Plos ONE: epidermalna Growth Factor-Like domene, ki vsebujejo beljakovine 7 (EGFL7) Izboljša ESPG receptor-AKT signalizacijo, epitelijskih-mezenhimskih Prehod in metastaze želodčnega raka Cells

Povzetek

epidermalni rastni dejavnik podobno domeno vsebujoč protein 7 (EGFL7) je povečana pri epitelijskih tumorjev ljudi, zato je potencial biomarker za malignosti. Dejansko so prejšnje študije pokazale, da je visoka EGFL7 izraz spodbuja infiltracijo in metastaze raka želodca. Prehod epitelnih-mezenhimskih (EMT) sproži metastatskega kaskado in endows rakavih celic z invazivno in migracijskega zmogljivosti; Vendar pa ni znano, ali EGFL7 spodbuja metastaze, ki ga sproži EMT. Ugotovili smo, da je bil EGFL7 prekomerno v več raka človeškega želodca (GC) celičnih linij in da prekomerno spodbuja celično invazijo in migracije, ki ga nič rane in transwell migracijskih testih pokazala. Nasprotno, shRNA posredovano EGFL7 rasklapanje zmanjšano invazijo in migracije. Poleg tega EGFL7-prekomerno ekspresijo celice zrasel v večje tumorje in so bolj verjetno, da metastaze v jetrih, v primerjavi z underexpressing CG celice po podkožni injekciji pri miših. EGFL7 overexpression zaščiten linij GC celic pred anoikis, ki zagotavlja verodostojno mehanizem za to okrepljeno metastatskega zmogljivosti. V izrezali želodčnih tumorjev pri ljudeh je izraz EGFL7 pozitivni korelaciji z ravnmi izražanja mezenhimskih marker vimentina in-EMT povezana prepisovanja represor Polž in negativni korelaciji z ekspresijo epitelnega celična označevalca E-kadherina. V celičnih linijah GC, EGFL7 rasklapanje obrnil morfološke znake EMT in zmanjšala tako vimentina in Polž izraz. Poleg tega EGFL7 čezmernim spodbujati receptor ESPG (EGFR) in protein kinaze B (AKT) fosfo aktivacije, posledice izrazito potlačene, ki jih EGFR tirozin-kinaze AG1478. Poleg tega, AG1478 zmanjšala tudi povišan invazivne in migracijski zmogljivosti GC celičnih linij s prekomerno ekspresijo EGFL7. Kolektivno, ti rezultati nakazujejo, da EGFL7 spodbuja metastaze z aktiviranjem EMT preko signalne poti EGFR-AKT-Polž. Motnje EGFL7-EGFR-AKT-Polž signalizacijo lahko obetaven terapevtska strategija za raka želodca

Navedba. Luo B-H, Xiong F, Wang J-P, Li J-H, Zhong M Liu Q-L, et al. (2014) epidermalnega rastnega faktorja-Like domene, ki vsebujejo beljakovine 7 (EGFL7) Izboljša ESPG Receptor-AKT signalizacijo, epitelijskih-mezenhimskih Prehod in metastaze želodca rakavih celic. PLoS ONE 9 (6): e99922. doi: 10,1371 /journal.pone.0099922

Urednik: Claudia D. Andl, Vanderbilt University, Združene države Amerike

Prejeto: 15. november 2013; Sprejeto: 19. maj 2014; Objavljeno: 19. junij 2014

Copyright: © 2014 Luo et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je bila podprta z National Natural Science Foundation Kitajske (št 81001080) in Open-End sklada za dragocene in precizni instrumenti Srednje Južne University (št JJ3121). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je četrti najpogostejši maligni tumor, in drugi najpogostejši vzrok smrti, povezanih z rakom na svetu [1], [2]. Približno polovica vseh primerov GC pojavljajo v vzhodnoazijskih državah z zelo visokimi primerov v Japonska, Koreja in Kitajska [3], [4]. Napredek pri sistemskem zdravljenju GC je močno povečala kratkoročno preživetje; Vendar pa je petletno preživetje bolnikov GC ostaja nizka zaradi recidiva in metastaz [5]. Poleg tega je večina na novo diagnosticiranih bolnikov GC že kažejo metastatsko bolezen, ki predstavlja velik terapevtski izziv za onkologe [6].

epidermalni rastni dejavnik, kot vsebujejo domene protein 7 (EGFL7), znan tudi kot žilnega endotelija statina je endotelijska celice pridobljene izločajo faktor, ki regulira vaskularni tvorbo cevi. Parker et al. [7] je pokazala, da je EGFL7 ključnega pomena za angiogenezo med embriogeneze zebra rib [8]. Nedavne študije so poročali o povišani ekspresije EGFL7 v več tumorjev in raka celičnih linij, vključno ledvičnih tumorjev, malignih gliomov, hepatocelularnega karcinoma in debelega raka [7] - [10]. Smo že dokazali, da se EGFL7 prekomerno tudi želodčnega raka [11], in izražanje je bistveno povezana z patoloških lastnosti, klinično napredovanje, slabo prognozo in metastaz [10], [12]. Zato EGFL7 je kandidat napovedni dejavnik za napredovanje raka in metastaz. Vendar pa mehanizmi, na katerih temeljijo tumorogene učinke EGFL7 so nejasne.

Metastasis je večstopenjski postopek, ki vključuje prehod epitelne-mezenhimskih (EMT), v katerem polarizirano epitelne celice se pretvorijo v mezenhimskih celic [13], fenotip z večjo invazivno in migracijskega sposobnosti [14]. EMT je tudi reverzibilen proces, ki se pogosto pojavi pri invazivni pred številnimi metastaznih rakov [15]. Številne študije so pokazale, da ESPG podpira migracijo rakavih celic in invazijo sočasno z aktivacijo EMT [16] - [18]. Pomembno je, da EGFL7 vsebuje dve ESPG podobnih domen, kar kaže na neko funkcionalno homologijo [9], [12]. Vendar, ali EGFL7 resnici počne izboljšanje EMT in spodbujajo raka želodca metastaze je treba še določiti. Poleg tega so molekularni mehanizmi, s katerimi se EMT je urejena v GC ostajajo večinoma neznani. Cinkov prst transkripcijski represivni polž je ključnega pomena za izražanje genov reprogramiranje med EMT, zlasti pri zatiranju celične adhezije celic beljakovin endotelijskih (E) -cadherin je, da bi se izguba, ki velja za pomemben zgodnji dogodek v EMT in potrebna za nadaljnjo metastaz [ ,,,0],19].

Ta študija je namenjena, da ugotovi, če EGFL7 spodbuja metastaze, ki ga sproži EMT. Ugotovili smo, da EGFL7 prekomerno aktivira EGFR-AKT pot, sproži EMT in spodbuja GC celično invazijo in vitro
in metastaze in vivo
.

Materiali in metode

Bolniki in odvzem tkiva

želodcu karcinom tkiva so bili pridobljeni od 79 bolnikov GC (58 moških in 21 ženskega spola), zdravljenih s kirurško resekcijo na oddelku za kirurgijo, Bolnišnica XiangYa, Central South University (Kitajska). Operacije so bile izvedene od januarja 2010 do december 2012. Bolniki so bili stari 54,7 let, v povprečju (razpon: od 28 do 82 let). In prejel niti kemoterapijo ali obsevanjem, zdravljenje pred operacijo

Bolniki so bili obveščeni, da kirurški osebki bi se uporablja za konvencionalno patološko diagnozo in preostale tkiva se lahko uporabijo za raziskave. Ne osebni podatki pacienta je bila potrebna za to študijo in protokoli izvajajo nobenega tveganja, zato je bil potreben le verbalno privolitev od bolnikov. Protokol je odobril Odbor za etiko bolnišnice XiangYa, Central South University (dovoljenje številka: 201311389).

Bolezen uprizoritev je bila opredeljena v skladu s šesto izdajo sistema TNM počivališču Skupnega odbora ameriškega raka [ ,,,0],20], [21]. Tumorji so tudi različno želodčne adenokarcinom v 12 primerih, zmerno diferenciran v 34 primerih, in slabo diferencirani v 33 primerih. Vsi vzorci so bili takoj za določen s 10% formalinom, dehidrirani, in-parafin vgrajeni. Natančno klinične informacije in patološka diagnoza bili na voljo za vse bolnike.

Imunohistokemija

Za imunohistokemijo, smo pripravili vzorce inkubirali pri 60 ° C za 15 ur in narežemo na 4 m debele odsekov, deparaffinized v terpentin, posušimo in rehidrirane v padajoči etanola: destilirano vodo preliva. Endogene peroksidaze aktivnost inaktivirana z inkubacijo 30 minut pri 0,3% vodikovega peroksida v 0,01 M fosfatnim pufrom (PBS). Rezine smo nato inkubirali 15-20 minut pri citratnega pufra (pH 6,0) pri 95 ° C za pridobivanje antigenov, blokirana s 5% normalnem kozje seruma v 0,01 M PBS 15 minut pri 37 ° C in inkubirali s primarnimi protitelesi razredčenimi v blokiranje raztopine preko noči pri 4 ° C v navlaženi komori. Uporabljene so bile naslednje osnovne protitelesa: mouse anti-EGFL7 monoklonsko protitelo (Abcam, ZDA, 1:400) in zajec monoklonskih protiteles, naperjeni zoper E-kadherina (CST, ZDA, 1:1000), vimentina (CST, ZDA, 1:1000 ), polž (Proteintech, ZDA, 1:1000) in CD34 (Boster, Kitajska, 1:500). Po pranju so bili vzorci zaporedoma inkubirali z biotiniliranega sekundarna protitelesa in streptavidin-hrenovo peroksidazo (HRP) obdelovalne raztopine avidinom. Immunolabeling smo vizualizirali s kompletom za DAB substrata iz Zhongshan Golden Bridge Company (Kitajska), v skladu s priporočili proizvajalca. Na koncu so bili odseki jih nasprotno s hematoksilinom (Vector Laboratories, ZDA), dehidrirano v naraščajočem etanolu: destilirana voda gradient in montiran na diapozitive z uporabo Permount montažno medijev (Fisher Scientific, ZDA)

Količinska imunohistokemicne signalov.

Vse GC in okoliških non-neoplastične želodca tkiva so histopathologically potrdili z dvema neodvisnima patologov (K.-SW in J.-HL) slepih na prvotno diagnozo. Imunskim barvanjem smo ocenili z metodo semi-kvantitativno, ki velja tako intenzivnost in distribucijo obarvanja [22]. Na kratko, je bilo pet polj naključno izbrani v skladu z nizko povečavo (100 ×, Olympus BX51, Tokio, Japonska) in 200 tumorske celice preštetih iz vsakega področja. Intenzivnost obarvanja je dosegel takole: 0, ne pušča madežev; 1, šibko rumeno obarvanje; 2, rumeno obarvanje; 3, rjavi madeži. Pozitivne celice so značilni jasno mejo in rumeno ali rjavo obarvanje razlikuje od ozadja. Odstotek pozitivnih celic (PP) je dosegel takole: 0, 0%; 1, 1% -25%; 2, 26% -50%; 3, 51% -75%; 4, 76% -100%. Dva rezultati združimo, da dobimo naslednjo razvrstitev: negativno obarvanje, vzorci z imunoreaktivnih točk (IRS) od 0 do 2; šibko pozitiven obarvanje, vzorci z IRS od 3 do 5; močno pozitivno obarvanje, vzorci z IRS od 6 do 7. Vzorci, ki so pokazali šibko in močno pozitivno barvanje so bili vključeni v statistično analizo.

Mobilni Lines in kultura

celične linije Human GC SGC7901 (zmerno diferencirano adenokarcinomom), BGC823 (slabo diferenciran adenokarcinom), MKN28 (dobro diferencirani-adenokarcinom), in MKN45 (slabo diferenciran adenokarcinom), kot tudi običajni želodčne sluznice epitelijskih GES-1 celice so bile kupljene od Type Culture Collection kitajske akademije znanosti (Shanghai, Kitajska). Vse celice smo gojili in vzdržuje v Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediju (Gibco Biocult, Paisley, UK), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (FBS) (Gibco Biotechnology), 100 U /ml penicilina in 100 ug /ml streptomicina pri 37 ° C v navlaženi atmosferi, ki vsebuje 5% CO _2.

Kratka lasnice RNA (shRNA) in rekombinantno izražanje Plazmid Pex-2-EGFL7

Za izdelavo celičnih linij prekomerno izražajo ali underexpressing EGFL7 so bile celične linije naravni stabilno transfektirali z ekspresijskim vektorjem ali ciljno shRNA. V shRNA zaporedja človeškega EGFL7 so bili zasnovani po zaporedju človeško EGFL7 DNK (GenBank NO NM_016215.3.), Ki ga Designer 3,0 programske opreme (Genepharma, http://www.genepharma.com) in udarnimi iskanja (http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Ciljne sekvence smo primerjali z genoma podatkovni človekovo iskanje BLAST, da se prepreči visoko homologna za druge kodiranje zaporedij. Sekvence EGFL7-homo-333 in EGFL7-homo-887 so bile opredeljene kot ciljna mesta za določen EGFL7 shRNA. Poleg tega je bila ena nespecifične sekvenco (pehanje shRNA), zasnovan kot negativno kontrolo, in sekvenca GAPDH je zasnovan kot notranje kontrole. Se shRNA sekvence so bile:

EGFL7-shRNA1 proti EGFL7-homo-333: smislu, 5'-CACCGGTGCTGCTGATGTGGCTTTCAAGAGAAGCCACATCAGCAGCACCTTTTTTG-3 '; antisense, 5'-GATCCAAAAAAGGTGCTGCTGATGTGGCTTCTCTTGAAAGCCACATCAGCAGCACC-3 '; EGFL7-shRNA2 proti EGFL7-homo-887: občutek, 5'-CACCGAGTGGACAGTGCAATGAATTCAAGAGATTCATTGCACTGTCCACTCTTTTTTG-3 '; antisense, 5'-GATCCAAAAAAGAGTGGACAGTGCAATGAATCTCTTGAATTCATTGCACTGTCCACTC-3 '; nespecifične občutek, 5'-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3 '; antisense, 5'-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3 '; GAPDH občutek, 5'-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3 '; antisense, 5'-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3 '. PGPU6 /GFP /Neo (zeleni fluorescentni protein, neomicin) vektor (Genepharma Company, Šanghaj, Kitajska), je bila uporabljena za gradnjo plazmida. Nukleotidi so razbeljenem in vstavljena v mestih BamHI in Hindlll in preoblikovala v DH5a pristojni, E. coli. Dvojna kanamicin- /neomicin odporna kolonije so bili izbrani in vektorske sekvence potrjuje omejitev prebavo in DNA sekvenciranje.

cDNA EGFL7 kodira zaporedje kisline 533-1353 amino subkloniramo v PEX-2 plazmida vektorja (Genepharma, Šanghaj, Kitajska), ki ga BglII /EcoRI dvojno prebavo in imenuje PEX-2-EGFL7. Rekombinantni plazmid smo pomnožili v DH5a-pristojnemu E. coli in vektorsko sekvenco s PCR ojačeno. DNA sekvenciranje je potrdila, da je rekombinantni plazmid vseboval EGFL7 genski fragment identičen tistemu v GenBank (GenBank ŠT. NM_016215.3). Kanamicin- /neomicin odporna kolonije so bili izbrani in zaporedje potrjuje omejitev prebavo in DNA sekvenciranje. Vse primerji so bili oblikovani in sintetizirali Genepharma (Shanghai, Kitajska).

Stabilno Transfekcija in G418 Izbor

Za vzpostavitev EGFL7-underexpressing klon (in ustrezen nadzor), BGC823 celice smo posejali v šestih No kultura plošče na 1 x 10 ^{6 /vdolbino in inkubiramo 24 ur v RPMI 1640 mediju, ki vsebuje 10% FBS v navlaženi 5% CO _{2 atmosfera vzdržujemo pri 37 ° C. Celice so transfekciji s 4 mikrogramov pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1, pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA2, pGPU6 /GFP /Neo-nespecifične-shRNA ali pGPU6 /GFP /Neo-GAPDH-shRNA uporabo Lipofectamine 2000 transfekciji reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) po navodilih proizvajalca. Po 24 urah smo celice inkubirali v G418 (Sigma, ZDA, 600 mg /ml) za prvo izbiro, razredčena, prevlečeni na nizke gostote (~1 celic /vdolbinico) in vzdrževana v gojišče z dodatkom G418 na polovico začetne koncentracije v izbirnem dodatnih 3 tedne. Nastale stabilne celične linije so poimenovali BGC2-13 (celične linije, ki izhaja iz pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 stabilen transfekciji) in BGC-NC, in razširili za nadaljnje študije. Stopnja izraz EGFL7 je ocenil Western blot in v realnem času RT-PCR. Za vzpostavitev prekomerno ekspresijo linijo in se ujema nadzor, so MKN28 celice semeni, transfekciji s 4 ig PEX-2-EGFL7 ali PEX 2-plazmidov, in izbrali kot je opisano za BGC823 celic, razen tega, da 500 mg /ml G418 je bil uporabljen za prvo izbiro. Nastale stabilne celične linije so poimenovali MKN28-EGFL7 in MKN28-NC. Ravni izraz za EGFL7 v G418-odpornih klonov so bili ocenjeni z Western blot in kvantitativno PCR v realnem času (QRT-PCR).}}

Western Blot Analiza

Po celic doseže 80% -95% sotočje, je skupno beljakovina, pridobljena s pomočjo ekstrakcije celični lizat buffer (Beyotime, Kitajska), ki vsebuje zaviralca proteaz (1 mM fenilmetilsulfonil fluorida). Lizat skupna koncentracija beljakovin je bila določena z uporabo bicinchoninic kislina beljakovine analiznega kompleta (Pierce biotehnologija, Rockford, IL, ZDA). Enaka količina beljakovin (25 ug) iz vsake skupine zdravljenja na gelsko pasu ločimo z 8% natrijevim dodecil sulfat-poliakrilamidnem gelu z elektroforezo (SDS-PAGE) in prenesemo na poliviniliden difluorida (PVDF) membrane (Millipore, Billerica, ZDA). Membrane so bile zaporedno inkubirali z blažilnik, ki sestoji iz tris-pufrom (TBS), ki vsebuje 5% nemastno mleko v prahu 2 uri pri sobni temperaturi in nato preko noči pri 4 ° C v istem pufru z enim od naslednjih primarnih protiteles za blokiranje: anti EGFL7 (1:500; Abcam Cambridge Science, UK). anti-E-kadherina, anti-vimentin, anti-Polž (vse na 1:1000, celična signalizacija tehnologijo, CST, ZDA), anti-GAPDH (1:10000, Protech), anti-EGFR, anti-fosfo-EGFR, anti-AKT, anti-fosfo-AKT, anti-ERK, in anti-fosfo-ERK (vse 1:800, Anbo Biotech Co., Ltd, USA). Immunolabeled Membrane smo nato inkubirali s HRP-konjugiranega sekundarnega protitelesa (1:2000, Imunologija svetovanje Laboratory, Inc., ZDA) 2 uri pri sobni temperaturi. Po spiranju s TBST so beljakovinski trakovi vizualizirali s pomočjo okrepljenega sistem za zaznavanje kemiluminescenca (Advansta Corporation, Menlo Park, California, ZDA) po navodilih proizvajalca. Izražanje GAPDH smo uporabili kot kontrolo nakladanje in beljakovin količinsko uporabo UTHSCSA Image Tool 3.0. Izraz tarčni protein je bil izračunan kot razmerje intenzitete pasu ciljnega proteina v GAPDH.

RNK Pridobivanje in PCR analizo

Celice smo lizirali v TRIzola reagenta (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) in skupno RNK smo pripravili v skladu z navodili proizvajalca. Prvi deformacijske cDNA smo sintetizirali ki ga PrimeScript RT reagenta Kit s gDNA Eraser (Takara, Otsu, Japonska), in pomnožili s PCR z uporabo naslednjih specifičnih primerjev: EGFL7 smisel, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; antisense, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '. CDNA iz GAPDH smo pomnožili nadzor v znesku cDNA prisotne v vsakem vzorcu (smislu, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ', protismiselno, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'). PCR pomnoževanje smo izvedli pri 94 ° C za 5 minut, čemur sledi 30 ciklov 94 ° C za 30 sekund, 57 ° C za 30 sekund in 72 ° C za 40 sekund. produktov PCR smo ločili na 1,0% agaroznem gelu in ciljno genske ekspresije količinsko kot razmerje intenzivnosti pasu ciljnega gena s tistim GAPDH uporabo Image Tool 3.0 (University of Texas Health Science Center, San Antonio, Texas, ZDA).

Real-time PCR

reakcijska mešanica za PCR v realnem času je obsegal 10 ul za premiks Ex Taq (Probe qPCR), 0,2 Ilm vsakega EGFL7 in GAPDH primerjem (spodaj), 0,2 pmol /ml TaqMan sonde (EGFL7 ali GAPDH), in 0,4 ul ROX (tetrapropano-6-carboxyrhodamine) Referenčna Dye II (Takara Bio, Shiga, Japonska). Zmes smo združili z 2 cDNA ul v vsako vdolbino 96 jamicami MicroAmp plošče (Applied Biosystems, CA, ZDA) in destilirano vodo je bila uporabljena za prilagoditev na končnem volumnu 20 ul. Naslednji primerji so namenjeni uporabi 6.0 programski paket Primer Premier (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, ZDA): EGFL7: naprej, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; obratno, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '; GAPDH: naprej, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; obratno, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. Vse reakcije so bile izvedene na 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, ZDA). Thermocycle pogoji so bili začetna denaturacija pri 95,8 ° C 30 sekund, čemur sledi 40 ciklov pomnoževanja pri 95,8 ° C 6 sekund in 60,8 ° C za 30 sekund.

smo uporabili Podobne eksperimentalni pogoji za oceno izražanja drugih geni z naslednjimi primerji: E-kadherina: naprej, 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3 '; obratno, 5'-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; vimentin: naprej, 5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3 '; obratno, 5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3 '; Polž: naprej, 5'-TGCTCCACAAGCACCAAGA-3 '; obratno, 5'-GCAGAGGACACAGAACCAGAAA-3 '; GAPDH: naprej, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; obratno, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. Reakcijsko zmes za PCR v realnem času sestavljalo 10 ul s SYBR premiks Ex TaqTM II, 1,6 ul vsakega primerjem (0,4 uM), 0,4 xl ROX referenčnega Dye, 2 xl cDNA šablonske in 6 xl dietil pirokarbonatom obdelan voda. PCR v realnem času smo izvedli na 7500 realnem času PCR System (Applied Biosystems, CA, ZDA) z naslednjimi pogoji thermocycle: začetna denaturacija pri 95 ° C za 10 sekund, čemur sledi 40 ciklov pomnoževanja pri 95 ° C za 5 y in 60 ° C za 34 sekund.

Cell Proliferation Vsebnost

proliferacije celic smo ocenili s 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5 difenil tetracolij bromid (MTT) izvedljiva celica testu. Celice smo nanesli na plošče s 96 vdolbinami pri 2000 /dobro in kultivirani 12, 24, 48, 72 in 96 ur. Nato je bil 20 ul raztopine MTT (Sigma) na zalogi (5 mg /ml) dodamo 200 ul iz medija v vsako vdolbino in ploščice inkubiramo dodatne 4 ure pri 37 ° C. Po temeljitem aspiracije gojišča je 150 ul dimetilsulfoksid (DMSO) dodamo v vsako vdolbino, da se raztopi formazana kristalov, ki nastanejo z MTT z živimi celicami. Plošče smo stresali na rotacijskem platformo za 10 minut in absorbanco merjeno pri 490 nm z uporabo mikroploščnem čitalniku.

Plošča kolonija Formation Vsebnost

Celice smo zasejali v 200 /jamico v isti šest- tudi plošče, kot se uporabljajo za druge teste za oceno tvorbe kolonije pod pogoji celičnih-sprijeta. Po 10 dneh smo celice obarvali z 1% Giemsa, je prešteti število vidnih kolonij. Indeks oblikovanje klon relativna je bila izračunana kot povprečno število kolonij /število cepimo celic x 100%.

Scratch celjenje ran testih

testom migracije celic, 5 x 10 ^{5 celice /jamico smo nanesli na šestimi vdolbinicami prevlečenih s 10 ug /ml fibronektin (FN) in inkubirali 24 ur. Enoslojne plasti smo nato prekinjen z enim nič pomočjo 200 ul vrh pipete. Posnetki so bili pridobljeni na 0, 12, 24, 36, 48 in 72 h po praske s fazno kontrastnim mikroskopom (Olympus BX51, Japonska). Število celic v opraskan (puste) regije microwell bilo preštetih v petih poljih (Povečava: x 200). Vse poskuse smo izvajali v dveh izvodih.}

In vitro
Invasion in migracije Vsebnost

Cell invazija in migracije so ovrednotili s transwell komore (Corning, New York, ZDA). Invasion analize so bile izvedene v transwell komorah jih ločuje filtrskih vložkov polikarbonatno membrano (8 um pore) za 24-vdolbinami. Vsaka komora je obložena z 100 ul od 1:20 Matrigel (Becton, Dickinson and Company, New York, ZDA) v hladni RPMI 1640 preko noči pri 4 ° C. Nato celice (5 x 10 ^{4 /ml x 200 ul) smo posejali v zgornji komori v mediju brez seruma. Približno 800 xl medija pogojene s 10 ug /ml fibronektina damo v spodnjem predelu transwell komore kot chemoattractant. Po inkubaciji 24 ur pri 37 ° C, so preostale tumorske celice na zgornji površini komore odstranimo z brisanjem z mokrimi bombažnih blazinic. Vdrla celice na spodnji površini so bile določene s 4% paraformaldehida, obarvali s kristal vijoličnim in prešteli pod fazno kontrastnim mikroskopom (Olympus, Japonska), pri × 200. Štiri neodvisne poskuse smo izvedli v treh izvodih pri vseh pogojih obdelave. In vitro
migracijske analize so bile izvedene pod enakimi pogoji, kot invazijo testov, vendar z neprevlečenih nižje zbornice in uporabo 1 x 10 5 celic /ml (200 ul).}

Anoikis test

Poly-hidroksietil metakrilat (poli-HEMA, Sigma-Aldrich), ki inhibira adhezijo celic na kulturo plošč in drugih površinah rasti, je bil ponovno v 95% etanolu do končne koncentracije 12 mg /ml. Pripraviti poli-HEMA-prevlečene plošče, 2 ml te raztopine dodamo k vsako vdolbino 6 vdolbinicami in pustimo, da se posuši preko noči pod laminarnim tokom tkivne kulture pokrovom a. Nato so 5 x 10 ^{4 celice prevlečeni v treh izvodih v vsaki poli-HEMA obložena tudi z rednim gojišč. Po 24 urah smo zbrali GC celice, speremo s PBS in ponovno suspendirali v 500 ul vezavnem pufru iz aneksin V-PE /7-AAD apoptoza Detection Kit (eBioscience, San Diego, ZDA). Resuspendiranih celic iz vsakega vzorca smo alikvote (100 ml) v štiri cevi. Tri cevi so bile označene bodisi z aneksinom V-PE, 7-AAD ali oboje, medtem ko je četrta uporablja kot neoznačeni kontrolo. Vsaka serija se je nato analizirajo s citometrije pretoka na Beckman Coulter FC 500 števcem (Beckman Coulter, Inc.). Odstotek apoptotskih celic je bila izpeljana kot vsota celičnih frakcij, ki kažejo zgodnje apoptozo (aneksin V pozitivni) in pozno apoptozo (7-AAD pozitivni).}

ksenograftov Akt Mišji model

Xenografting celičnih linij GC je bila izvedena v skladu z nacionalnimi smernicami za nego in uporabo laboratorijskih živali (objava št. 86-23, revidiran 1985), je bil odobren odbor za živali oskrbe in uporabe bolnišnice tretjega XiangYa, Central South University ( LLSC [LA] 2013-0010), in skladna s trenutnim kitajskega zakona o zaščiti živali (LLSC [LA] 2013-0010). si je prizadevala, da se zmanjša število miši, ki se uporabljajo in njihovo trpljenje.

Petintrideset ženski Balb /c golih miši starosti so bili kupljeni od SLAC laboratorijske živali Co Ltd 4 do 6 tednov (Shanghai, Kitajska) in nameščene v individualno prezračevanjem kletke. Miši so bile naključno razdeljene v BGC823, BGC-NC, BGC2-13, MKN28, MKN28-NC, MKN28-EGFL7 in nadzor PBS skupine (n = 5 miši /skupina). Kultivirane celice požanjemo in resuspendiramo v PBS pri 1 x 10 ^{8 celic /0.2 ml. Suspenzijo smo injicirali subkutano v levi zgornji skrajni vsakega golih miši, razen tistih v kontrolni skupini, ki smo injicirali 0,2 ml PBS. Rast tumorja je bila ocenjena vsakih 3 dni z merjenjem premera tumorjev z Vernier čeljusti. volumen tumorja (TV) je bila izračunana po formuli: TV (mm 3) = D 2 × D /2, kjer je d in so D najkrajši in najdaljši premer oz. Miši smo usmrtili pri 4 tedne po celic implantaciji, in tumorji so bili pridobljeni in stehtali. Vse jetra so bili pregledani za metastaze, ki ga hematoksilinom in eozinom (H & E) barvanjem. Tumorji so bile določene v 10% formalinu, vgrajeni v parafin, in narežemo na 4 mikrometrov debelih odsekov. EGFL7 izraz smo določili z imunohistokemijo, kot je opisano zgoraj.}

Statistične analize

Vse statistične analize smo izvedli s pomočjo SPSS različice 16,0 (SPSS Inc., Chicago, IL, ZDA) za operacijski sistem Windows. Podatki so izraženi kot srednja vrednost ± standardni odklon (SD) iz najmanj treh neodvisnih poskusih. Skupina sredstva so se v primerjavi s enosmerno analizo variance (ANOVA), s Student-Newman-Keuls (SNK) ali najmanj pomembna razlika (LSD), teste za poštne hoc par-pametno primerjave. Spearman Rank koeficient korelacije smo uporabili za določitev korelacije med EGFL7 in povezanih EMT koncentracije proteina izražanja v kirurško izrežejo želodčnega tkiva raka. A P
< 0.05 smo imeli statistično značilno

Rezultati

EGFL7 Izražanje je povišano Human želodca rakave celične linije

Western blot in RT. PCR smo izvedli primerjavo EGFL7 izraz v GC humanih celičnih linijah SGC7901, BGC823, MKN45 in MKN28 do, da v normalnih želodčni sluznici epitelijskih GES-1 celic. Ravni povišana EGFL7 so našli v vseh celičnih linijah s štirimi GC primerjavi z GES-1, s BGC823 in MKN28 prikazuje najvišjo in najnižjo EGFL7 izraz, oziroma, tako na beljakovine in ravni mRNA (slikah 1A in 1B). Zato so bili BGC823 in MKN28 uporabljati v naslednjih poskusih za oceno učinkov EGFL7 izražanja na proliferacijo, migracijo in metastatskega potenciala. Uporabili smo stabilno shRNA transfekciji zatreti EGFL7 izraza v BGC823 celicah in oblikoval človek EGFL7 visoki izrazni plazmid (PEX-2-EGFL7) za povečanje EGFL7 izražanja v MKN28 celicah.

Zgradili smo dva shRNA plazmidne vektorje ciljanje EGFL7 mRNA in izvedli QRT-PCR za oceno učinkovitosti teh kandidatk shRNA zaporedij, da zavirajo EGFL7 primerjavi z nespecifične sekvenc. V shRNA1 in shRNA2 sekvence doseže 75% in 30% inhibicijo EGFL7, oziroma (slika 1C), tako da je bolj učinkovito shRNA1 je bila uporabljena za vse nadaljnje poskuse. V BGC823 linije stabilno transfektirane s pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 ali pGPU6 /GFP /Neo-nespecifične-shRNA bila določena BGC2-13 in BGC-NC, oz. V MKN28 linije stabilno transfekciji s PEX-2-EGFL7 in PEX-2-nespecifične bila določena MKN28-EGFL7 in MKN28-NC, oz. Je ekspresijski nivoji EGFL7 beljakovin in mRNA v G418-odporne klone smo ocenili tudi z Western blot (Slika 1D) in v realnem času RT-PCR (slika 1E). Rezultati so pokazali močno zmanjšala EGFL7 ekspresijo v celicah BGC2-13 primerjavi z BGC-NC celic in znatno povišano izražanje v MKN28-EGFL7 celic v primerjavi z MKN28-NC celic (all P
< 0,05). Ni bilo pomembnih razlik v mRNA in izražanje beljakovin med BGC-NC in BGC celic ali med MKN28-NC in MKN28 celic (vse P
> 0,05).

EGFL7 predstavljenih GC Cell Invasion in migracije, vendar ni vplivalo GC Cell orožja

Če želite raziskati vlogo EGFL7 pri napredovanju GC, moramo najprej preučiti, ali EGFL7 za dušenje zvoka ali prekomerno spremenil proliferativni, invazivno in migracijske zmogljivosti GC celic. Praske celjenje ran je bila uporabljena za merjenje migracije stabilno transficiranih celic. Rana je bila izdelana v GC monosloje celic z enim praske in število celic v območju praske primerjavi pri 0 in 48 ur. Zaprtje rane je bila bistveno počasnejša BGC2-13 kultur (underexpressing EGFL7) v primerjavi z naravnim BGC823 in BGC-NC kulture (32% vs.
100% in 98%, tako P
< 0,05) (slika 2A). Nasprotno pa je bilo zaprtje bistveno hitreje MKN28-EGFL7 kultur (čezmerno izraženim EGFL7) v primerjavi s MKN28 in MKN28-NC kulture (99% vs.
49% in 50%, tako P
<0,05) (slika 2B). Poleg tega, rane približa na nekaj časa post-nič (48 h) je bil večji v visoko EGFL7 izražajo divjega tipa BGC823 celic v primerjavi z MKN28 celic nizko izražanje divjega tipa, kar pomeni, da endogeni stopnje izraženosti vplivajo tudi migracije.

Transwell analize so bile izvedene za potrditev te ugotovitve in nadalje raziskati vpliv EGFL7 na invazivni potencial BGC823 celic, MKN28 celic ter ustreznimi stabilnih izražanja linij v Matrigel. Bilo je precej manj EGFL7-underexpressing celice (BGC2-13) v Matrigel primerjavi z BGC-NC in BGC823 celic (25 ± 3,1 vs
76 ± 2,9 in 79 ± 5,7 celic /dobro;. Tako P
< 0,05), kar kaže, da EGFL7 underexpression znatno zmanjšano invazivno kapaciteto (slika 2C). Podobno se je število BGC2-13 celic, ki so dosegli nižjo Matrigel brez vodnjak v transwell migracijskih testih bistveno zmanjša v primerjavi z BGC823 in BGC-NC celic (19 ± 1,1 vs.
53 ± 2,9 in 54 ± 2,6 tako P
< 0,05) (slika 2C). V nasprotju s tem, EGFL7 čezmernim v MKN28 celic znatno povečala, tako vdor v Matrigel (MKN28-EGFL7: 79 ± 6.19 celic /dobro, MKN28-NC: 40 ± 2,00 celic /dobro, MKN28: 41 ± 4,22; oboje P
< 0,05; slika 2D) in migracije (MKN28-EGFL7: 67 ± 4.16, MKN28-NC: 33 ± 5.92, MKN28: 35 ± 3,7; oboje P
< 0,05; slika 2D). Wu et al.

• Plos ONE: A 346 Case Analiza za Laparoskopska Spleen-Ohranjanje No.10 limfnih vozlov raztelesbo Proksimalno želodca raku: eni sami študiji Center
• Plos ONE: Čezmerno jedrske apoptozo inducira Factor 1 spremenila proteomskimi Profil Human želodca Cancer Cell MKN45 in povzročena celični cikel za prijetje na G1 /S Faza