PLoS ONE: prognostische Bedeutung von Tag SNP rs1045411 in HMGB1 des aggressiven Magenkrebs in einem chinesischen Population

Abstrakt

Zwingende Beweise haben vorgeschlagen, dass High Mobility Group-Box-1 (HMGB1) Gen spielt eine entscheidende Rolle in Krebsentstehung und Progression. Diese Studie soll die Auswirkungen von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) in HMGB1
Gen auf das Überleben von Magenkrebs (GC) der Patienten zu bewerten. Drei Tag SNPs von HMGB1
Gen wurden ausgewählt und Genotypisierung unter Verwendung von Sequenom iPEX Genotypisierung System in einer Kohorte von 1030 GC-Patienten (704 in Trainingssatz, 326 in Validierungssatz). Multivariate Cox Proportional Hazard Modell und Kaplan-Meier-Kurven wurden für die Prognose-Analyse verwendet. AG /AA-Genotypen von SNP rs1045411 in HMGB1
Gen mit einer besseren Gesamtüberleben signifikant assoziiert waren (OS) in einem Satz von 704 GC-Patienten im Vergleich mit GG Genotypen (HR = 0,77, 95% CI: 0,60-0,97 P
= 0,032). Diese prognostischen Effekt wurde in einem unabhängigen Validierungssatz überprüft und gepoolten Analyse (HR = 0,80, 95% CI: 0,62-0,99, P
= 0,046; HR = 0,78, 95% CI: 0,55-0,98, P
= 0,043, respectively). Im Schicht Analyse war die Schutzwirkung von rs1045411 AG /AA-Genotypen prominent bei Patienten mit negativen Schichten, im Vergleich zu Patienten mit günstigen Schichten. Weiterhin starke gemeinsame prädiktive Auswirkungen auf OS von GC Patienten wurden zwischen rs1045411 Genotypen und Lauren Klassifikation, Differenzierung, Bühne oder adjuvante Chemotherapie zur Kenntnis genommen. Zusätzlich zeigte funktionellen Test einen signifikanten Effekt von rs1045411 auf HMGB1
Ausdruck. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass rs1045411 in HMGB1
signifikant mit den klinischen Ergebnissen der chinesischen GC Patienten nach der Operation verbunden ist, vor allem bei Patienten mit aggressiven Status, die in anderen ethnischen Bevölkerungsgruppen eine weitere Validierung garantiert

Citation.: Bao G, Qu F, He L, Zhao H, Wang N, Ji G, et al. (2016) prognostische Bedeutung von Tag SNP rs1045411 in HMGB1
des aggressiven Magenkrebs in einem chinesischen Bevölkerung. PLoS ONE 11 (4): e0154378. doi: 10.1371 /journal.pone.0154378

Editor: Qing-Yi Wei, Herzog Cancer Institute, UNITED STATES

Empfangen: 23. Januar 2016; Akzeptiert: 12. April 2016; Veröffentlicht am: 26. April 2016

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Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse unterstützt wurde von National Natural Science Foundation of China (Nr 81272201 und Nr 81572916 GB; Nr 81200330 bis NW)

konkurrierende Interessen:. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

.
Einführung

Magenkrebs (GC) ist die vierthäufigste Krebs in der Welt, was etwa 8% der neuen Krebserkrankungen und 10% der Todesfälle durch Krebs [1]. Von diesen Fällen traten 70% in den Entwicklungsländern, und die Hälfte der Weltbevölkerung in Ost- Asien, vor allem in China [2]. In den letzten Jahrzehnten trotz der deutlichen Zunahme der Investitionen und Fortschritte in der Diagnose und Behandlung von GC ist das Gesamtüberleben (OS) für fortgeschrittene GC noch düster, mit einem 5-Jahres-Überlebensrate von weniger als 25% [3 ]. Derzeit hängt das Überleben und die Prognose von Patienten GC noch auf dem Stadium des Tumors zum Zeitpunkt der Diagnose. Jedoch aufgrund der deutlich wichtige Unterschiede innerhalb der gleichen Stufe, allein Tumorstadium ist nicht ausreichend, um die Prognose von GC vorherzusagen [4]. Daher neuartige molekulare Signaturen zu entdecken als zuverlässige prognostische Marker für GC ist sehr wichtig und anspruchsvoll. In den letzten Jahren Studien haben sich auf die Untersuchung von genetischen Varianten konzentriert, die zur Entwicklung und Progression von GC prädisponieren [5].

High Mobility Group Box-1 (HMGB1), ein wichtiges Mitglied der High-Mobility-Group Protein-Superfamilie enthält zwei 80-Aminosäure-DNA-Bindungsdomänen (A-Feld und B-Feld) und einem sauren Carboxyl- tail [6]. Es fungiert als Chromatin-Strukturprotein im Zellkern und einem proinflammatorischen Zytokin extrazellulär. Als Kernprotein bindet HMGB1 unspezifisch an die kleine Furche der DNA und erleichtert die Montage der ortsspezifischen DNA-Ziele [7]. Im Gegensatz dazu extrazellulärem HMGB1 fungiert als Zytokin, das Infektions- oder verletzungs ausgelöste Entzündungsreaktionen [8] ausbreitet. Die konstante Freisetzung von HMGB1 aus nekrotischen Tumorzellen kann eine Mikroumgebung ähnelt einer chronischen Entzündung zu schaffen; ein Zustand bekannt zur Entwicklung von epithelialen Malignomen beizutragen, insbesondere entzündungsbedingte Krebs [9]. In der Tat haben zahlreiche Studien haben bereits gezeigt, die Überexpression von HMGB1 in vielen Arten von Krebs [10-13], einschließlich GC [14]. Darüber hinaus haben zwingende Beweise bestätigt weiter, dass HMGB1 Überexpression in engem Zusammenhang mit der Tumorentstehung durch die Vermittlung der Proliferation, Invasion und Migration von Krebszellen verbunden ist [15, 16]. Daher HMGB1 kann ein interessanter Kandidat als neuer prognostischer Marker oder therapeutisches Ziel für GC sein.

thesaurierenden Beweise legen nahe, dass genetische Hintergründe, das Risiko und die Prognose von GC beeinflussen können [17]. Single nucleotide polymorphism (SNP) ist die häufigste genetische Variation, und können die vielversprechende Ersatz-Biomarkern für Patienten genetischen Hintergründen, vorherzusagen, therapeutische Reaktion und Prognose [18]. Genetische Varianten wurden in der menschlichen HMGB1
Gen [19], aber die Assoziation zwischen HMGB1
Gen-Polymorphismus und GC Überleben Ergebnis bestimmt wurde nie identifiziert. In Anbetracht der entscheidenden Rolle von HMGB1 in der Entwicklung und Progression von Krebs, ist es plausibel, dass die Polymorphismen von HMGB1
die klinischen Ergebnisse von GC beeinflussen können. Wir berichten hier untersuchten die Auswirkungen von drei Tag SNPs in HMGB1
auf die klinischen Ergebnisse von 1030 chinesischen GC-Patienten (704 im Trainingssatz, 326 in der unabhängigen Validierungssatz), die radikale Resektion Behandlung erhalten. Zusätzlich wurde die Wirkung eines identifizierten relevanten Tag-SNP an der Regulation der Genexpression ferner durch eine suchten in vitro
funktionalen Assay. Nach bestem Wissen ist dies die erste Untersuchung der Assoziation zwischen den Polymorphismen von HMGB1
und das klinische Ergebnis von GC.

Materialien und Methoden

Ethik

Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Vierten Military Medical University zugelassen. Die Verfahren wurden nach den anerkannten Richtlinien durchgeführt und an die 1964 Erklärung von Helsinki und seine späteren Änderungen oder vergleichbaren ethischen Standards. Die unterzeichnete Einverständniserklärung wurde von jedem Teilnehmer in die Studie aufgenommen erhalten.

Studienpopulation

Insgesamt 1030 Han-Chinesen Patienten mit primären Adenokarzinom des Magens wurden von zwei unabhängigen Standorten eingeschrieben, Tangdu Hospital und Xijing Hospital of Digestive Disease, in Xi'an, China. Alle GC Fälle erhielten die chirurgische Resektion und hatte keine Vorgeschichte von anderen Krebsarten oder eine präoperative Anti-Krebs-Behandlung oder Bluttransfusion innerhalb 3 Monate vor der Operation. Es gab keine Alter, Geschlecht oder Krankheitsstadium Einschränkungen für Fall der Einstellung. Unter ihnen sind die 704 Patienten (Abteilung für Allgemeine Chirurgie, Tangdu Hospital, zwischen Juli 2008 und Juni 2013) wurden als Trainingssatz in dieser Studie verwendet. Eine weitere Gruppe von 326 Patienten (Xijing Hospital of Digestive Disease, die zwischen Januar 2008 und Dezember 2010) wurden als unabhängige Validierungssatz verwendet. Das Ziel war es, die klinisch signifikante prognostischen Wert von SNPs in HMGB1
Gen aus dem Trainingssatz zu identifizieren und getestet es in dem unabhängigen Validierungssatz.

Demographische und klinische Daten

Demographische und klinische Daten wurden in persönlichen Interviews beim ersten Besuch oder Follow-up in den Kliniken, medizinische Aufzeichnungen oder Absprache mit den behandelnden Ärzten, einschließlich des Alters, des Geschlechts, der ethnischen Zugehörigkeit, Wohnregion, Zeitpunkt der Diagnose, die Zeit der Operation gesammelt durch und /oder adjuvante Chemotherapie (ACT), die Zeit der Rückfall und /oder Tod, Tumorstadium, Lauren Klassifikation, Differenzierung, histologischen Typ und Behandlungsprotokoll. Follow-up-Informationen wurden in 6-monatigen Abständen aktualisiert durch Vor-Ort-Interview, Telefon-Kommunikation oder der Überprüfung der medizinischen Aufzeichnungen von ausgebildeten Forschungsspezialisten. Die neueste Follow-up war aktuell Juni 2015 und die mittlere Nachbeobachtungszeit betrug 51 Monate (Bereich 6-89 Monate). Der Prozentsatz der Patienten während des Follow-up verloren 9,8%. OS wurde als die Zeit von der Operation GC-spezifischen Tod definiert. RFS (rezidivfreies Überleben) wurde als die Zeit von der Operation bis zum Zeitpunkt des ersten Rezidiv oder Fernmetastasen von GC definiert. Die Patienten am Leben in der letzten Follow-up wurden zensiert.

Die Erhebung, Verarbeitung und Konservierung von Proben

Vor der Operation, 5 ml venöses Blut aus jeder GC-Patienten gesammelt wurden DNA unter Verwendung des E.Z.N.A. zu extrahieren Blut DNA Midi Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA). Sechzig Magenkrebsgewebe wurden aus dem Validierungssatz für Echtzeit quantitative reverse Transkription PCR (RT-PCR) Assays gleichzeitig gesammelt.

SNP Auswahl und Genotypisierung

Die Kandidaten-Tag SNPs Auswahl von HMGB1
Gen wurden als ein zweistufiges Verfahren durchgeführt wird. Zum einen haben wir eine Reihe von Web-basierten SNP Auswahl-Werkzeuge (http://snpinfo.niehs.nih.gov/snpfunc.htm) Kandidat SNPs von HMGB1
[20] zu suchen. Alle bestätigten Polymorphismen in HMGB1
Genregion, einschließlich 5 kb stromaufwärts des ersten Exons und 5 kb stromabwärts von dem letzten Exon, wurden als Kandidaten SNPs zu sein. Diese SNPs mit einer kleineren Allelfrequenz ≥ 5% in der HapMap CHB (Han-Chinesen in Peking) Bevölkerung und eine paarweise Kopplungsungleichgewichts squared Korrelationskoeffizient (r ^{2) > 0,8 wurden als Kandidat SNPs ausgewählt. Zum anderen wurden aus diesen Kandidaten SNPs ausgewählt SNPs Tag der Internationalen HapMap-Projekt Phase-II-Datenbank der chinesischen Bevölkerung mit (http://www.hapmap.org/, abgerufen 18. November 2013) und Haploview Version 4.2. Schließlich drei Tag SNPs (Mittelwert r 2 = 0,981) ausgewählt wurden: rs1045411 (G > A), rs1412125 (T > C) und rs2249825 (C > G) .Genotyping wurde Genotypisierung System Sequenom iPLEX (Sequenom durchgeführt Inc., San Diego, CA, USA) nach dem Protokoll des Herstellers. Die Labor Personen, die die Genotypisierung Tests wurden durchgeführt, um Patienten Informationen geblendet. Interne Qualitätskontrolle und Negativkontrollen wurden verwendet Genotypisierung Genauigkeit sicherzustellen, und 5 Proben wurden zufällig ausgewählt und in doppelter Ausführung mit 100% Übereinstimmung genotypisiert. Anrufrate für die Genotypisierung lag zwischen 99,3% und 99,7%. Die detaillierten Informationen von SNPs und Genotypisierung Ergebnisse wurden in S1 Tabelle aufgeführt.}

Funktionstest

Die funktionellen Auswirkungen von Tag SNP rs1045411 befindet sich in der 3'UTR von HMGB1
Gen Untersucht sucht~~POS=HEADCOMP wurden die Luciferase-Reportertest durch Verwendung. Kurz gesagt, 49-bp-Doppelstrang-DNA entweder Wild Genotyp oder Variante Genotyp von rs1045411 trägt, wurde synthetisiert und in den PMIR-REPORT-Vektor kloniert (Ambion, Austin, Texas, USA) unter Verwendung von Restriktionsenzymen Spe I und Hind III (Takara, Dalian, China). Alle Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Menschliche GC-Zelllinien SGC-7901 und humane embryonale Nierenzelllinie HEK-293T, in denen-miR-505 identifiziert wurde positiv durch die Verwendung TaqMan MicroRNA Reverse Transkription-Kit (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA), wie zuvor zum Ausdruck gebracht werden, beschrieben [21], wurden entweder mit oder ohne Anti-miR-505 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) und die interne Kontrolle PMIR-rs1045411-A oder PMIR-rs1045411-G (200 ng /Vertiefung) mit cotransfiziert Reporterplasmid pRLTK (Promega, Madison, WI, USA) (20 ng /Vertiefung) pro Vertiefung mit 2 x 10 ^{5 Zellen Lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in einer 24-Well-Platte verwendet wird. SGC-7901 und Zelllinien HEK293 wurden aus der Type Culture Collection der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (CAS) (Shanghai, China) erworben, wo sie von Mykoplasmen Nachweis verifiziert wurden, DNA-Fingerprinting, Isoenzym-Erkennung und Zellvitalität Erkennung. Eine gefrorene Fläschchen jeder 147-Zelllinie, die sofort erweitert und eingefroren, wenn vom Lieferanten empfangen wird, wurde für die vorliegende Studie wieder zum Leben erweckt und verwendet. Nach 48 Stunden wurden die Zellen gesammelt Luciferase-Aktivität unter Verwendung eines Dual-Luciferase-Reporterassay-System-Kit (Promega, Madison, WI, USA) mit einem Luminometer (Tecan, Männedorf, Schweiz) zu bestimmen. Alle Transfektionen wurden in Triplikaten durchgeführt und alle Experimente wurden unabhängig voneinander dreimal wiederholt.}

Um die Wirkung von SNP rs1045411 tag Genotypen auf die Expression von HMGB1
mRNA, Gesamt-RNA wurde isoliert aus beurteilen 60 GC Gewebeproben (30 mit AA-Genotyp und 30 mit AG /GG Genotypen von rs1045411) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Dann wurden cDNA unter Verwendung PrimeScript RT Reagenzien-Kit (Takara, Dalian, China) synthetisiert. RT-PCR wurde mit den folgenden HMGB1
Primern durchgeführt: vorwärts, 5'-TAAGAAGCCGAGAGGCAAAA-3 '; umkehren, 5'-AGGCCAGGATGTTCTCCTTT- 3 'und β-Actin wurde als interne Kontrolle verwendet (Primer: Vorwärts, 5'-AAGACGTACTCAGGCCATGTCC-3'; umkehren, 5'-GACCCAAATGTCGCAGTCAG-3 ') [13]. Relative Expression von HMGB1
mRNA-Spiegel wurde Verfahren unter Verwendung der relativen Quantifizierung bestimmt und 2 ^{-ΔΔCt Analyse.}

Die statistische Analyse

Statistik-Analysen wurden unter Verwendung der IBM durchgeführt SPSS Statistics 19.0 Software (IBM). Normalerweise verteilt kontinuierlichen Variablen wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt, während abnorm verteilt kontinuierlichen Variablen als Median und Bereich zum Ausdruck gebracht wurden. Pearson χ ^{2-Test wurde verwendet, um die Unterschiede der kategorischen Variablen zu testen. Die Differenz von normalverteilten kontinuierlichen Variablen zwischen zwei Gruppen wurde unter Verwendung von Students analysiert t
-Test, während Mann-Whitney-U-Test wurde für den Vergleich von abnorm verteilt kontinuierlichen Variablen verwendet. Multivariate Cox Proportional Hazard-Regressionsmodell wurde angewandt, um die Wirkung einzelner SNP und Patientencharakteristika auf OS oder RFS zu bewerten. Hazard Ratios (h) und 95% Konfidenzintervall (CI) wurden mit Anpassung geschätzt für Alter, Geschlecht, Lauren Klassifikation, Differenzierung, TNM-Stadium und ACT. Kaplan-Meier-Kurven und Log-Rank-Tests wurden verwendet, auch Wirkung der einzelnen SNPs auf die Überlebenszeit zu bewerten. Statistiken Bedeutung auf einem Niveau von 0,05 festgelegt wurde und alle P
in dieser Studie berichteten Werte waren zweiseitig.}

Ergebnisse |

Verteilung von Patientencharakteristika und Prognose-Analyse

"GC Patienten Eigenschaften wurde in der S2 Tabelle zusammengefasst. Aufgrund der späten Enddatum der Patientenrekrutierung für den Trainingssatz betrug die mediane Nachbeobachtungszeit im Trainingssatz kürzer (46 Monate, von 6 bis 80 Monate hin) als die in der unabhängigen Validierungssatz (72 Monate im Bereich von 6-89 Monate). So verglichen mit den Patienten in der unabhängigen Validierungssatz, die in der Trainingssatz hatten niedrigere Rückfallraten (58,4% vs
. 66,8%, P
= 0,005) und Tod (41,4% vs
. 55,8%, P
= 0,001). Es gab keine Unterschiede zwischen den Trainingssatz und Validierungszwecke in Bezug auf Alter, Tumorstelle, Lauren Klassifikation, TNM-Stadium, Differenzierung und ACT ( P
-Wert im Bereich von 0,082 bis 0,898). Spätestens Follow-up, 641 Patienten (423 und 218 in der Ausbildung und Validierungssatz bezeichnet) entwickelt Rezidiv und 482 starben (300 und 182 in der Ausbildung und Validierungssatz, beziehungsweise). Multivariate Cox-Regressionsanalyse zeigte, dass es signifikant höhere Tod und Rezidivrisiko bei Patienten mit diffusen Typ, schlechte Differenzierung und Tumor im Stadium III und IV im Vergleich zu den Patienten mit Darm-Typ, gut /mittel Differenzierung und Tumorstadium I und II unter Trainingssatz, Validierungsset und gepoolte Analyse. Darüber hinaus Platin-basierten ACT nach der Operation zeigten eine signifikante Schutzwirkung sowohl auf OS und RFS von GC Patienten (S3 Tabelle).

Verband der HMGB1
SNPs mit dem klinischen Ergebnis in GC-Patienten

Wir untersuchten die Assoziation von HMGB1
SNP Genotypen mit GC klinischen Ergebnisse der multivariaten Cox-Regressionsanalyse mit Adjustierung für Alter verwendet, Geschlecht, Tumorstelle, Lauren Klassifikation, Differenzierung, TNM-Stadium und ACT (als gezeigt in Tabelle 1). Die Ergebnisse zeigten, dass die Tag-SNP rs1045411 signifikant mit OS von GC-Patienten in der Trainingsmenge verbunden war. Im Vergleich zu Patienten mit dem GG-Genotyp, die mit Variante Allele (AG und AA-Genotypen) einen deutlich geringeren Sterblichkeitsrisiko (HR = 0,77, 95% CI: 0,60-0,97, P
= 0,032). Dieser deutliche Befund wurde mit HRs von 0,80 in der unabhängigen Validierungssatz und Analyse gepoolt, bestätigt (95% CI: 0,62-0,99; P
= 0,046) und 0,78 (95% CI: 0,55-0,98; P
= 0,043), respectively. Kaplan-Meier-Kurven-Analyse auch eine starke Assoziation mit OS zur Verfügung gestellt. Die Patienten tragen AG /GG Genotypen von rs1045411 hatten bessere OS als solche mit GG-Genotyp in der Ausbildung gesetzt habe ( P
= 0,024, 1A), Validierungssatz ( P
= 0,017, 1B ) und gepoolten Analyse ( P
= 0,001, 1C).

Stratifizierte Analyse über die Assoziation von rs1045411 mit OS von Hostvariablen

Wir geschichteten Analysen durchgeführt, um die Verbände zu bewerten zwischen Genotypen von rs1045411 und OS von GC Patienten nach Alter, Lauren Klassifikation, Differenzierung, TNM-Stadium und ACT. Die wesentlichen Schutzwirkungen von rs1045411 verliehen war noch ausgeprägter bei ungünstigen Untergruppen mit einem HR-Bereich 0,39-0,69 (2A). Einzelheiten verringerte sich der signifikante Todesrisiko mit der Variante haltigen Genotypen assoziiert (AG /AA) von rs1045411 wurde bei älteren Patienten (HR = 0,69, 95% CI: 0,48 bis 0,99) beobachtet, diffuse Typ (HR = 0,67, 95% CI: 0,47-0,95), schlechte Differenzierung (HR = 0,66, 95% CI: 0,45-0,95), der klinischen Phase III und IV (HR = 0,58, 95% CI: 0,37-0,93) und ohne ACT (HR = 0,39, 95 % CI: 0,20-0,76). Darüber hinaus zeigte die vorliegende geschichtete Analyse einen ähnlichen Trend für RFS mit einer HR-Bereich von 0,44 bis 0,79 (2B). Die Ergebnisse zeigten, dass AG /AA-Genotypen von rs1045411 die günstigere Prognose in den negativen Gruppen verliehen.

Gemeinsame Wirkung zwischen rs1045411 und Lauren Klassifikation, Differenzierung, Bühne oder ACT auf OS

Frühere Studien haben gezeigt, dass sowohl genetische Variationen und klinischen Eigenschaften interagieren eine entscheidende Rolle bei GC Progression zu spielen [17]; und daß, wo Wechselwirkungen vorhanden sind, die Auswirkungen der klinischen Elemente auf Tumorprogression wird durch Genotypen modifiziert werden. Daher wurde eine gemeinsame Analyse durchgeführt, die mögliche modulierende Wirkung von rs1045411 in diesen klinischen Merkmalen (Lauren Klassifikation, Differenzierung, Bühne und ACT), die Status der Tumorprogression auf OS von GC-Patienten zu bewerten. Wie in Tabelle 2 gezeigt, war es eine signifikante Wechselwirkung zwischen den Genotypen von rs1045411 und Lauren Klassifikation, Differenzierung, Bühne oder ACT (alle P
_{Interaktion < 0,001). Im Vergleich zu Personen tragen AG /AA-Genotypen und Darm-Typ, die mit GG-Genotyp und diffusen Typ hatte ein signifikant erhöhtes Todesrisiko (HR = 2,09, 95% CI: 1,42-3,08, P
< 0,001). Bei Patienten mit GG-Genotyp der Stufe III /IV (;: Die ähnlichen Ergebnisse wurden auch bei Patienten tragen GG-Genotyp mit einer schlechten Differenzierung (1,70-3,62, P
<0,001 HR = 2,48, 95% CI) gefunden HR = 2,99, 95% CI: 2,04-4,38, P
< 0,001) und bei Patienten tragen GG-Genotyp mit ACT (HR = 4,49, 95% CI: 2,70-7,45, P
<. 0.001) im Vergleich mit der entsprechenden Referenzgruppe}

Funktionelle Effekte von rs1045411 auf die Genexpression

Bioinformatik-Analyse (http://www.microrna.org/microrna/home. do) ergab eine große Nähe des Tag-SNP rs1045411 an der vorhergesagten mikroRNA-Bindungsstellen (HSA-miR-505) in der 3'-untranslatierten Region (3'-UTR) von HMGB1
Gen [22] (Fig 3A ). Wir haben bestätigt, zunächst die Expression von miR-505 in SGC-7901 und HEK-293T-Zelllinien, und fanden heraus, dass miR-505 einen relativ höheren Expressionsniveau (3B) hatte. Um zu untersuchen, ob die Genotypen von Tag SNP rs1045411 im 3'UTR der HMGB1
Gen Genexpression verändern könnten, zwei Zelllinien wurden mit Luciferase-Reporter-Plasmiden, die entweder die Wild (GG) oder Variante (AA) Genotyp von SNP rs1045411 (3C). Die Ergebnisse zeigten, dass SNP rs1045411 deutlich eine Wirkung auf die Luciferase-Aktivität normalisiert in den beiden transfizierten Zellen zeigten. Im Vergleich zu Zellen mit Konstrukten transfiziert tragenden Wild Genotyp (GG) von SNP rs1045411, Zellen, die mit Konstrukten tragen Variante Genotyp (AA) zeigte eine signifikante Luciferase-Aktivität verringert. Die Wirkung von anti-miR-505 auf die Luciferase-Aktivität der Reporter-Plasmide wurden ebenfalls in der Studie bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Luciferase-Aktivität von zwei Konstrukten UTR (p-MIR-G und P-MIR-A) wurde durch anti-miR-505 in beiden Zelllinien mit eliminiert Unterschiede der Luciferase-Aktivität zwischen zwei Reporterplasmide signifikant erhöht. Darüber hinaus haben wir quantitative RT-PCR die Wirkung von SNP rs1045411 Genotypen auf HMGB1-mRNA-Expression in 60 GC Gewebe (30 mit GG-Genotyp und 30 mit AG /AA-Genotypen) von Validierungssatz zu untersuchen. Wie in Fig 3D gezeigt, fanden wir, dass die mRNA Expression von HMGB1 mit Wild (GG) Genotyp von rs1056560 als die in den Trägern signifikant höher war die Variante durch (AG /AA) Genotypen (1,04 ± 0,50 vs
. 0,79 ± 0,37, P
= 0,004).

Diskussion

in dieser Studie haben wir die Assoziation von genetischen Polymorphismen in HMGB1
Gen untersucht, mit die Prognose von GC-Patienten durch eine zweistufige Analyse von Training und Validierung setzt. Wir haben gezeigt, dass AG /AA-Genotypen von Tag SNP rs1045411 in HMGB1
3'-UTR signifikant mit einem besseren Betriebssystem in einer Menge von 704 GC Patienten in Verbindung gebracht werden, wenn sie mit GG Genotypen verglichen. Diese signifikante Assoziation wurde in einem unabhängigen Validierungssatz von 326 GC-Patienten sowie einer gepoolten Analyse aller 1030 GC Patienten bestätigt. Funktionellen Assay zeigte an, dass rs1045411 Genotypen SNP einen signifikanten Einfluss auf die mRNA-Expression von hatte HMGB1
in GC Geweben sowie zwei Tumorzelllinien. Darüber hinaus wurde der günstige Effekt der prognostischen rs1045411 deutlicher in den negativen Untergruppen der GC-Patienten. Darüber hinaus fanden die gemeinsame Analyse eine signifikante Wechselwirkung von Gen-klinischen Elemente. Nach bestem Wissen und Gewissen, diese Studie zum ersten Mal berichtet die Assoziation zwischen HMGB1
Gen-Polymorphismen und GC Prognose. Nach der Gültigkeitsprüfung HMGB1
SNP rs1045411 kann mit herkömmlichen klinischen Prognosefaktoren für die Entscheidungsfindung von GC individuelle Behandlung als prognostischer Marker in Kombination verwendet werden.

Die zunehmenden Beweise legen nahe, dass erhöhte HMGB1 ist im Zusammenhang mit der Tumormetastasierung und einer schlechten Prognose [16, 23-26], HMGB1 ein attraktives Tumorbiomarker machen. Es wurde vorgeschlagen, dass HMGB1 fungiert als potentiell onkogenen Protein Tumorfortschritt zu fördern [15, 27, 28], und ihre Überexpression in Krebszellen wirkt sich auf die Anti-Krebs-T-Zell-Antwort durch die Aktivierung von intrazellulären Signal [15, 29]. Tatsächlich hat die erhöhte Expression von HMGB1 in der Patienten mit GC und andere Arten von Krebs erkannt worden [30-32], und seine Expression ist eng mit tumorigenesis [33], Tumorinvasion und Metastasierung [29] verbunden. Weiterhin Chung et al [34] gezeigt, dass Serum-HMGB1-Spiegel wurden auch signifikant mit der Tumorinvasion verbunden sind, Metastase, Wachstum, sowie schlechte Prognose. Zusammen unterstützen diese Ergebnisse eine wichtige Rolle von HMGB1 in Krebs Transformation, Tumorwachstum und Invasion.

Trotz der umfangreichen Untersuchungen von HMGB1 Expression in Geweben und seine entsprechende serologische Aktivität auf Krebsentwicklung, gibt es wenige Studien mit Schwerpunkt auf die Wirkung der SNPs in HMGB1
Gen auf Krebsprognose oder Ansprechen auf die Behandlung so weit. In einer Gruppe von chinesischen Patienten mit Lungenkrebs, zwei SNPs, rs141215 und rs2249825, wurden mit einer platinbasierten Chemotherapie Antworten [35] verbunden. In ähnlicher Weise bei Patienten mit oralen Plattenepithelkarzinom, ein anderes HMGB1
Polymorphismus bei den SNP rs3742305 wurde mit der Tumorprogression und das rezidivfreie Überleben assoziiert [36]. Allerdings ausgeschlossen wir die SNP rs3742305 aus der vorliegenden Studie, weil sie in starken Kopplungsungleichgewicht mit den SNP rs1045411 ist. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass die Variante enthaltenden (AG /AA) Genotypen von Tag SNP rs1045411 waren signifikant mit einem besseren OS bei Patienten mit GC verbunden sind, eine wichtige Rolle von HMGB1 in GC-Entwicklung zu unterstützen.

Da SNP rs1045411 befindet sich in der 3'UTR-Region von HMGB1
Gen kann es Einfluss auf die Expression von HMGB1
Gen in GC-Patienten. Bis heute gibt es jedoch keine Studien, die Funktionen der SNP rs1045411 auszuwerten. Wir fanden, dass rs1045411 ist in unmittelbarer Nähe zu einer MikroRNA-Bindungsstelle vorausgesagt (has-miR-505) [22], was darauf hindeutet, dass eine solche Variation in dieser Position die Stabilität der mRNA beeinflussen und Bindungsaktivität zu MikroRNA, wodurch Genexpression modulierenden [ ,,,0],37]. Tatsächlich bestätigt unsere Luciferase-Reporter-Assays einen signifikanten Einfluss von rs1045411 auf der post-Transkriptionsregulation von HMGB1
Gen in einem miR-505-abhängigen Weise. Darüber hinaus wird durch die Prüfung HMGB1 mRNA Expressionsniveau in 60 GC Gewebeproben mit Genotyp Daten von SNP rs1045411, fanden wir, dass die Trag Gewebe Variante enthaltenden (AG /AA) Genotypen hatten signifikant HMGB1 mRNA Expression verringert im Vergleich zu denen mit homozygot Wild (GG ) Genotyp. Zusammengenommen zeigten unsere experimentellen Daten, dass die günstige prognostische Wirkung verliehenen Variante enthaltenden (AG /AA) Genotypen von rs1045411 eng mit einer abweichenden Expression HMGB1
verbunden war.

Unsere aktuelle Studie hat gezeigt, dass die wesentlichen oder Grenzschutzwirkungen von Variante enthaltenden (AG /AA) Genotypen von SNP rs1045411 an OS und RFS von GC Patienten wurden fast vollständig in der negativen (aber nicht in günstiger) Schichten Patienten gefunden. Dies stimmt mit früheren Studien, die zeigen, dass SNPs Krebs Überleben Prominenz in spezifischen Untergruppe Patienten beeinflussen. Zum Beispiel, Wang et al
[38] haben berichtet, dass PSCA
rs2294008 ist signifikant mit dem Überleben -ergebnissen von diffusen Typ von Magenkrebs, aber nicht Darm-Typ Magenkrebs. Pu et al
[39] haben auch vorgeschlagen, dass genetische microRNA bezogenen Varianten mehr bemerkenswert mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs Überleben in einem frühen Stadium Patienten verbunden ist. Wir beobachteten auch eine signifikante Wechselwirkungen zwischen rs1045411 Genotypen und klinische Elemente wie Lauren Klassifikation, Differenzierung, im klinischen Stadium, und eine adjuvante Chemotherapie in der Prognose von GC zu modulieren. Diese signifikante Korrelationen vorgeschlagen, dass SNP rs1045411 mögliche modulierende Rollen in diesen klinischen Eigenschaften haben könnten repräsentieren Tumorprogression. Jedoch bleiben die zugrunde liegenden Mechanismen in Zukunft noch weiter untersucht werden.

Die vorliegende Studie hat mehrere verschiedene Funktionen. Zuerst kommen die teilnehmenden Patienten vor allem aus Shaanxi und den angrenzenden Gebieten, die für die Durchführung von populationsbasierten Forschung aufgrund der geographischen Stabilität bei geringem Mobilitätsrate geeignet ist. Zweitens ist die relativ große Bevölkerungszahl in dieser Studie eingeschrieben erlaubt uns bühnen geschichtete Analyse in der Ausbildung und Validierung setzt zu führen, die die Störfaktoren des Tumors und der Behandlung Heterogenität begrenzt. Eine wesentliche Einschränkung dieser Studie ist, dass die relative kleine Population in der Validierungssatz in falsch-Negative führen kann. Da unsere Studie auf Han-Chinesen beschränkt war, können wir nicht die Verallgemeinerungs Problem auszuschließen. Zukünftige Studien in größeren Populationen und andere ethnics sind gerechtfertigt.

Insgesamt wie die erste Studie Beobachtung der Wirkung von HMGB1
Gen-Polymorphismen auf GC Prognose in einem chinesischen Bevölkerung, unsere Daten stark dieses Tag vorschlagen SNP rs1045411 in HMGB1
Gen hat einen signifikanten Einfluss auf das klinische Ergebnis von GC Patienten, vor allem für Patienten mit fortgeschrittenen Stadium oder anderen aggressiven klinisch-pathologischen Zustand. Die vorliegende Studie hat das Potenzial, die klinische Bedeutung bei der Unterstützung Therapieentscheidungen bei der Behandlung von GC zu verfeinern.

Grundinformationen
S1 Tabelle. Die Informationen und die Genotypisierung Ergebnisse von HMGB1 SNPs
doi:. 10.1371 /journal.pone.0154378.s001
(DOC)
S2 Tabelle. Ausgewählte demographischen und klinischen Eigenschaften von Magenkrebs Patientenpopulation
doi:. 10.1371 /journal.pone.0154378.s002
(DOC)
S3 Tabelle. Aufteilung der Patientencharakteristika und Prognose-Analyse im Trainingssatz und der Validierungssatz
doi:. 10.1371 /journal.pone.0154378.s003
(DOC)

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