Финансирование:. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (№ 81001080) и инвестиционный фонд открытого типа за ценные и инструменты Центрального Южного университета (№ JJ3121). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение Пациенты и ткани Коллекция Количественное иммуногистохимического сигналов. Клеточные линии и культуры линий человека GC клеток SGC7901 (умеренно дифференцированной аденокарциномы), BGC823 (слабо дифференцированы аденокарциномы), MKN28 (хорошо дифференцированной аденокарциномы), и MKN45 (слабо дифференцированы аденокарциномы), а также нормальные слизистую оболочку желудка эпителиальные ГЭС-1 клетки были приобретены из коллекции типовых культур китайской академии наук (Шанхай, Китай). Все клетки культивировали и поддерживали в Институте Roswell Park Memorial (RPMI) 1640 (Гибко Biocult, Paisley, UK), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Гибко биотехнологии), 100 ед /мл пенициллина и 100 мкг /мл стрептомицина при 37 ° с в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО <суб> 2. шпилька РНК Короткие (shRNA) и рекомбинантной экспрессионной плазмиды PEX-2-EGFL7 Экстракция РНК и ПЦР-анализ ПЦР в реальном времени Аналогичные условия эксперимента были использованы для оценки экспрессии других гены со следующими праймерами: E-кадгерина: вперед, 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3 '; реверс, 5'-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; виментин: вперед, 5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3 '; реверс, 5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3 '; Улитка: вперед, 5'-TGCTCCACAAGCACCAAGA-3 '; обратный, 5'-GCAGAGGACACAGAACCAGAAA-3 '; GAPDH: вперед, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; реверс, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. Реакционная смесь для ПЦР в реальном времени состоял из 10 мкл SYBR Премикс Ex TaqTM II, 1,6 мкл каждого праймера (0,4 мкМ), 0,4 мкл ROX Reference Dye, 2 мкл кДНК шаблона и 6 мкл диэтилпирокарбонат обработанной воды. ПЦР в реальном времени проводили на 7500 системе ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems, CA, США) со следующими условиями термоцикла: начальная денатурация при 95 ° С в течение 10 секунд, затем 40 циклов амплификации при 95 ° С в течение 5 s и 60 ° C в течение 34 сек. пролиферации клеток Анализ Для анализа миграции клеток, 5 × 10 5 клеток /лунку высевали в шесть-луночных планшетах, покрытых 10 мкг /мл фибронектина (FN) и инкубировали в течение 24 ч. Монослой затем разрушали одной царапины с использованием 200 мкл кончиком пипетки. Микрофотографии получали при температуре от 0, 12, 24, 36, 48 и 72 ч после повреждения с фазово-контрастным микроскопом (Olympus BX51, Япония). Число клеток в пределах поцарапал (бесплодной) области микролуночные подсчитывали в пяти областях (увеличение: х200). Все эксперименты проводились в двух экземплярах. EGFL7 Expression повышался у человеческого рака желудка клеточных линий Мы построили две плазмидные векторы shRNA ориентации EGFL7 мРНК и провели QRT-PCR для оценки эффективности этих кандидатов shRNA последовательностей для подавления EGFL7 по сравнению с неспецифическими последовательностями. Последовательности shRNA1 и shRNA2 достигли 75% и 30% -ное ингибирование EGFL7, соответственно (рис 1C), так что более эффективная shRNA1 использовалась во всех последующих экспериментах. Линии BGC823 стабильно трансфицированные pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 или pGPU6 /GFP /Neo-неспецифической-shRNA были назначены BGC2-13 и BGC-NC, соответственно. Линии MKN28 стабильно трансфицированные PEX-2-EGFL7 и PEX-2-неспецифической были назначены MKN28-EGFL7 и MKN28-NC, соответственно. Уровни экспрессии белка EGFL7 и мРНК в G418-резистентные клоны также оценивали с помощью Вестерн-блоттинга (рис 1D) и в режиме реального времени RT-PCR (рис 1E). Результаты показали заметно снизились EGFL7 экспрессию в клетках BGC2-13 по сравнению с клетками КУП-NC и значительно повышенную экспрессию в клетках MKN28-EGFL7 по сравнению с клетками MKN28-NC (все P Для того, чтобы исследовать роль EGFL7 в прогрессировании ГХ, мы сначала исследовали EGFL7 глушителей или сверхэкспрессия изменили ли пролиферативного, инвазивного и миграционные возможности GC клеток. Царапины заживления ран был использован для измерения миграции, стабильно трансфицированных клеток. Рана была сгенерирована в GC монослоев клеток с помощью одной царапины, а количество клеток в зоне нуля по сравнению с 0 и 48 ч. Закрытие раны была значительно медленнее в BGC2-13 культурах (underexpressing EGFL7) по сравнению с нативным BGC823 и культур КУП-NC (32% против.
<р> рак желудка (GC) является четвертой наиболее распространенной злокачественной опухолью и второй ведущей причиной рака, связанных с смертности во всем мире [1], [2]. Примерно половина всех случаев GC имеют место в странах Восточной Азии, в частности, с высокой частотности в Японии, Корее и Китае [3], [4]. Прогресс в системном лечении GC значительно увеличилось выживания в краткосрочной перспективе; Тем не менее, пятилетняя выживаемость больных GC остается низким из-за рецидива и метастазирования [5]. К тому же, большинство больных с впервые диагностированным GC уже показывают метастатическое заболевание, которое представляет серьезную терапевтическую проблему для онкологов [6].
<Р> эпидермальный ростовой фактор-подобный домен белок, содержащий 7 (EGFL7), также известный как сосудистый эндотелиальный статина , является эндотелиальных клеток, полученных секретируется фактор, который регулирует образование сосудистой трубки. Паркер и др. [7] было показано, что EGFL7, имеет решающее значение для ангиогенеза во время гиреллы эмбриогенеза [8]. Недавние исследования сообщили, повышенная экспрессия EGFL7 в нескольких опухолей и раковых клеточных линий, в том числе рака почки, злокачественных глиом, гепатоцеллюлярный карцином и рака толстой кишки [7] - [10]. Ранее мы показали, что EGFL7 также избыточно экспрессируется в желудочном карциномы [11], и выражение было достоверно коррелирует с патологическими характеристиками, клиническим течением, плохим прогнозом и метастазирования [10], [12]. Поэтому, EGFL7 является кандидатом прогностическим фактором для прогрессирования рака и метастазов. Однако механизмы, лежащие в основе онкогенных эффектов EGFL7 неясны.
<Р> Метастазы это многоступенчатый процесс, который включает в себя эпителиально-мезенхимальных перехода (EMT), в котором поляризованный эпителиальные клетки преобразуются в мезенхимальных клеток [13], фенотип с большей инвазивной и миграционный мощностью [14]. EMT также обратимый процесс, который часто возникает при инвазивной перед многими метастатического рака [15]. Несколько исследований показали, что EGF способствует миграции раковых клеток и вторжение одновременно с активацией EMT [16] - [18]. Важно отметить, что EGFL7 содержит два EGF-подобных доменов, предполагая некоторую функциональную гомологию [9], [12]. Тем не менее, является ли на самом деле делает EGFL7 повышения EMT и способствуют метастазированию рака желудка еще предстоит определить. Кроме того, молекулярные механизмы, с помощью которых регулируется ЕМТ в GC остаются неизвестными. Цинковый палец транскрипционный репрессор Улитка имеет решающее значение для экспрессии гена перепрограммирования во время EMT, в частности, за репрессии межклеточной адгезии белка эндотелиальной (Е) -cadherin, потеря которых считается важным ранним событием в EMT и необходимо для последующего метастазирования [ ,,,0],19].
<р> настоящее исследование с целью определить, является ли EGFL7 способствует метастазированию, вызывая EMT. Мы обнаружили, что EGFL7 избыточная экспрессия активирует EGFR-AKT пути, вызывает EMT, а также способствует инвазии клеток GC в пробирке
и метастазирование В естественных условиях
.
Материалы и методы <бр>
<р> Желудочный ткани карциномы были получены от 79 пациентов GC (58 мужчины и 21 женщин), обработанных с помощью хирургической резекции в отделении хирургии, Xiangya больницы, Центральный южный университет (Китай). Перестройки были проведены с января 2010 года по декабрь 2012 года пациенты были 54,7 лет в среднем (диапазон: от 28 до 82 лет). И не получили ни химиотерапии, ни лучевой терапии до операции
<р> Пациенты были проинформированы о том, что хирургические образцы были бы использоваться для обычного патологического диагноза и что оставшиеся ткани могут быть использованы для исследования. Никакие личные данные пациента не требуется для этого исследования и протоколы не несли никакого риска, поэтому только вербальное информированное согласие требуется от пациентов. Протокол был одобрен Комитетом по этике Xiangya больницы, Центральный южный университет (разрешение номер: 201311389) от.
<Р> Болезнь постановка была определена в соответствии с шестым изданием TNM постановка системы американского Объединенного комитета по вопросам рака [ ,,,0],20], [21]. Опухоли были хорошо дифференцированы аденокарциномы желудка в 12 случаях, умеренно дифференцированы в 34 случаях, и плохо дифференцируются в 33 случаях. Все образцы были сразу фиксировали 10% -ным формалином, обезвоженной, и погруженных в парафин. Точные клинические данные и патологический диагноз были доступны для всех пациентов.
Иммуногистохимия
<р> Для иммуногистохимии, приготовленные образцы инкубировали при 60 ° С в течение 15 ч и режут на 4 мкм срезы толщиной, депарафинировали в скипидар, сушат, и регидратации в убывающем этанол: дистиллированная градиентом воды. Активность эндогенной пероксидазы инактивируют путем инкубации в течение 30 мин в 0,3% перекиси водорода в 0,01 М фосфатно-солевом буферном растворе (PBS). Срезы затем инкубировали в течение 15-20 мин в цитратном буфере (рН 6,0) при 95 ° C для извлечения антигенов, блокировали 5% нормальной козьей сыворотке в 0,01 М PBS в течение 15 мин при 37 ° С, и инкубировали с первичными антителами, разбавленными блокирующий раствор в течение ночи при 4 ° с во влажной камере. Были использованы следующие первичные антитела: мышиное анти-EGFL7, моноклональное антитело (Abcam, США, 1:400) и кроличьи моноклональных антител, выработанных против E-кадгерина (ДКБ, США, 1:1000), виментина (ДКБ, США, 1:1000 ), улитка (Proteintech, США, 1:1000) и CD34 (Boster, Китай, 1:500). После промывки образцы последовательно инкубировали с биотинилированным вторичным антителом и стрептавидин-пероксидаза хрена (HRP) рабочего раствора авидин. Иммунноокрашивания визуализировали с помощью набора субстрата ДАБ Чжуншань Golden Bridge Company (Китай) в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя. И, наконец, срезы контрастно гематоксилином (Vector Laboratories, США), дегидратируют в восходящем этаноле: дистиллированная вода градиент, и установленный на салазках с использованием монтажного предметный столик Permount носители (Fisher Scientific, США)
<р> Все GC и окружающие не-опухолевые ткани желудка были подтверждены гистологически двумя независимыми патологи (К.-SW и J.-HL) слепым к первоначальному диагнозу. Иммунологическое оценивали с помощью полуколичественного метода, который считается как интенсивность и распределение окраски [22]. Если коротко, то пять значений полей были выбраны случайным образом при малом увеличении (100 ×, Olympus BX51, Токио, Япония), и 200 опухолевых клеток, подсчитанных от каждого поля. Интенсивность окраски оценивали следующим образом: 0, отсутствие окрашивания; 1, слабое желтое окрашивание; 2, желтое окрашивание; 3, коричневый окрашивание. Положительные клетки характеризуются четкой границы и желтого или коричневого окрашивания, отличного от фона. Процент положительных клеток (РР) оценивали следующим образом: 0, 0%; 1, 1% -25%; 2, 26% -50%; 3, 51% -75%; 4, 76% -100%. Две оценки были объединены, чтобы получить следующую классификацию: отрицательное окрашивание, образцы с иммунореактивного балла (IRS) от 0 до 2; слабоположительны окрашивание, образцы с IRS от 3 до 5; сильно положительное окрашивание, образцы с IRS от 6 до 7. Образцы, которые характеризовались слабо и сильно положительное окрашивание были включены в статистический анализ.
<р> Для создания клеточных линий с гиперэкспрессией или underexpressing EGFL7, нативные клеточные линии, стабильно трансфицированные вектором экспрессии или целевой shRNA. В shRNA последовательности EGFL7 человека были разработаны в соответствии с последовательностью ДНК EGFL7 человека (GenBank NO NM_016215.3.) Проектировщиком 3.0 программного обеспечения (Genepharma, http://www.genepharma.com) и выполняет поиск BLAST (HTTP: //WWW. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Целевые последовательности, сравнивали с человеческой базе данных генома поиска BLAST, чтобы исключить высокую степень гомологии с другими последовательностями, кодирующими. Последовательности EGFL7-гомо-333 и EGFL7-гомо-887 были определены в качестве целевых объектов для конкретного EGFL7 shRNA. Кроме того, одна неспецифический последовательность (свалка shRNA) был разработан в качестве отрицательного контроля, а последовательность GAPDH, была разработана в качестве внутреннего контроля. Последовательности shRNA распределились следующим образом:
<р> EGFL7-shRNA1 против EGFL7-гомо-333: смысловой, 5'-CACCGGTGCTGCTGATGTGGCTTTCAAGAGAAGCCACATCAGCAGCACCTTTTTTG-3 '; антисмысловая, 5'-GATCCAAAAAAGGTGCTGCTGATGTGGCTTCTCTTGAAAGCCACATCAGCAGCACC-3 '; EGFL7-shRNA2 против EGFL7-гомо-887: смысловой, 5'-CACCGAGTGGACAGTGCAATGAATTCAAGAGATTCATTGCACTGTCCACTCTTTTTTG-3 '; антисмысловая, 5'-GATCCAAAAAAGAGTGGACAGTGCAATGAATCTCTTGAATTCATTGCACTGTCCACTC-3 '; неспецифическая чувство, 5'-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3 '; антисмысловая, 5'-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3 '; GAPDH смысл, 5'-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3 '; антисмысловая, 5'-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3 '. PGPU6 /GFP /Neo (зеленый флуоресцентный белок, неомицин) вектор (Genepharma компании, Шанхай, Китай) был использован для конструкции плазмиды. Нуклеотиды, отжигали и вставляли в сайты BamHI и HindIII и трансформировали в DH5a-компетентные клетки Е.coli. Двойные канамицину /Неомицин устойчивые колонии были отобраны и векторные последовательности подтверждали рестрикционным перевариванием и секвенирования ДНК.
<Р> у EGFL7 кДНК, кодирующую последовательность аминокислот 533-1353, субклонировали в плазмидный вектор PEX-2 (Genepharma, Шанхай, Китай) с помощью BglII /EcoRI двойного переваривания и назначил PEX-2-EGFL7. Рекомбинантная плазмида была амплифицирована в DH5a-компетентной E.coli и последовательности вектора амплифицируют с помощью ПЦР. Секвенирование ДНК подтвердил, что рекомбинантный плазмид содержал фрагмент гена EGFL7, идентичный таковому в GenBank (GenBank NO. NM_016215.3). Канамицин /неомицину колонии, устойчивые были выбраны, и последовательность подтверждали рестрикционным перевариванием и секвенирования ДНК. Все праймеры были разработаны и синтезированы Genepharma (Шанхай, Китай).
Стабильная Трансфекция и G418 Выбор
<р> Чтобы установить EGFL7-underexpressing клон (и соответствующий контроль), BGC823 клетки высевают в шесть -Ну культуральные планшеты при 1 × 10 6 /лунку и инкубировали в течение 24 ч в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS в увлажненной 5% CO <суб> 2 атмосфера поддерживалась на уровне 37 ° C. Клетки трансфицировали 4 мкг pGPU6 /GFP /нео-EGFL7-shRNA1, pGPU6 /GFP /нео-EGFL7-shRNA2, pGPU6 /GFP /нео-неспецифический-shRNA или pGPU6 /GFP /нео-GAPDH-shRNA использованием Липофектамин 2000 трансфекция реагента (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Через 24 ч клетки инкубировали в G418 (Sigma, США, 600 мкг /мл) в течение первоначального выбора, разбавленный, высевали при низкой плотности (~ 1 клетка /лунку) и выдерживают в культуральной среде, содержащей G418 в половину от начальной концентрации отбора еще в течение 3-х недель. Полученные стабильные клеточные линии были названы BGC2-13 (линия клеток в результате pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 стабильной трансфекции) и BGC-NC, а также расширить для последующих исследований. Уровень экспрессии EGFL7 оценивали с помощью Вестерн-блот и в реальном времени RT-PCR. Для того, чтобы установить с гиперэкспрессией линии и согласованный контроль, MKN28 клетки были посеяны, трансфицировали 4 мкг PEX-2-EGFL7 или PEX-2 плазмид, и выбран, как описано для BGC823 клеток за исключением того, что 500 мкг /мл G418 была использована для первоначального выбора. Полученные стабильные клеточные линии были названы MKN28-EGFL7 и MKN28-NC. Уровни экспрессии EGFL7 в G418-устойчивых клонов были оценены с помощью Вестерн-блоттинга и количественной ПЦР в реальном времени (QRT-PCR).
Вестерн-блот анализ
<р> После того, как клетки достигали 80% -95% стечение, общий белок экстрагировали с использованием буфера для экстракции клеточного лизата (Beyotime, Китай), содержащий ингибитор протеазы (1 мМ фенилметилсульфонилфторида). Лизат общая концентрация белка определяли с использованием набора для анализа белка бицинхониновой кислоты (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Равные количества белка (25 мкг) от каждой экспериментальной группы были разделены на гелевой полосу на 8% додецилсульфата натрия-электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и переносили на поливинилиденфторид (ПВДФ) мембраны (Millipore, Billerica, США). Мембраны последовательно инкубировали с блокирующим буфером, состоящую из Трис-буферном солевом растворе (TBS), содержащего 5% обезжиренного сухого молока в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 4 ° С в этом же самом буфере с одним из следующих первичных антител: анти EGFL7 (1:500; Abcam Cambridge Science, UK). анти-Е-кадгерин, анти-виментин, анти-улитка (все в 1:1000; Cell Signaling Technology, CST, США), анти-GAPDH (1:10000, Protech), анти-EGFR, анти-фосфо-EGFR, анти-AKT, анти-фосфо-AKT, анти-ЭРК, и анти-фосфо-ERK (все 1:800, ANBO Biotech Co., Ltd., США). Immunolabeled Затем мембраны инкубировали с конъюгированным с пероксидазой хрена вторичного антитела (1:2000, Immunology консультанты Лаборатория, Inc., США) в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывания TBST, белковые полосы визуализируют с помощью усовершенствованной системы обнаружения хемилюминесценции (Advansta Corporation, Менло-Парк, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями изготовителя. Выражение GAPDH был использован в качестве нагрузочного контроля и белков определяли количественно, используя UTHSCSA Image Tool 3.0. Выражение целевого белка рассчитывали как отношение интенсивности полосы белка-мишени к GAPDH.
<р> Клетки лизируют в TRIzol реагента (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) и Общую РНК получали в соответствии с инструкциями изготовителя. Первые кДНК штамма были синтезированы набор реагентов PrimeScript RT с GDNA ластика (Takara, Оцу, Япония) и амплифицируют с помощью ПЦР с использованием следующих специфических праймеров: EGFL7 смысл, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; антисмысловая, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '. КДНК GAPDH амплифицировали для контроля за количеством кДНК, присутствующего в каждом образце (смысловой, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 'антисмысловой, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'). ПЦР-амплификацию проводили при 94 ° С в течение 5 мин, затем 30 циклов при 94 ° С в течение 30 с, 57 ° С в течение 30 с и 72 ° С в течение 40 сек. Продукты ПЦР разделяли на 1,0% агарозном геле и экспрессию гена-мишени количественно как отношение интенсивности полос гена-мишени к тому из GAPDH с помощью Image Tool 3.0 (Университет штата Техас Научного центра здоровья, Сан-Антонио, штат Техас, США).
<р> реакционная смесь для ПЦР в реальном времени состоял из 10 мкл премикса Ex Taq (Probe КПЦР), 0,2 мкМ каждого EGFL7 и GAPDH праймера (ниже), 0,2 пмоль /мл TaqMan-зонды (EGFL7 или GAPDH), и 0,4 мкл ROX (tetrapropano-6-carboxyrhodamine) Ссылка Краситель II (Takara Bio, Шига, Япония). Смесь вместе с 2 мкл кДНК в каждую лунку 96-луночного мкА пластины (Applied Biosystems, CA, USA) и дистиллированную воду использовали для корректировки до конечного объема 20 мкл. Следующие праймеры были сконструированы с использованием праймера Premier 6.0 пакета программного обеспечения (Premier Биософт International, Пало-Альто, Калифорния, США): EGFL7: вперед, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; реверс, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '; GAPDH: вперед, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; реверс, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. Все реакции проводились на 7500 системе ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems, CA, США). условия термоцикла были начальная денатурация при 95,8 ° С в течение 30 с последующим 40 циклов амплификации при 95,8 ° С в течение 6 сек и 60,8 ° C в течение 30 сек.
<р> пролиферации клеток оценивали с помощью [4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5 дифенил бромида тетразолия 3- (МТТ) жизнеспособных клеток. Клетки высевали на 96-луночные планшеты в количестве 2000 /лунку и культивировали в течение 12, 24, 48, 72, и 96 ч. Затем добавляли 20 мкл МТТ (Sigma) в маточном растворе (5 мг /мл) добавляли к 200 мкл среды в каждую лунку, и планшеты инкубировали еще в течение 4 ч при 37 ° С. После тщательной аспирации культуральной среды, 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) добавляли в каждую лунку для растворения кристаллов формазана, образованных из МТТ с помощью жизнеспособных клеток. Планшеты встр хивают на поворотной платформе в течение 10 мин и измеряли поглощение при 490 нм с использованием микропланшет-ридера.
Тарелка Колонии Формирование пробирного
<р> Клетки высевали в количестве 200 /лунку в то же шести- луночные планшеты, которые используются для других анализов для оценки образования колоний клеток при прилегающего условиях. Через 10 дней клетки окрашивали 1% Гимзе, а количество видимых колоний подсчитывали. Относительный показатель образования клона рассчитывали как среднее число колоний /количество посеянных клеток × 100%.
Царапина заживлении ран Assays
В пробирке
Вторжение и миграции Анализ
<р> инвазии и миграции клеток оценивали с использованием Transwell камеры (Corning, Нью-Йорк, США). Invasion анализы проводили в Transwell камерах, разделенных поликарбонатный мембранный фильтр вставками (8 мкм поры) для 24-луночных планшетах. Каждая камера была покрыта 100 мкл 1:20 Матригель (Becton, Dickinson и Компания, Нью-Йорк, США) в холодной среде RPMI 1640 в течение ночи при 4 ° С. Впоследствии клетки (5 × 10 4 /мл × 200 мкл) были высеяны в верхней камере в среде без сыворотки. Приблизительно 800 мкл среды, кондиционированной с 10 мкг /мл фибронектина, помещали в нижнюю отсеке Transwell камеры в качестве хемоаттрактанту. После инкубации в течение 24 ч при 37 ° С, остальные опухолевые клетки на верхней поверхности камеры были удалены протиранием влажными ватными тампонами. Вторгаясь клетки на нижней поверхности фиксировали 4% параформальдегидом, окрашивали кристаллическим фиолетовым и подсчитывали под фазово-контрастным микроскопом (Olympus, Япония) при × 200. Четыре независимых эксперимента в трех повторах для всех условий обработки. В пробирке
Анализы миграции были проведены в тех же условиях, как вторжение анализов, но с непокрытыми нижними палатами и с использованием 1 × 10 5 клеток /мл (200 мкл).
Anoikis Анализ
<р> поли-гидроксиэтилметакрилат (поли-НЕМА, Sigma-Aldrich), который ингибирует клеточную адгезию к культуральных планшетах и других поверхностей роста, восстанавливали в 95% этаноле до конечной концентрации 12 мг /мл. Для приготовления пластины поли-НЕМА покрытием 2 мл этого раствора добавляли в каждую лунку 6-луночного планшета и дают высохнуть в течение ночи при ламинарном потоке капот культуры ткани. Тогда 5 × 10 4 клеток высевали в трех экземплярах в каждую лунку поли-НЕМА покрытием с регулярной культуральной среды. Через 24 ч, GC клетки собирали, промывали PBS и ресуспендировали в 500 мкл буфера для связывания из аннексина V-PE /7-ААР Апоптоз Обнаружение Комплект (eBioscience, Сан-Диего, США). Ресуспендированные клетки из каждого образца аликвоты (100 мкл) в четыре пробирки. Три пробирки были помечены либо аннексина V-PE, 7-AAD, или обоих, в то время как четвертый был использован в качестве немеченого контроля. Каждая партия затем анализировали с помощью проточной цитометрии на Beckman Coulter FC 500 счетчика (Beckman Coulter, Inc.). Процент апоптотических клеток была получена как сумма клеточных фракций, отображающих на ранней стадии апоптоза (аннексина V-положительные) и на поздней стадии апоптоза (7-AAD-положительными).
ксенотрансплантата голую мышь Модель
<р> ксенотрансплантации клеточных линий GC была проведена в соответствии с национальным Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (публикация № 86-23., переработанное 1985), был одобрен животных по уходу и использованию комитета больницы Третьего Xiangya, Центральный южный университет (по LLSC [LA] 2013-0010), и соответствовали действующему китайскому законодательству о защите животных (LLSC [LA] 2013-0010). Все усилия были предприняты, чтобы минимизировать количество мышей, используемых и их страдания.
<Р> Тридцать пять самок BALB /C голых мышей возрастом от 4 до 6 недель были приобретены у SLAC лабораторных животных Co. Ltd. (Шанхай, Китай) и размещены в индивидуально вентилируемых клетках. Мыши были случайным образом разделены на BGC823, BGC-NC, BGC2-13, MKN28, MKN28-NC, MKN28-EGFL7, а контрольной среде ФБР группы (N = 5 мышей /группа). Культивируемые клетки собирали и ресуспендировали в PBS при 1 × 10 8 клеток /0,2 мл. Суспензию вводили подкожно в левую верхней конечности каждой голой мыши для тех, кто в контрольной группе, которой вводили 0,2 мл PBS, за исключением того. Рост опухоли оценивали каждые 3 дня путем измерения диаметра опухоли штангенциркулем с нониусом. Объем опухоли (TV) вычисляли по формуле: ТВ (мм 3) = d 2 × D /2, где d и D являются кратчайшим и самые длинные диаметры, соответственно. Мышей умерщвляли через 4 недели после имплантации клеток, а опухоли были извлечены и взвешены. Все печенки были исследованы на метастаз гематоксилином и эозином (H &Amp; E) окрашивание. Опухоли фиксировали в 10% формалине, заливали в парафин, и нарезать мкм срезы толщиной 4. EGFL7 выражение было определено с помощью иммуногистохимии, как описано выше.
Статистический анализ
<р> Все статистические анализы были проведены с использованием SPSS версии 16.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США) для Windows. Данные выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD) от по меньшей мере, трех независимых экспериментов. Группа средства сравнивали с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA) с Стьюдента-Ньюмена-Кеулса (SNK) или наименее значимой разницы испытаний (LSD) для постфактум парного сравнения. Коэффициент корреляции Спирмена ранг был использован для определения корреляции между EGFL7 и ЕМТ, связанных с уровнями экспрессии белка в хирургическим путем желудка раковых тканей. A P
&л; 0,05 считалось статистически значимым
Результаты
<р> Вестерн-блот и RT-. ПЦР проводили для сравнения EGFL7 выражение в GC клеточных линий человеческих SGC7901, BGC823, MKN45 и MKN28 к тому, что в нормальной слизистой желудка эпителиальных ГЭС-1 клеток. Повышенные уровни EGFL7 были обнаружены во всех линиях четыре GC клеток по сравнению с ГЭС-1, с BGC823 и MKN28 отображения наибольшее и наименьшее экспрессию EGFL7, соответственно, как в белке и уровни мРНК (фигуры 1А и 1В). Поэтому BGC823 и MKN28 были использованы в последующих экспериментах для оценки влияния экспрессии EGFL7 на пролиферацию, миграцию и метастатического потенциала. Мы использовали стабильные shRNA трансфекцию для подавления экспрессии EGFL7 в BGC823 клетках и разработал EGFL7 человека высокой экспрессии плазмиды (PEX-2-EGFL7) для увеличения экспрессии EGFL7 в клетках MKN28.
&л; 0,05). Там не было никаких существенных различий в мРНК и экспрессию белка между КУП-NC и BGC клеток или между MKN28-NC и MKN28 клеток (все P
> 0,05).
EGFL7 продвигаемых GC Cell Invasion и миграции, но не влияет на GC пролиферации клеток
100% и 98%, и P
≪ 0,05) (фиг.2А). В отличие от этого, закрытие была значительно быстрее в MKN28-EGFL7 культур (гиперэкспрессией EGFL7) по сравнению с MKN28 и MKN28-NC культур (99% против.
49% и 50%, и P
≪ 0,05) (Фигура 2В). Кроме того, рана ближе на некоторое время после нуля (48 ч) было больше в высокой EGFL7 экспрессирующие дикого типа BGC823 клеток по сравнению с клетками MKN28 низкой экспрессии дикого типа, указывая, что эндогенные уровни экспрессии также влияют на миграцию.
<Р> Transwell анализы были выполнены, чтобы подтвердить эти результаты и в дальнейшем исследовать влияние EGFL7 на инвазивный потенциал BGC823 клеток, MKN28 клеток и соответствующих устойчивых выражений линий в Матригель. Там были значительно меньше EGFL7-underexpressing (BGC2-13) клетки в Матригель по сравнению с BGC-NC и BGC823 клеток (25 ± 3,1 VS
76 ± 2,9 и 79 ± 5,7 клеток /лунку;. И P
≪ 0,05), что свидетельствует о том, что EGFL7 underexpression значительное снижение инвазивный потенциал (фиг.2с). Точно так же, количество BGC2-13 клеток ниже нижнего матригелем свободной скважины в Transwell миграции анализах была значительно снижена по сравнению с BGC823 и КУП-NC клеток (19 ± 1,1 <ЕМ> VS.
53 ± 2,9 и 54 ± 2,6 , и P
&л; 0,05) (рис 2С). В противоположность этому, EGFL7 избыточная экспрессия в MKN28 клетках значительно повышена как вторжение в Матригель (MKN28-EGFL7: 79 ± 6,19 клеток /лунку, MKN28-NC: 40 ± 2,00 клеток /лунку, MKN28: 41 ± 4,22, оба P <бр> &л; 0,05; Рисунок 2D) и миграции (MKN28-EGFL7: 67 ± 4.16, MKN28-NC: 33 ± 5,92, MKN28: 35 ± 3,7; и P
&л; 0,05; Рисунок 2D).
Функция печени может иметь важное значение для риска болезни Альцгеймера.
Мало доказательств наличия тромбоцитопении, связанной с мРНК COVID-19,
Бактериальные изменения кишечника влияют на результаты лечения волчанки во время беременности
Некоторые виды бактерий могут увеличить риск заражения ВИЧ у женщин,
Люди с симптомами СРК могут иметь низкий уровень витамина D,
Кофе способствует развитию здоровых кишечных микробов и способствует опорожнению кишечника.
Гигиена полости рта и тяжесть COVID-19 - связь
Британские исследователи обнаружили связь между плохой гигиеной полости рта и серьезностью заболевания COVID-19, вызванного тяжелым острым респираторным синдромом, вызванным коронавирусом 2 (SARS-CoV-
Добавление короткоцепочечных жирных кислот улучшает восстановление после инсульта,
исследование мышей показывает Добавление в организм короткоцепочечных жирных кислот может улучшить восстановление после инсульта, согласно исследованиям на мышах, недавно опубликованным в JNeurosci. Д
Люди с симптомами СРК могут иметь низкий уровень витамина D,
исследование показывает Если вы один из двух из десяти человек, страдающих такими симптомами синдрома раздраженного кишечника (СРК), как вздутие живота, спазмы желудка и запор, весьма вероятно, что у