando que IQGAP1 também contribui para a regulação da proliferação celular. Considerando que tanto RhoC e IQGAP1 tem papel na regulação da proliferação de células cancerígenas e suas expressões foram altamente correlacionados, nós explorada a associação funcional entre RhoC e IQGAP1. Os resultados mostraram que as células em BGC-823 com knock-down de expressão IQGAP1, infecção com adenovírus codificador RhoC constitutivamente activa não podia estimular mais a actividade de proliferação; enquanto as células em BGC-823 com knock-down de expressão RhoC, a sobre-expressão IQGAP1 ou IQGAP1-C através de infectar as células com o adenovírus que codificam o DNA correspondente ainda causou maior actividade de proliferação. Isto indicou que RhoC dirigimos a proliferação do tumor através IQGAP1, especificamente através do fragmento C-terminal de IQGAP1. Esta associação funcional entre RhoC e IQGAP1 foi ainda apoiada por Co-imunoprecipitação e imunofluorescência. Estes resultados sugeriram que RhoC levou IQGAP1 como um efector na regulação da proliferação de células de cancro, jogando nova sugestão sobre a relação destas proteínas.

Para explorar principalmente o mecanismo através do qual a jusante RhoC /IQGAP1 regular a proliferação de células de cancro gástrico , investigaram o efeito de RhoC /IQGAP1 sobre a expressão de proteínas relacionadas com o ciclo celular, incluindo ciclina e, ciclina D1, ciclina B e ciclina dependente da cinase (CDK). Os resultados mostraram que tanto RhoC e IQGAP1 estimulou a expressão de ciclina E e ciclina D1, mas não teve nenhum efeito sobre a expressão da ciclina B e CDK. A proliferação de células eucarióticas é controlada em pontos específicos no ciclo celular, em particular na primeira fase de intervalo (G1) para a fase (S) de DNA-sintético e a segunda fase de intervalo (G2) para transições de mitose (M). Dos quais, as transições de G1-S é o principal ponto de regulação do ciclo celular. Ciclina D1 e ciclina E controlar a progressão das células através da promoção de G1 para a fase S do ciclo celular. Os nossos resultados sugerem que, quando RhoC foi activado pelo sinal extracelular ou intracelular, é obrigado a IQGAP1 e, em seguida, influenciaram a expressão de proteínas relacionadas com o ciclo de células, directa ou indirectamente, através de alguns passos de transduo de sinal pouco claras, o que poderia eventualmente conduzir à mudança de progressão de células e proliferação (Fig. 6).

em conclusão, estes dados do presente estudo, em conjunto com dados publicados anteriormente [21], apoiar a hipótese de que RhoC participa tanto migração e proliferação de células cancerosas gástricas. IQGAP1 também participam da regulação da proliferação de células de câncer como um efetor a jusante da RhoC. Estes dados podem brilhar luzes sobre o desenvolvimento de abordagens terapêuticas para o câncer gástrico.

Reconhecimentos

Agradecemos Dr Gerry chefe eo Dr. Renate Pilz na Universidade da Califórnia, San Diego, CA, EUA, para o tipo de presentes de construções adenovirais.

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