PLoS ONE: Epidermal Growth Factor-Like-Domäne-enthaltendes Protein 7 (EGFL7) Verbessert die EGF-Rezeptor-AKT Signal, Epithelial-mesenchymale Transition, und Metastasierung von Magenkrebs Cells

Abstrakt

Epidermal growth factor-ähnliche Domäne -haltigen Protein 7 (EGFL7) in humanen epithelialen Tumoren hochreguliert und so ist ein potentieller Biomarker für Malignität. Tatsächlich haben frühere Studien gezeigt, dass hohe EGFL7 Ausdruck Infiltration und Metastasierung von Magenkarzinom fördert. Die epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) initiiert die metastatische Kaskade und stiftet Krebszellen mit invasiven und Migrationsfähigkeit; es ist jedoch nicht bekannt, ob EGFL7 Metastasierung fördert durch EMT Triggerung. Wir fanden, dass EGFL7 wurde in mehreren menschlichen Magenkrebs (GC) Zelllinien überexprimiert und dass die Überexpression gefördert Zellinvasion und Migration von Grund auf neu gewickelt und Transwell Migrationsassays offenbart. Im Gegensatz dazu EGFL7 Knockdown reduziert Invasion und Migration-shRNA vermittelt. Außerdem wuchs EGFL7-überexprimierenden Zellen in größere Tumoren und eher in die Leber zu metastasieren Vergleich zu underexpressing CG-Zellen nach der subkutanen Injektion in Mäusen. EGFL7 Überexpression GC-Zelllinien gegen anoikis geschützt, einen plausiblen Mechanismus für diese verbesserte metastasierendem Kapazität. In exzidierten menschlichen Magentumoren, die Expression von EGFL7 positiv mit der Expression von mesenchymalen Marker Vimentin und der EMT-assoziierten Transkriptions Repressor Snail und negativ korreliert mit der Expression des epithelialen Zellmarker E-Cadherin korreliert. In GC-Zelllinien, umgekehrt EGFL7 Knockdown morphologische Anzeichen von EMT und verringert sowohl Vimentin und Snail Ausdruck. Darüber hinaus gefördert EGFL7 Überexpression EGF-Rezeptor (EGFR) und Proteinkinase B (AKT) phospho-Aktivierung, Effekte deutlich durch den EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitor unterdrückt AG1478. Darüber hinaus reduziert AG1478 auch die erhöhten invasive und Migrationsfähigkeit von Linien GC Zelle überexprimiert, EGFL7. Zusammengefasst legen diese Ergebnisse nahe, dass stark EGFL7 Metastasierung fördert durch EMT durch eine EGFR-AKT-Snail-Signalweg aktiviert. Eine Störung der EGFL7-EGFR-AKT-Snail-Signalisierung kann eine viel versprechende therapeutische Strategie für Magenkrebs

Citation:. Luo B-H, Xiong F, Wang J-P, Li J-H, Zhong M, Liu Q-L, et al. (2014) Epidermal Growth Factor-Like-Domäne-enthaltendes Protein 7 (EGFL7) Verbessert die EGF-Rezeptor-AKT Signal, Epithelial-mesenchymale Transition, und Metastasierung von Magenkrebszellen. PLoS ONE 9 (6): e99922. doi: 10.1371 /journal.pone.0099922

Redaktion: Claudia D. Andl, Vanderbilt University, Vereinigte Staaten von Amerika

Received: 15. November 2013 beginnen; Akzeptiert: 19. Mai 2014; Veröffentlicht: 19. Juni 2014

Copyright: © 2014 Luo et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von National Natural Science Foundation of China (Nr 81001080) und dem Open-End Fund für die wertvollen und Präzisionsinstrumente der Central South University (Nr JJ3121) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist die vierthäufigste bösartige Tumor und die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle weltweit [1], [2]. Etwa die Hälfte aller GC Fälle treten in den ostasiatischen Ländern mit besonders hohen Inzidenz in Japan, Korea und China [3], [4]. Die Fortschritte bei der systemischen Behandlung von GC hat sich stark kurzfristige Überleben erhöht; bleibt jedoch die Fünf-Jahres-Überlebensrate von Patienten GC gering durch Rezidiv und Metastasierung [5]. Zudem haben die meisten neu diagnostizierten GC Patienten zeigen bereits metastasierten Erkrankung, die für Onkologen eine große therapeutische Herausforderung dar [6].

Epidermal growth factor-like domain-containing protein 7 (EGFL7), auch als vaskulärer endothelialer Statin bekannt ist eine endothelial cell-derived sekretierten Faktor, der vaskulären tube formation reguliert. Parker et al. [7] gezeigt, dass EGFL7 für die Angiogenese bei Zebrafischen Embryonalentwicklung von entscheidender Bedeutung ist [8]. Jüngste Studien haben in einigen Tumoren und Krebszelllinien, einschließlich Nierentumoren, maligne Gliome, hepatozellulären Karzinomen erhöhte Expression von EGFL7 berichtet, und Darmkrebs [7] - [10]. Wir haben bereits gezeigt, dass EGFL7 auch in Magenkarzinom überexprimiert wird [11], und wurde Expression signifikant mit pathologischen Eigenschaften korreliert sind, die klinische Progression, schlechte Prognose und Metastasierung [10], [12]. Daher ist EGFL7 ein Kandidat prädiktiver Faktor für die Tumorprogression und Metastasierung. Jedoch unklar sind die Mechanismen der tumorigenen Wirkung von EGFL7 zugrunde liegen.

Metastasierung ist ein mehrstufiger Prozess, der eine epitheliale-mesenchymale Transition (EMT), in der polarisierte Epithelzellen mesenchymalen Zellen umgewandelt werden, umfasst [13], ein Phänotyp mit mehr invasive und Migrationsfähigkeit [14]. Die EMT ist auch ein reversibler Prozess, metastatischen Krebserkrankungen an der invasiven Front vieler tritt oft [15]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass EGF Krebszellmigration und Invasion gleichzeitig mit der Aktivierung von EMT [16] fördert - [18]. Bezeichnenderweise EGFL7 enthält zwei EGF-ähnlichen Domänen, eine funktionelle Homologie was darauf hindeutet, [9], [12]. Doch ob EGFL7 tatsächlich tut EMT verbessern und Magenkrebs Metastasen fördern, hat noch bestimmt werden. Darüber hinaus sind die molekularen Mechanismen, durch die EMT in GC geregelt bleiben weitgehend unbekannt. Der Zinkfinger-Repressor Snail ist entscheidend für die Genexpression Umprogrammierung während EMT, insbesondere zur Unterdrückung der Zell-Zell-Adhäsionsmolekül endothelial (E) -cadherin, deren Verlust ist ein wichtiges frühes Ereignis in der EMT und notwendig für die spätere Metastasierung angesehen [ ,,,0],19].

Die vorliegende Studie zielte darauf ab, um zu bestimmen, ob EGFL7 Metastasierung fördert durch EMT auszulösen. Wir fanden, dass EGFL7 Überexpression des EGFR-AKT Signalweg aktiviert, löst EMT und fördert GC Zellinvasion In-vitro-
und Metastasierung in vivo
.

Materialien und Methoden

Patienten und Gewebeentnahme

wurden von 79 GC-Patienten (58 Männer und 21 Frauen) behandelt durch chirurgische Resektion an der Universitätsklinik für Chirurgie, Xiangya Hospital, Central South University (China) erhalten. Operationen wurden von Januar 2010 bis Dezember 2012 führten die Patienten im Durchschnitt (Bereich: 28 bis 82 Jahre) 54,7 Jahre alt waren. Und erhielt weder eine Chemotherapie noch eine Strahlentherapie vor der Operation

Die Patienten wurden darüber informiert, dass OP-Präparate würden werden für konventionelle pathologische Diagnose verwendet werden und dass die verbleibenden Gewebe für die Forschung verwendet werden könnten. Keine persönliche Patientendaten wurden für diese Studie erforderlich und die Protokolle kein Risiko getragen, so dass nur verbal informierte Einwilligung der Patienten erforderlich war. Das Protokoll wurde von der Ethikkommission der Xiangya Hospital, Central South University (Zulassungsnummer: 201311389) zugelassen.

Disease Staging definiert wurde nach der sechsten Auflage des TNM des American Joint Committee on Cancer [ ,,,0],20], [21]. Die Tumoren wurden gut Adenokarzinom des Magens in 12 Fällen zu unterscheiden, mäßig in 34 Fällen zu unterscheiden, und schlecht in 33 Fällen unterschieden. Alle Proben wurden sofort mit 10% Formalin, dehydriert fixiert und in Paraffin eingebettet. Eine genaue klinische Informationen und pathologische Diagnose waren für alle Patienten zur Verfügung.

Immunhistochemie

Für die Immunhistochemie, hergestellten Proben 15 h bei 60 ° C inkubiert wurden, und schneiden in 4 um dicke Abschnitte, deparaffinisiert in Terpentin, getrocknet und in abnehmendem Ethanol rehydratisiert: destilliertes Wasser-Gradienten. Endogene Peroxidaseaktivität wurde durch Inkubation für 30 min in 0,3% Wasserstoffperoxid in 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) inaktiviert. Scheiben wurden dann für 15-20 min in Citrat-Puffer (pH 6,0) bei 95 ° C für Antigen Retrieval inkubiert, mit 5% normalem Ziegenserum in 0,01 M PBS bei 37 ° C für 15 Minuten blockiert, gewaschen und mit primären Antikörpern, verdünnt in Blockierungslösung in einer befeuchteten Kammer über Nacht bei 4 ° C. Die folgenden primären Antikörper wurden verwendet: Maus-Anti-EGFL7 monoklonalen Antikörper (Abcam, USA, 1:400) und Kaninchen monoklonale Antikörper, die gegen E-Cadherin (CST, USA, 1:1000), Vimentin (CST, USA, 1:1000 ), Schnecke (Proteintech, USA, 1:1000) und CD34 (Boster, China, 1:500). Nach dem Waschen wurden die Proben nacheinander mit biotinyliertem sekundärem Antikörper und Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (HRP) -Avidin Arbeitslösung inkubiert. Immunmarkierung wurde mit der DAB-Substrat-Kit von Zhongshan Golden Bridge Company (China) nach den Empfehlungen des Herstellers sichtbar gemacht. destilliertes Wasser-Gradienten, und auf Objektträger mit Permount Eindeckmedien (Fisher Scientific, USA)

Die Quantifizierung von immunhistochemischen Signale:. Schließlich wurden die Schnitte mit Hämatoxylin (Vector Laboratories, USA), dehydriert in einer aufsteigenden Ethanol counterstained

Alle GC und die umliegenden nicht-neoplastische Magengewebe wurden bestätigt histologisch von zwei unabhängigen Pathologen (K.-SW und J.-HL) blind für die ursprünglichen Diagnose. Immunfärbung wurde durch ein semi-quantitatives Verfahren abgestuft, der sowohl die Intensität und Verteilung der Färbung als [22]. Kurz gesagt, wurden fünf Felder zufällig unter geringer Vergrößerung ausgewählt (100 ×, Olympus BX51, Tokyo, Japan), und von jedem Feld gezählt 200 Tumorzellen. Die Färbungsintensität wurde wie folgt bewertet: 0, keine Färbung; 1, schwach gelbe Färbung; 2, gelbe Färbung; 3, braun Färbung. Positive Zellen wurden durch eine klare Grenze und gelbe oder braune Färbung unterscheidet sich von dem Hintergrund aus. Der Prozentsatz der positiven Zellen (PP) wurde wie folgt bewertet: 0, 0%; 1, 1% bis 25%; 2, 26% -50%; 3, 51% -75%; 4, 76% -100%. Die beiden Werte wurden kombiniert, um die folgende Klassifizierung zu erhalten: eine negative Färbung, Proben mit immunoreaktiven Score (IRS) von 0 bis 2; schwach positive Färbung, Proben mit IRS von 3 bis 5 ist; stark positive Färbung, Proben mit IRS von 6 bis 7 Proben, die schwach und stark positive Färbung zeigten, wurden in der statistischen Analyse einbezogen.

Zelllinien und Kultur

Human GC-Zelllinien SGC7901 (mäßig differenziertes Adenokarzinom), BGC823 (schlecht differenzierten Adenokarzinom), MKN28 (gut differenzierten Adenokarzinom) und MKN45 (schlecht differenzierten Adenokarzinom) sowie normale Magenschleimhaut epithelialen GES-1-Zellen wurden aus der Type Culture Collection der chinesischen Akademie der Wissenschaften erworben (Shanghai, China). Alle Zellen wurden gezüchtet und in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium (Gibco Biocult, Paisley, UK), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Gibco Biotechnology), 100 U /ml Penicillin und 100 ug /ml beibehalten Streptomycin bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO _2.

Short Hairpin-RNA (shRNA) und Rekombinante Expression Plasmid Pex-2-EGFL7

Zelllinien zu erzeugen überexprimierenden oder underexpressing EGFL7, die nativen Zelllinien wurden mit einem Expressionsvektor oder gezielte shRNA stabil transfiziert. Die shRNA Sequenzen des menschlichen EGFL7 wurden nach der menschlichen EGFL7 DNA-Sequenz (GenBank NO NM_016215.3.) Entworfen von Designer 3.0 Software (Genepharma, http://www.genepharma.com) und BLAST-Suchen (http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Die Zielsequenzen wurden mit dem menschlichen Genom-Datenbank durch BLAST-Suche verglichen keine hohe Homologie zu anderen codierenden Sequenzen zu gewährleisten. Die Sequenzen EGFL7-homo-333 und EGFL7-homo-887 wurden als Zielstellen für eine bestimmte EGFL7 shRNA identifiziert. Außerdem wurde eine nicht-spezifische Sequenz (scramble shRNA) als Negativkontrolle ausgelegt und der GAPDH-Sequenz wurde als interne Kontrolle gestaltet. Die shRNA Sequenzen waren wie folgt:

EGFL7-shRNA1 gegen EGFL7-homo-333: sense, 5'-CACCGGTGCTGCTGATGTGGCTTTCAAGAGAAGCCACATCAGCAGCACCTTTTTTG-3 '; Antisense, 5'-GATCCAAAAAAGGTGCTGCTGATGTGGCTTCTCTTGAAAGCCACATCAGCAGCACC-3 '; EGFL7-shRNA2 gegen EGFL7-homo-887: sense, 5'-CACCGAGTGGACAGTGCAATGAATTCAAGAGATTCATTGCACTGTCCACTCTTTTTTG-3 '; Antisense, 5'-GATCCAAAAAAGAGTGGACAGTGCAATGAATCTCTTGAATTCATTGCACTGTCCACTC-3 '; unspezifischen Sinn, 5'-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3 '; Antisense, 5'-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3 '; GAPDH Sinn, 5'-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3 '; Antisense, 5'-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3 '. Die pGPU6 /GFP /Neo (grün fluoreszierendes Protein, Neomycin) Vektor (Genepharma Unternehmen, Shanghai, China) wurde für die Plasmidkonstruktion verwendet. Die Nucleotide wurden geglüht und in die BamHI- und HindIII-Stellen und umgewandelt in DH5a-kompetenten E. coli. Dual Kanamycin /Neomycin-resistente Kolonien wurden ausgewählt, und die Vektorsequenzen durch Restriktionsverdau und DNA-Sequenzierung bestätigt.

Die EGFL7 cDNA kodierend für die 533 bis 1353 Aminosäuresequenz wurde subkloniert in einen pEX-2-Plasmid-Vektor (Genepharma, Shanghai, China) durch BglII /EcoRI Doppel Verdauung und pEX-2-EGFL7 bezeichnet. Das rekombinante Plasmid wurde in DH5a-kompetenten E. coli und der Vektorsequenz durch PCR amplifiziert. DNA-Sequenzierung bestätigte, dass das rekombinante Plasmid ein EGFL7 Genfragment identisch mit der in GenBank (GenBank Nr. NM_016215.3) enthalten ist. Kanamycin /Neomycin-resistente Kolonien wurden selektiert und die Sequenz durch Restriktionsverdau und DNA-Sequenzierung bestätigt. Alle Primer wurden entworfen und synthetisiert durch Genepharma (Shanghai, China).

Stabile Transfektion und G418 Auswahl

ein EGFL7-underexpressing Klon (und entsprechende Steuerung) herzustellen, wurden BGC823 Zellen ausgesät in sechs -Wanne Kulturplatten mit 1 × 10 ^{6 /Vertiefung und für 24 h in RPMI 1640-Medium mit 10% FBS in einer befeuchteten 5% CO _{2 -Atmosphäre bei 37 ° C gehalten wird, inkubiert. Die Zellen wurden mit 4 ug pGPU6 /GFP transfiziert /Neo-EGFL7-shRNA1, pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA2, pGPU6 /GFP /Neo-unspezifische-shRNA oder pGPU6 /GFP /Neo-GAPDH-shRNA unter Verwendung von Lipofectamin 2000 Transfektionsreagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) nach den Anweisungen des Herstellers. Nach 24 h wurden die Zellen in G418 (Sigma, USA, 600 &mgr; g /ml) für die anfängliche Selektion, verdünnt, plattiert mit geringer Dichte (~ 1 Zelle /Vertiefung) und gehalten in Kulturmedium mit G418 bei der Hälfte der anfänglichen Auswahl Konzentration ergänzt inkubiert für weitere 3 Wochen. Die resultierenden stabilen Zelllinien wurden BGC2-13 (Zelllinie aus pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 stabile Transfektion führt) und BGC-NC genannt, und für nachfolgende Studien erweitert. Das Expressionsniveau von EGFL7 wurde durch Western-Blot-und Echtzeit-RT-PCR untersucht. Um eine überexprimierenden Linie und angepassten Kontroll etablieren, waren MKN28 Zellen ausgesät, transfiziert mit 4 ug PEX-2-EGFL7 oder pEX-2 Plasmide und ausgewählt wie für BGC823 Zellen der Ausnahme, dass 500 ug /ml G418 beschrieben wurde für die anfängliche Auswahl verwendet. Die resultierenden stabilen Zelllinien wurden MKN28-EGFL7 und MKN28-NC genannt. Die Expressionsniveaus von EGFL7 in G418-resistenten Klone wurden durch Western-Blot und quantitative real-time PCR (qRT-PCR) ausgewertet.}}

Western-Blot-Analyse

Nachdem die Zellen 80% -95% erreicht Zusammenfluss wurde die gesamt-Protein unter Verwendung von Zelllysat Extraktionspuffer (Beyotime, China), die Protease-Inhibitor (1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid). Lysate Gesamtproteinkonzentration wurde unter Verwendung eines Bicinchoninsäure-Protein-Assay-Kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) bestimmt. Gleiche Mengen von Protein (25 ug) von jeder Behandlungsgruppe wurden pro Gelspur um 8% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt und auf Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membranen (Millipore, Billerica, USA). Die Membranen wurden nacheinander mit Blockierungspuffer, bestehend aus Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), enthaltend 5% fettfreier Trockenmilch für 2 h bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4 ° C in dem gleichen Puffer mit einer der folgenden primären Antikörpern inkubiert: anti- EGFL7 (1:500; Abcam Cambridge Wissenschaft, UK). Anti-E-Cadherin, anti-Vimentin, Anti-Snail (all at 1:1000; Cell Signaling Technology, CST, USA), anti-GAPDH (1:10000, Protech), anti-EGFR, anti-phospho-EGFR, Anti-AKT, anti-phospho-AKT, anti-ERK und Anti-Phospho-ERK (all 1:800, Anbo Biotech Co., Ltd., USA). Immunmarkierten Membranen wurden dann mit einem HRP-konjugiertem sekundärem Antikörper inkubiert (1:2000, Immunology Consultants Laboratory, Inc., USA) für 2 h bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen mit TBST wurden die Proteinbanden nach den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung des verstärkten Chemilumineszenz-Detektionssystem (Advansta Corporation in Menlo Park, Kalifornien, USA) sichtbar gemacht. Die Expression von GAPDH wurde als Ladekontrolle und Proteine ​​unter Verwendung UTHSCSA Image Tool 3.0 quantifiziert verwendet. Zielproteinexpression wurde als Band Intensitätsverhältnis des Zielproteins zu GAPDH berechnet.

RNA-Extraktion und PCR-Analyse

Die Zellen wurden lysiert in Trizolreagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und gesamt-RNA wurde gemß den Anweisungen des Herstellers. Ersten Belastung cDNAs wurden durch das PrimeScript RT Reagenzienkit synthetisiert mit gDNA Radiergummi (Takara, Otsu, Japan) und durch PCR amplifiziert, die folgenden spezifischen Primer verwendet: EGFL7 Sinn, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; Antisense, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '. Die cDNA von GAPDH amplifiziert wurde für die Menge an cDNA in jeder Probe vorhanden zu steuern (Sense, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; Antisense, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'). PCR-Amplifikation wurde bei 94 ° C für 5 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 30 s durchgeführt wird, 57 ° C für 30 s und 72 ° C für 40 s. PCR-Produkte wurden auf 1,0% Agarosegelen und Ziel Genexpression als das Verhältnis des Zielgens Band Intensität, die der GAPDH mit Image Tool 3.0 (The University of Texas Health Science Center in San Antonio, Texas, USA).

Real-time PCR

Die Reaktionsmischung für Echtzeit-PCR von 10 &mgr; l Premix Ex Taq (Probe qPCR), 0,2 &mgr; M jedes EGFL7 und GAPDH Primer (unten) bestand, 0,2 pmol /TaqMan-Sonden ml (EGFL7 oder GAPDH) und 0,4 ul ROX (tetrapropano-6-carboxyrhodamin) Referenzfarbstoff II (Takara Bio, Shiga, Japan). Die Mischung wurde mit 2 ul cDNA in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte kombiniert MicroAmp (Applied Biosystems, CA, USA) und destilliertes Wasser verwendet wurde, auf ein Endvolumen von 20 ul einzustellen. Die folgenden Primer wurden entworfen, um die Primer Premier 6.0 Software-Paket (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA): EGFL7: vorwärts, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; umkehren, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '; GAPDH: vorwärts, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; umkehren, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. Alle Reaktionen wurden auf einem 7500 Real-Time-PCR-System (Applied Biosystems, CA, USA) durchgeführt. Thermozyklus-Bedingungen waren anfängliche Denaturierung bei 95,8 ° C für 30 s um 40 Amplifikationszyklen bei 95,8 ° C für 6 s und 60,8 ° C für 30 s.

Ähnliche Versuchsbedingungen die Expression anderer zur Beurteilung verwendet wurden Gene, die mit den folgenden Primern: E-Cadherin: vorwärts, 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3 '; umkehren, 5'-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; Vimentin: vorwärts, 5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3 '; umkehren, 5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3 '; Schnecke: vorwärts, 5'-TGCTCCACAAGCACCAAGA-3 '; umkehren, 5'-GCAGAGGACACAGAACCAGAAA-3 '; GAPDH: vorwärts, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; umkehren, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. Die Reaktionsmischung für die Echtzeit PCR bestand aus 10 ul SYBR Premix Ex TaqTM II, 1,6 &mgr; l von jedem Primer (0,4 &mgr; M), 0,4 &mgr; l ROX Referenzfarbstoff, 2 &mgr; l Matrizen-cDNA und 6 &mgr; l Diethylpyrocarbonat-behandelten Wasser. für 10 s anfängliche Denaturierung bei 95 ° C, gefolgt von 40 Amplifikationszyklen bei 95 ° C für 5: Echtzeit-PCR wurde auf einem 7500 Real-Time-PCR-System (Applied Biosystems, CA, USA) mit folgenden Thermozyklus Bedingungen durchgeführt, s und 60 ° C für 34 s.

Cell Proliferation Assay

die Zellproliferation wurde durch die 3- [4,5-Dimethylthiazol-2-yl] -2,5 diphenyl tetrazoliumbromid geschätzt (MTT) Lebendzellassay. Zellen wurden bei 2000 auf 96-well-Platten ausplattiert /Vertiefung und kultiviert für 12, 24, 48, 72 und 96 h. Dann wurden 20 ul MTT (Sigma) Stammlösung (5 mg /ml) wurden in jeder Vertiefung 200 ul Medium zugegeben und die Platten für weitere 4 h bei 37 ° C inkubiert wurden. Nach sorgfältiger Aspiration des Kulturmediums wurden 150 &mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO) zu jedem Well hinzugefügt Formazan-Kristalle aus MTT durch lebende Zellen gebildete aufzulösen. Die Platten wurden auf einem Rotationsplattform für 10 min und die Absorption bei 490 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegerät.

Platte Colony Formation Assay

Zellen wurden bei 200 /well in der gleichen sechs- gemessen geschüttelt Well-Platten wie für andere Assays verwendet Koloniebildung unter zellhaftenden Bedingungen zu bewerten. Nach 10 Tagen wurden die Zellen mit 1% Giemsa gefärbt, und die Anzahl der sichtbaren Kolonien wurde gezählt. Die relative Klon Bildung Index wurde als mittlere Anzahl der Kolonien /Anzahl der ausgesäten Zellen × 100%.

Scratch Wundheilung Assays

Zur Prüfung der Zellmigration berechnet, 5 x 10 ^{5 Zellen /Vertiefung wurden in Platten mit sechs Vertiefungen, beschichtet mit 10 &mgr; g /ml Fibronectin (FN) und inkubiert für 24 h plattiert. Die Monoschicht wurde dann durch einen einzigen Kratzer mit einer 200 ul Pipettenspitze aufgebrochen. Mikrographien wurden bei 0 erhalten, 12, 24, 36, 48 und 72 h post-scratch mit einem Phasenkontrastmikroskop (Olympus BX51, Japan). Die Anzahl der Zellen innerhalb des zerkratzt (unfruchtbar) Bereich der Mikrowell wurde in fünf Feldern gezählt (Vergrößerung: × 200). Alle Experimente wurden doppelt durchgeführt.}

In-vitro-
Invasion und Migration Assay

Zellinvasion und Migration wurden Transwell Kammern ausgewertet (Corning, New York, USA). Invasionsassays wurden in Transwell Kammern durch Polycarbonatmembranfiltereinsätze (8 um Poren) für 24-Well-Platten getrennt durchgeführt. Jede Kammer wurde mit 100 &mgr; l von 1:20 Matrigel (Becton, Dickinson and Company, New York, USA) in kaltem RPMI 1640 beschichtet über Nacht bei 4 ° C. Anschließend wurden Zellen (5 × 10 ^{4 /ml x 200 ul) wurden in der oberen Kammer in serumfreies Medium ausgesät. Etwa 800 &mgr; l konditioniertes Medium mit 10 ug /ml Fibronektin wurde in das untere Kompartiment der Transwell Kammer als chemoattractant platziert. Nach Inkubation für 24 h bei 37 ° C wurden die restlichen Tumorzellen auf der oberen Oberfläche der Kammer durch Abwischen mit nassen Wattetupfer entfernt. Eindringenden Zellen auf der unteren Oberfläche wurden mit 4% Paraformaldehyd fixiert, mit Kristallviolett gefärbt und unter einem Phasenkontrastmikroskop (Olympus, Japan) bei × 200 gezählt. Vier unabhängige Experimente wurden in dreifacher Ausführung für alle Behandlungsbedingungen durchgeführt. In-vitro-
Migrationsassays wurden unter den gleichen Bedingungen wie die Invasion Assays durchgeführt, aber mit unbeschichteten unteren Kammern und unter Verwendung von 1 x 10 5 Zellen /ml (200 ul).}

Anoikis Assay

Poly-Hydroxyethylmethacrylat (Poly-HEMA, Sigma-Aldrich), die auf Kulturplatten und anderen Wachstumsoberflächen Zelladhäsion hemmt, wurde in 95% Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 12 mg /ml rekonstituiert. Zur Herstellung von Poly-HEMA-beschichteten Platten wurden 2 ml dieser Lösung wurden zu jeder Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen und über Nacht unter einer Laminar-Flow-Gewebekulturhaube trocknen. Dann wurden 5 x 10 ^{4-Zellen in dreifacher Ausfertigung in jeder Poly-HEMA-beschichtete Vertiefung mit regelmäßigen Kulturmedien plattiert. Nach 24 h wurden die GC-Zellen geerntet, mit PBS gespült und in 500 &mgr; l Bindungspuffer aus einem Annexin V-PE /7-AAD Apoptosis Detection Kit (eBioscience, San Diego, USA) resuspendiert. Resuspendierten Zellen von jeder Probe wurden aliquotiert (100 ul) in vier Röhrchen. Drei Rohre wurden entweder mit Annexin V-PE markiert, 7-AAD, oder beides, während die vierte als unmarkierte Kontrolle verwendet wurde. Jede Charge wurde dann mittels Durchflusszytometrie auf einem Beckman Coulter FC 500 Zähler (Beckman Coulter, Inc.) analysiert. Der Prozentsatz an apoptotischen Zellen wurde als die Summe der Zellfraktionen Anzeige frühen Apoptose (Annexin-V-positiven) und späte Apoptose (7-AAD-positive) abgeleitet.}

Xenograft Nude Mouse Model

Xenografting von GC-Zelllinien wurde für die Pflege und Verwendung von Labortieren nach Ansicht der nationalen Richtlinien durchgeführt (Veröffentlichung Nr. 86-23, überarbeitet 1985), von der Animal Care und Use Committee des Dritten Xiangya Hospital, Central South University genehmigt wurde ( LLSC [LA] 2013-0010) und entsprach aktuellen chinesischen Gesetz über den Schutz von Tieren (LLSC [LA] 2013-0010). Alle Anstrengungen unternommen wurden, die Anzahl der Mäuse zu minimieren verwendet und ihr Leiden.

Fünfunddreißig weibliche Balb /c Nacktmäuse im Alter von 4 bis 6 Wochen wurden von Slac Labortier Co. Ltd. erworben (Shanghai, China) und in einzeln belüfteten Käfigen untergebracht. Die Mäuse wurden zufällig eingeteilt in BGC823, BGC-NC, BGC2-13, MKN28, MKN28-NC, MKN28-EGFL7 und Kontrolle PBS-Gruppen (n = 5 Mäuse /Gruppe). Kultivierte Zellen wurden geerntet und resuspendiert in PBS mit 1 × 10 ^{8 Zellen /0,2 ml. Die Suspension wurde subkutan in die linke obere Extremität jedes Nacktmaus mit Ausnahme derjenigen in der Kontrollgruppe injiziert, die mit 0,2 ml PBS injiziert. Das Tumorwachstum wurde alle 3 Tage durch Messen des Tumordurchmesser mit Messschieber ausgewertet. Tumorvolumen (TV) wurde nach der Formel berechnet wird: TV (mm 3) = d 2 × D /2, wobei d und D sind die kürzesten und die längsten Durchmesser, respectively. Die Mäuse wurden 4 Wochen nach der Zellimplantation getötet und die Tumore wurden entnommen und gewogen. Färbung; Alle Lebern wurden für die Metastasierung von Hämatoxylin und Eosin (E H &) untersucht. Die Tumore wurden in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und geschnitten in 4 um dicke Abschnitte. EGFL7-Expression wurde durch Immunhistochemie bestimmt, wie oben beschrieben.}

Statistische Analysen

Alle statistischen Analysen wurden durchgeführt unter Verwendung von SPSS Version 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) für Windows. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) von zumindest drei unabhängigen Experimenten. Gruppenmittel wurden verglichen durch Einwegvarianzanalyse (ANOVA) mit Student-Newman-Keuls (SNK) oder am wenigsten signifikante Differenz (LSD) Tests für Post-Hoc-paarweise Vergleiche. Der Spearman Rangkorrelationskoeffizient wurde verwendet, um die Korrelationen zwischen EGFL7 und EMT-verwandte Protein-Expressionsniveaus in chirurgisch entfernt Magenkrebs Gewebe zu bestimmen. A P
< 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen

Ergebnisse |

EGFL7 Expression wurde in menschlichen Magenkrebszelllinien Erhöhte

Western-Blot und RT-. PCR wurden durchgeführt EGFL7 Expression in den humanen GC-Zelllinien SGC7901, BGC823, MKN45 und MKN28 zu, dass in normalen Magenschleimhaut epithelialen GES-1-Zellen zu vergleichen. Erhöhte EGFL7 Niveaus wurden in allen vier GC-Zelllinien im Vergleich zu GES-1, mit BGC823 und MKN28 Anzeige der höchsten und niedrigsten EGFL7 Ausdruck jeweils sowohl auf der Protein- und mRNA-Spiegel (1A und 1B) gefunden. Daher BGC823 und MKN28 wurden in nachfolgenden Experimenten verwendet, um die Wirkungen von EGFL7 Expression auf die Proliferation, Migration und metastatisches Potential zu bewerten. Wir verwendeten stabilen shRNA Transfektion EGFL7 Expression in BGC823 Zellen und ein menschliches EGFL7 High-Expressionsplasmid (pEX-2-EGFL7) zu erhöhen EGFL7 Expression in MKN28 Zellen.

Wir konstruierten zwei shRNA Plasmid-Vektoren Targeting EGFL7 zu unterdrücken mRNA und führte qRT-PCR, die Wirksamkeit dieser Kandidaten shRNA-Sequenzen zu bewerten EGFL7 im Vergleich zu nicht-spezifischen Sequenzen zu unterdrücken. Die shRNA1 und shRNA2 Sequenzen erreicht 75% und 30% ige Hemmung der EGFL7, bzw. (1C), so dass die effizientere shRNA1 wurde für alle nachfolgenden Experimente verwendet. Die BGC823 Linien transfiziert stabil mit pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 oder pGPU6 /GFP /Neo-unspezifische-shRNA wurden BGC2-13 und BGC-NC bezeichnet sind. Die MKN28 Linien stabil mit pEX-2-EGFL7 transfiziert und pEX-2-unspezifische MKN28-EGFL7 und MKN28-NC wurden jeweils bezeichnet. Die Expressionsniveaus von EGFL7 Protein und mRNA in G418-resistente Klone wurden auch durch Western-Blot (Figur 1D) und Echtzeit-RT-PCR (1E) bewertet. Die Ergebnisse zeigten deutlich EGFL7 Ausdruck in BGC2-13 Zellen verringerte sich im Vergleich zu BGC-NC-Zellen und signifikant erhöhte Expression in MKN28-EGFL7 Zellen im Vergleich zu MKN28-NC-Zellen (alle P
< 0,05). Es gab keine signifikanten Unterschiede in der mRNA und Protein-Expression zwischen BGC-NC und BGC Zellen oder zwischen MKN28-NC und MKN28 Zellen (alle P
> 0,05).

EGFL7 Promoted GC Zellinvasion und Migration, aber nicht GC-Zellproliferation
beeinflußte

Um die Rolle der EGFL7 in GC Progression untersuchen wir zunächst untersucht, ob EGFL7 Silencing oder Überexpression verändert die proliferative, invasive und Migrations Kapazitäten von GC-Zellen. Scratch Wundheilung wurde verwendet, Migration von stabil transfizierten Zellen zu messen. Eine Wunde wurde in GC-Zellmonoschichten durch eine einzige Kratz- und der Anzahl der Zellen in der Kratzzone verglichen bei 0 und 48 h erzeugt. Schließung der Wunde war deutlich langsamer in BGC2-13 Kulturen (underexpressing EGFL7) im Vergleich zu nativen BGC823 und BGC-NC Kulturen (32% vs.
100% und 98%, die beide P
< 0,05) (2A). Im Gegensatz dazu war Schließung deutlich schneller in MKN28-EGFL7 Kulturen (überexprimierenden EGFL7) im Vergleich zu MKN28 und MKN28-NC Kulturen (99% vs.
49% und 50%, die beide P
< 0,05) (2B). Darüber hinaus gewickelt näher an der einige Zeit nach der Kratzer (48 h) war größer in hoher EGFL7-exprimierenden Wildtyp BGC823 Zellen im Vergleich zu Low-exprimierenden Wildtyp MKN28 Zellen, was darauf hinweist, dass endogene Expressionsniveaus auch die Migration auswirken.

Transwell-Assays wurden diese Ergebnisse und weiter zu untersuchen, um die Wirkung von EGFL7 auf die invasive Potential von BGC823 Zellen zu bestätigen durchgeführt, MKN28 Zellen, und die jeweiligen stabilen Ausdruckslinien in Matrigel. Es gab deutlich weniger EGFL7-underexpressing (BGC2-13) Zellen in der Matrigel im Vergleich zu BGC-NC und BGC823 Zellen (25 ± 3,1 vs
76 ± 2,9 und 79 ± 5,7 Zellen /Vertiefung;. Beide P
< 0,05), was darauf hinweist, dass EGFL7 signifikant reduziert invasive Kapazität (2C) Unterexpression. In ähnlicher Weise wurde die Anzahl der BGC2-13 Zellen der unteren Matrigel frei und in Transwell Migrationsassays erreicht signifikant reduziert im Vergleich zu BGC823 und BGC-NC-Zellen (19 ± 1,1 vs.
53 ± 2,9 und 54 ± 2,6 , beide P
< 0,05) (Abbildung 2C). Im Gegensatz dazu EGFL7 Überexpression in MKN28 Zellen deutlich verbessert sowohl Invasion in Matrigel (MKN28-EGFL7: 79 ± 6,19 Zellen /Well, MKN28-NC: 40 ± 2,00 Zellen /Well, MKN28: 41 ± 4,22; beide P
< 0,05; 2D) und Migration (MKN28-EGFL7: 67 ± 4,16, MKN28-NC: 33 ± 5,92, MKN28: 35 ± 3,7; beide P
< 0,05; 2D).

• PLoS ONE: A 346 Fallanalyse für laparoskopische Spleen-Preserving No.10 Lymphknotendissektion für Proximale Magenkrebs: ein einziges Zentrum Study
• PLoS ONE: Die Überexpression von Nuclear apoptoseinduzierende Faktor 1 die Proteomik Profil von menschlichen Magenkrebszelle MKN45 Altered und Zellzyklusarrest in G1 /S-Phase induziert