Epidermal Wuesstem Faktor-wëll Domän -containing FAQ 7 (EGFL7) ass am mënschleche epithelial erhéijen upregulated a sou ass eng potentiell uweist fir malignancy. Iwwerhaapt hu virdrun Studie gewisen datt héich EGFL7 Ausdrock einfach an Metastasen vun gastric carcinoma ënnerstëtzt. D'epithelial-mesenchymal Transitioun (EMT) Initiaten den metastatic CASCADE an endows Kriibs Zellen mat invasiv an Opbau Muecht; awer, ass et net bekannt, wann EGFL7 Metastasen ënnerstëtzt vun EMT ausléisen. Mir hu fonnt, datt EGFL7 war zu Multiple Mënsch gastric Kriibs (GC) Zell Linnen overexpressed an datt overexpression gefördert Zell Invasioun an Migratioun wéi duerch Null Meter an transwell Migratioun assays verroden. Ëmgedréit, EGFL7 knockdown reduzéiert Invasioun an Migratioun-shRNA mediated. Ausserdeem, opgewues EGFL7-overexpressing Zellen nees grouss erhéijen an sech méi wahrscheinlech un der Liewer ze metastasize Verglach zu underexpressing CG Zellen folgenden subcutaneous Sprëtzen am Mais. EGFL7 overexpression GC Zell Linnen géint anoikis geschützt, eng plausibel Mechanismus fir dës verstäerkte metastatic Muecht ëmzesetzen. An excised Mënsch gastric erhéijen, Ausdrock vun EGFL7 war positiv mat Ausdrock Niveau vun der mesenchymal Bewaacher vimentin an der EMT-verbonne Transkriptiouns repressor Wéngertsschleek, an negativ soll mat Ausdrock vun der epithelial Zell Bewaacher E-cadherin soll. An GC Zell Linnen, réckgängeg EGFL7 knockdown morphological Unzeeche vun EMT a rofgaang souwuel vimentin an Wéngertsschleek Ausdrock. Zousätzlech, gefördert EGFL7 overexpression EGF receptor (EGFR) an FAQ kinase B (AKT) phospho-Aktivéierung Effekter Ofstand vun der EGFR tyrosine kinase inhibitor Trupen AG1478. Desweideren, reduzéiert AG1478 och de Bistum invasiv an Opbau Kapazitéit vun Linnen GC Zell overexpressing EGFL7. Zesummen, proposéiere dës Resultater staark dass EGFL7 Metastasen ënnerstëtzt vun EMT duerch eng EGFR-AKT-Wéngertsschleek sécher Passerelle activating. Stéierungen EGFL7-EGFR-AKT-Wéngertsschleek sécher kann ee villverspriechenden therapeutesch Strategie fir gastric Kriibs VerfÜgung
Fro:. Luo B-H, Xiong F, Wang J-P, Li J-H, Zhong M, Liu Q-L, et al. (2014) Epidermal Wuesstem Factor-Like Domain-haltege Protein 7 (EGFL7) verbessert EGF Receptor-AKT sécher, Epithelial-Mesenchymal Transitioun, an Metastasen vun Gastric Cancer BTS. PLoS NËMMEN 9 (6): e99922. Doi: 10.1371 /journal.pone.0099922 VerfÜgung
Redakter: Claudia D. Andl, Vanderbilt University, Vereenegt Staate vun Amerika VerfÜgung
Arnaque: 15. November 2013; Akzeptéiert: 19 Mee, 2014; Publizéiert: 19. Juni 2014 VerfÜgung
Copyright: © 2014 Luo et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung
Funding:. Dës Aarbecht war déi National Natural Science Foundation of China (Nr 81001080) an der Open-End Fund fir déi wäertvoll a Villes Instrumenter vun Central South University (Nr JJ3121) ënnerstëtzt. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung
Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung
Gastric Kriibs (GC) ass de véiert stäerkste gemeinsam malignant entholl an der zweeter Virwaat Ursaach vum Kriibs-Zesummenhang veruerteelt weltwäit [1], [2]. Ongeféier d'Halschent vun all GC Fäll geschéien am Osten asiatesch Länner, mat besonnesch héich incidences am Japan, Korea, an China [3], [4]. Fortschrëtter an der systemesch Behandlung vun GC huet immens kuerzfristeg Iwwerliewe fräi; Ee, bleift de fënnef-Joer Iwwerliewe Taux vun GC Patienten niddereg wéinst Réckwee an Metastasen [5]. Desweideren, déi nei festgestallte GC Patienten weisen schon metastatic Krankheet, déi fir oncologists eng grouss therapeutesch Géigespiller soumat [6]. VerfÜgung
Epidermal Wuesstem Faktor-wëll Domain-haltege FAQ 7 (EGFL7), och als wiere endothelial statin bekannt , ass eng endothelial Zell-ofgeleet secreted Faktor datt wiere Rouer Opstellung reguléieren. Parker et al. [7] bewisen, dass EGFL7 fir angiogenesis während Zebra Fësch embryogenesis entscheedende ass [8]. Rezent Studien hunn zu e puer erhéijen a Kriibs Zell Linnen, dorënner Nier erhéijen, malignant gliomas, hepatocellular carcinomas nik Ausdrock vun EGFL7 gemellt, an Colon Cancers [7] - [10]. Mir bewisen virdrun dass EGFL7 och zu gastric carcinoma overexpressed ass [11], a war Ausdrock vill mat pathologic Charakteristiken soll, Medeziner Werdegang, aarm hätt, an Metastasen [10], [12]. Dofir, ass EGFL7 engem Kandidat predictive Faktor fir Kriibs Werdegang an Metastasen. Mä kloer sinn d'Mechanismen der tumorigenic Auswierkunge vun EGFL7 Basisdaten. VerfÜgung
Metastasen ass eng Multi-Schrëtt Prozess datt en epithelial-mesenchymal Transitioun (EMT) an déi Polarisatioun epithelial Zellen ze mesenchymal Zellen ëmgerechent sinn doranner [13], engem phenotype mat gréissere invasiv an Opbau Muecht [14]. D'EMT ass och eng Reversibelen Prozess datt metastatic Cancers um invasiv virun vill geschitt oft [15]. Puer Studie berichten iwwer propedeutësch EGF Kriibs Zell Wanderung an Invasioun concomitant mat Aktivatioun vun EMT [16] promovéiert - [18]. Signifikativ, EGFL7 enthält zwee EGF-wëll Beräicher, e puer funktionell homology suggeréiert [9], [12]. Mä, ob EGFL7 Wierkdeeg EMT revaloriséiert an gastric Kriibs Metastasen Promotioun huet nach alles ze gin. Desweideren, de molekulare Mechanismen déi EMT am GC reglementéiert ass bleift gréisstendeels onbekannt. D'Zénk Fanger transcriptional repressor Wéngertsschleek kritesch ass fir Gentherapie Ausdrock reprogramming während EMT, virun allem fir Repressioun vun der Zell-Zell Haftung FAQ endothelial (E) -cadherin, de Verloscht vun deenen ass eng wichteg fréi Event zu EMT an néideg fir spéider Metastasen als [ ,,,0],19]. VerfÜgung
Déi heiteg Etude fir ze bestëmmen, ob EGFL7 Metastasen ënnerstëtzt vun EMT ausléisen. Mir hu fonnt, datt EGFL7 overexpression der EGFR-AKT Passerelle activéiert, kontrolléiert an EMT, an ënnerstëtzt GC Zell Invasioun kënschtlech VerfÜgung an Metastasen zu VIVO VerfÜgung. VerfÜgung kennen a Ray Collection VerfÜgung sech aus 79 GC Patienten (58 Männercher an 21 Weibchen) behandelt duerch chirurgesch resection am Departement vun befënnt, Xiangya Spidol, Central South University (China) kritt. Dokteschpraxen sech aus Jan 2010 zu Dez 2012 gehaal D'Patienten op Duerchschnëtt (Gamme: 28 bis 82 Joer) 54.7 Joer al goufen. An dobäi weder Chimiotherapie nach Bestrahlungen virum Agrëff VerfÜgung D'Patienten goufen informéiert, datt chirurgesch uplanzen géif gin fir konventionell agebousst Diagnos benotzt an dass de Rescht Stoffer fir Fuerschung benotzt ginn. Keng perséinlech Patient Daten huet fir dës Etude néideg an der Ëmwelt- kee Risiko gedroen, sou just richteg informéiert Zoustëmmung vun de Patienten néideg war. De Protokoll war vun der Ethik Comité vun Xiangya Spidol, Central South University (hänkt Number: 201311389) abruecht. VerfÜgung Genau Stadium definéiert gouf no de sechsten Editioun vun der TNM Stadium System vun der American Gemeinsam Comité op Cancer [ ,,,0],20], [21]. D'erhéijen sech gutt gastric adenocarcinoma an 12 Fäll ënnerscheet, mëttelméisseg zu 34 Fäll ënnerscheet, a schlecht an 33 Fäll ënnerscheet. All Echantillon waren direkt mat 10% formalin, léif fix, an paraffin-Ënnerbewosstsinn. Korrekt Medeziner Informatiounen an pathologic Diagnos sech fir all Patienten sinn. VerfÜgung Immunohistochemistry VerfÜgung Fir immunohistochemistry, virbereet Echantillon fir 15 h op 60 ° C incubated waren an Géigewier an 4 μm-décke Rubriken, deparaffinized zu turpentine, gedréchent, an zu engem falender Ethanol rehydrated: destilléiert Waasser packt. Endogenous peroxidase Aktivitéit war vun incubation fir 30 min an 0.3% Waasserstoff Hem vun 0,01 M phosphate-gefiermt Salins (PBS) inactivated. Serwéiert sech dann fir 15-20 min an citrate Prellbock (pH 6.0) bei 95 ° C fir antigen retrieval incubated, mat 5% normal Geess serum vun 0,01 M PBS bei 37 ° C fir 15 min gespaart, an incubated mat Primärschoul antibodies verdënntem zu Outil Léisung vun engem humidified Chamber um Iwwernuechtung 4 ° C. Déi folgend Primärschoul antibodies sech benotzt: Maus anti-EGFL7 monoclonal antibody (Abcam, USA, 1:400) an Kanéngchen monoclonal antibodies opgewuess géint E-cadherin (CST, USA, 1:1000), vimentin (CST, USA, 1:1000 ), Wéngertsschleek (Proteintech, USA, 1:1000), an CD34 (Boster, China, 1:500). No wäschen, sech Echantillon agesaat mat biotinylated Secondaire antibody an streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) avidin schaffen Léisung incubated. Immunolabeling war mat der botzt Realitéiten Kit vun Zhongshan Golden Bréck Company (China) laut der Recommandatiounen d'Hiersteller visualized. destilléiert Waasser packt, an Descher op drënner benotzen Permount Opriichte Medien (Fisher Wëssenschaftlech, USA) VerfÜgung Quantification vun Immunohistochemical Signaler:. Endlech, de Rubriken huet mat hematoxylin (Vecteure Laboratoiren, USA), léif vun engem Elterendeel Ethanol counterstained VerfÜgung All GC a ronderëm net-neoplastic gastric Stoffer sech bestätegt histopathologically vun zwee onofhängegen pathologists (K.-stellare a J.-HL) blann fir d'original Diagnos. Immunostaining war vun enger semi-grouss Method graded datt souwuel d'Intensitéit an d'Verdeelung vun de staining als [22]. Kuerz, goufen fënnef Felder zoufälleg ënner niddereg Vergréisserung ausgewielt (100 ×, Olympus BX51, Tokyo, Japan), a vun all Feld gezielt 200 entholl Zellen. D'staining Intensitéit war domatter wéi follegt: 0, kee staining; 1, schwaach Giel staining; 2, giel staining; 3, brong staining. Positiv Zellen sech duerch eng kloer Grenz an giel oder brong staining verschidde vun de Hannergrond charakteriséiert. De Prozentsaz vun positive Zellen (PP) markéiert huet wéi follegt: 0, 0%; 1, 1% -25%; 2, 26% -50%; 3, 51% -75%; 4, 76% -100%. Déi zwee Fändelen huet kombinéiert folgend Klassifikatioun ze kréien: negativ staining Echantillon mat immunoreactive stoung (es) vun 0 bis 2; schwaach positive staining Echantillon mat es vun 3 bis 5; staark positive staining Echantillon mat es vu 6 bis 7 Echantillon déi schwaach a staark positive staining huet sech an der statistescher Analys abegraff. VerfÜgung Zell zesummeféieren a Kultur VerfÜgung Mënscherechter GC Zell Linnen SGC7901 (mëttelméisseg ënnerscheet adenocarcinoma), BGC823 (schlecht ënnerscheet adenocarcinoma), MKN28 (gutt-ënnerscheet adenocarcinoma), an MKN45 (schlecht ënnerscheet adenocarcinoma) wéi och normal gastric mucosa epithelial GES-1 Zellen sech aus der Type Kultur Collection vun der chinesescher Akademie vun de Wëssenschaften kaaft (Shanghai, China). All Zellen sech cultured an zu Roswell Park Memorial Institut (RPMI) 1640 mëttelfristeg (Gibco Biocult, Paisley, UK) ergänzt mat 10% An et Bovine serum (FBS) (Gibco Déi), 100 U /ml penicillin, an 100 μg /ml haten streptomycin bei 37 ° C an enger humidified Atmosphär mat 5% CO 2. VerfÜgung Short Hairpin RNS (shRNA) an Recombinant Expression Plasmid Pex-2-EGFL7 VerfÜgung Zell Zeilen ze generéieren overexpressing oder underexpressing EGFL7, déi gebierteg Zell goufe mat Ausdrock Vecteure oder ugepasste shRNA stably transfected. D'shRNA Message vu mënschlechen EGFL7 sech no der mënschlecher EGFL7 DNA Haaptrei (GenBank KENG NM_016215.3.) Entworf vum Designer 3.0 Software (Genepharma, http://www.genepharma.com) an Blast Recherchen (http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). D'Zil Message huet de Mënsch Nepgen Datebank vum Héichuewen Sich Verglach keng héich homology zu anere coding Message ze garantéieren. De Message EGFL7-Homo-333 an EGFL7-Homo-887 huet sech als Zil Siten fir e spezifeschen EGFL7 shRNA identifizéiert. Ausserdeem, war ee nonspecific Haaptrei (Alaister shRNA) als negativ Kontroll entworf, an der GAPDH Haaptrei war wéi eng intern Kontroll entworf. D'shRNA Message sech wéi follegt zesummen: VerfÜgung EGFL7-shRNA1 géint EGFL7-Homo-333: Sënn, 5'-CACCGGTGCTGCTGATGTGGCTTTCAAGAGAAGCCACATCAGCAGCACCTTTTTTG-3 "; antisense, 5'-GATCCAAAAAAGGTGCTGCTGATGTGGCTTCTCTTGAAAGCCACATCAGCAGCACC-3 "; EGFL7-shRNA2 géint EGFL7-Homo-887: Sënn, 5'-CACCGAGTGGACAGTGCAATGAATTCAAGAGATTCATTGCACTGTCCACTCTTTTTTG-3 "; antisense, 5'-GATCCAAAAAAGAGTGGACAGTGCAATGAATCTCTTGAATTCATTGCACTGTCCACTC-3 "; nonspecific Sënn, 5'-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3 "; antisense, 5'-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3 "; GAPDH Sënn, 5'-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3 "; antisense, 5'-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3 ". D'pGPU6 /GFP /Neo (gréng unisse FAQ, neomycin) Vecteure (Genepharma Company, Shanghai, China) war fir plasmid Konstruktioun benotzt. D'nucleotides waren genannt an hin an der BamHI an HindIII Siten an ëmgewandelt DH5a-zoustännegen Kolibakterie. Dual kanamycin /neomycin-resistent Kolonien sech ausgewielt an der Vecteure Message vun Restriktioun unzereegen an DNA sequencing confirméiert. VerfÜgung D'EGFL7 cDNA Zeechesaatz vum 533-1353 Aminosaier Haaptrei war subcloned an enger pEX-2 plasmid Vecteure (Genepharma, Shanghai, China) vun BglII /EcoRI duebel unzereegen an pEX-2-EGFL7 designéierte. D'recombinant plasmid war zu DH5a-zoustännegen Kolibakterie an der Vecteure Haaptrei Implikatioune vun Hinnen alleguer Kick. DNA sequencing confirméiert, datt d'recombinant plasmid eng EGFL7 Gentherapie ofgesprengt t'selwecht ass, an GenBank (GenBank KENG. NM_016215.3) aus. Kanamycin /neomycin-resistent Kolonien sech ausgewielt an der Haaptrei vun Restriktioun unzereegen an DNA sequencing confirméiert. All primers sech entwéckelt a Wierderbuch duerch Genepharma (Shanghai, China). VerfÜgung gëllt Transfection an G418 selektionéiert VerfÜgung eng EGFL7-underexpressing Klon (an entspriechend Kontroll) ze etabléieren, goufen BGC823 Zellen rakommen zu sechs -well Kultur Placken um 1 × 10 Western Blot Analys VerfÜgung No Zellen 80% -95% erreecht Niewebaach, war total FAQ benotzt Zell lysate Extraktioun gefiermt Quecksëlwer (Beyotime, China) wouvun protease inhibitor (1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride). Lysate total FAQ Konzentratioun war mat engem bicinchoninic Seier FAQ assay Kit (Pierce Déi, Rockford, IL, USA) sech. Gläich Montanten vun FAQ (25 μg) aus all Behandlung Grupp sech pro gelies Geschäftswelt vun 8% Natrium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelies electrophoresis (SDS-PAGE) getrennt a transferéiert ze polyvinylidene difluoride (PVDF) Schläimhait (Millipore, Billerica, USA). D'Schläimhait sech Rei mat erauszesichen gefiermt aus Tris-gefiermt Salins (TBS) mat 5% nonfat dréchen Mëllech fir 2 h bei Raumtemperatur an dann landen bei 4 ° C an deemselwechte gefiermt mat ee vun de folgende Primärschoul antibodies incubated: anti- EGFL7 (1:500; Abcam Cambridge Science, UK). Anti-E-cadherin, anti-vimentin, anti-Wéngertsschleek (all um 1:1000; Zell sécher Technology, CST, USA), anti-GAPDH (1:10000, Protech), anti-EGFR, anti-phospho-EGFR, Anti-AKT, anti-phospho-AKT, anti-Erk, an anti-phospho-Erk (all 1:800, Anbo Biotech Co., Ltd., USA). Immunolabeled Schläimhait sech dann mat engem HRP-conjugated Secondaire antibody incubated (1:2000, Immunologie Consultants schafft, Inc., USA) fir 2 h bei Raumtemperatur. Nom Wäschen mat TBST, goufen FAQ Bands no der Uweisungen d'Hiersteller mat de coopération chemiluminescence erkennen System (Advansta Corporation, Menlo Park, Kalifornien, USA) visualized. Ausdrock vun GAPDH war als Luede Kontroll an Proteinen benotzt UTHSCSA Image Tool 3.0 laachen benotzt. Target FAQ Ausdrock war wéi d'Band Intensitéit Verhältnis vun der Zil- FAQ fir GAPDH berechent. VerfÜgung RNS erauszéien a Hinnen alleguer Analys VerfÜgung BTS sech lysed zu TRIzol reagent (Invitrogen, Karlsbad CA, USA) an total RNS war no bereet den Hiersteller d'Uweisungen. Éischt Deformatioun cDNAs sech duerch d'PrimeScript RT reagent Kit Wierderbuch mat gDNA Eraser (Takara, Otsu, Japan) an Implikatioune vun Hinnen alleguer de folgenden spezifesche primers benotzt: EGFL7 Sënn, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 "; antisense, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 ". D'cDNA vun GAPDH Implikatioune war fir d'Quantitéit vun cDNA an all Prouf präsent ze kontrolléieren (Sënn, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 "; antisense, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3"). Hinnen alleguer amplification war bei 94 ° C fir 5 min, gefollegt vun 30 Zykle vun 94 ° C fir 30 den gehaal, 57 ° C fir 30 ass, an 72 ° C fir 40 ass. Hinnen alleguer Produiten sech op 1.0% agarose gels an Zil- Gentherapie Ausdrock wéi d'Verhältnis vun der Zil- Gentherapie Band Intensitéit fir datt vun GAPDH benotzt Image Tool 3.0 (D'Universitéit vun Texas Gesondheet Science Center, San Antonio, Texas, USA). Real-Zäit Hinnen alleguer VerfÜgung D'Reaktioun Mëschung fir real-Zäit Hinnen alleguer vun 10 μl vun Premix Ex Taq (NÄISCHT qPCR), 0,2 μM vun all EGFL7 an GAPDH primer (ënnen) bestoung, 0,2 pmol /TaqMan Ämter ml (EGFL7 oder GAPDH), an 0,4 μl Rox (tetrapropano-6-carboxyrhodamine) Referenz Dye II (Takara Bio, Shiga, Japan). D'Mëschung war mat 2 μl cDNA an all gutt vun engem 96-gutt MicroAmp zappen kombinéiert (Obwuel Biosystems, CA, USA) an destilléiert Waasser benotzt gouf zu enger definitiver Volume vun 20 μl ze ajustéieren. Déi folgend primers sech entworf Primer Premier 6.0 Software Package benotzt (Premier Biosoft International, gekësst Alto, CA, USA): EGFL7: vir, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 "; Géigendeel, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 "; GAPDH: vir, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 "; Géigendeel, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 ". All Reaktioune waren op enger 7500 Real-Time Hinnen alleguer System (Obwuel Biosystems, CA, USA) gesuergt. Thermocycle ware initial denaturation bei 95,8 ° C fir 30 Spiller vun 40 Zykle vun amplification op 95,8 ° C duerno fir 6 Spiller an 60,8 ° C fir 30 s. VerfÜgung Ähnlech experimentell Konditiounen den Ausdrock vun aneren ze bewäerten agesat goufen Genen mat de folgenden primers: E-cadherin: vir, 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3 "; Géigendeel, 5'-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 "; vimentin: vir, 5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3 "; Géigendeel, 5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3 "; Wéngertsschleek: vir, 5'-TGCTCCACAAGCACCAAGA-3 "; Géigendeel, 5'-GCAGAGGACACAGAACCAGAAA-3 "; GAPDH: vir, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 "; Géigendeel, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 ". D'Reaktioun Mëschung fir real-Zäit Hinnen alleguer bestoung vun 10 μl vun SYBR Premix Ex TaqTM II, 1,6 μl vun all primer (0,4 μM), 0,4 μl vun Rox Referenz Dye, 2 μl vun Skelett cDNA, a 6 μl vun diethyl pyrocarbonate-behandelt Waasser. fir 10 den initial denaturation bei 95 ° C, gefollegt vun 40 Zykle vun amplification bei 95 ° C fir 5: Real-Zäit Hinnen alleguer war op engem 7500 Real-Time Hinnen alleguer System (Obwuel Biosystems, CA, USA) mat der folgender thermocycle Konditiounen gesuergt ass an 60 ° C fir 34 s. VerfÜgung Zell prolifération Assay VerfÜgung Zell Prolifératioun war vun der 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5 diphenyl tetrazolium bromide geschate (MTT) liewensfäeg Zell assay. Zellen sech am Joer 2000 op 96-Meter Placke plated /gutt an cultured fir 12, 24, 48, 72, an 96 h. Dunn, 20 μl vun MTT (Fläch) Bourse Léisung (5 mg /ml) war gutt an all zu 200 μl vun mëttelfristeg agefouert, an Placke fir eng zousätzlech 4 h op 37 ° C incubated goufen. No virsiichteg Striewe vun der Kultur mëttelgrouss, huet 150 μl Police sulfoxide (DMSO) fir all gutt derbäi formazan Kristaller aus MTT vun liewensfäeg Zellen geformt ze verbidden. D'Placke waren op enger Raemerich Plattform fir 10 min an absorbance bei 490 nm mat engem microplate Lieser. VerfÜgung Käerz Kolonie Formatioun Assay VerfÜgung BTS sech géint bei 200 /och am selwechten six- Moossen huelen gutt Placke wéi fir aner assays benotzt Kolonie Équipe ënnert Zell-Operstéiungszeen Konditiounen ze bewäerten. No 10 Deeg, huet Zellen mat 1% Giemsa Kierchefënster, an d'Zuel vun siichtbar Kolonie war gezielt. Der relativer Klon Opstellung index war wéi heeschen Zuel vun Kolonien /Nummer vun rakommen Zellen × 100%. VerfÜgung Letzeburger Politiker Meter Chrëschtdagszäite Assays VerfÜgung Fir assay Zell Migratioun berechent, 5 × 10 An kënschtlech VerfÜgung Missiounen a Migratioun Assay VerfÜgung Zell Invasioun a Migratioun sech transwell CHAMBERS bewäert benotzt (Corning, New York, USA). Invasioun assays sech zu transwell CHAMBERS vun polycarbonate Membran filter am Text (8 μm Pore) fir 24-gutt Placke getrennt gehaal. All Zëmmer war mat 100 μl vun 1:20 Matrigel (Becton, Dickinson an Company, New York, USA) zu kal RPMI 1640 bedeckt Nuecht op 4 ° C. Duerno, Zellen (5 × 10 Anoikis Assay VerfÜgung puer dovun-hydroxyethyl methacrylate (puer dovun-HEMA, Fläch-Aldrich), déi fir Kultur Telleren an aner Wuesstem Fläch Zell Haftung bremst, war zu 95% Ethanol zu enger definitiver Konzentratioun vun 12 mg /ml reconstituted. Ze preparéieren puer dovun-HEMA-Beschichtete Placken, 2 ml vun dëser Léisung ass notéiert ze ginn all gutt vun enger 6-gutt zappen an erlaabt Nuecht ënnert enger laminar Flux Otemschwieregkeeten Kultur Rotkäppchen ze dréchnen. Dunn 5 × 10 Xenograft gewaltege Sträit Mouse Model VerfÜgung Xenografting vun GC Zell Linnen war fir d'Fleeg an Uwendung vun schafft Déieren no der National ageschafft gesuergt (Publikatioun keen. 86-23, iwwerschafft 1985), déi vun der Déierefrënn Care an Benotzt Comité vun der Drëtte Xiangya Spidol, Central South University ofgeseent gouf ( LLSC [LA] 2013-0010), a conformed zu aktuellen Chinese Recht op de Schutz vun Déieren (LLSC [LA] 2013-0010). All Efforten gemaach goufen d'Zuel vu Mais ze minimiséieren benotzt an hir Leed. VerfÜgung Drëssegjärege-fënnef weiblech Balb /c Sauna Mais Alter 4 bis 6 Wochen goufen aus Slac schafft Déieren Co. Ltd. kaaft (Shanghai, China) an an individuell gelëfter Käfeg waren. Mais sech zoufälleg agedeelt BGC823, BGC-NC, BGC2-13, MKN28, MKN28-NC, MKN28-EGFL7, a Kontroll PBS Gruppen (n = 5 Mais /Grupp). Cultured Zellen sech gesammelt an resuspended vun PBS op 1 × 10 statistique Analysen VerfÜgung All Statistik analyséiert goufen standing benotzt SPSS Version 16.0 (SPSS Galaxy Chicago, IL, USA) fir Windows. Date sinn ausdrécke well heeschen ± normale deviation (Fils) aus op d'mannst dräi onofhängeg Experimenter. Group heescht sech am Verglach zur eent-Manéier Analyse vun Varianz (ANOVA) mat Student-Newman-Keuls (SNK) oder mannst groussen Ënnerscheed (LSD) Tester fir Post hoc Pair-schlau Vergläicher. D'Spearman Gemeng Korrelatioun souguer gemaach gouf benotzt der kennenzeléieren tëscht EGFL7 an EMT-Zesummenhang FAQ Ausdrock Niveauen am surgically excised gastric Kriibs Stoffer ze bestëmmen. A P VerfÜgung &Si besteet; 0,05 war statistesch relevant als VerfÜgung EGFL7 Expression war an Human Gastric Cancer Zell zesummeféieren nik VerfÜgung Western blot an RT-. Hinnen alleguer waren standing EGFL7 Ausdrock vun der mënschlecher GC Zell Linnen SGC7901, BGC823, MKN45, an MKN28 fir dass zu normal gastric mucosa epithelial GES-1 Zellen ze vergläichen. Nik EGFL7 Niveau waren an all véier GC Zell Linnen Verglach zu GES-1, mat BGC823 an MKN28 mat der héchster an déifst EGFL7 Ausdrock, respektiv, souwuel bei d'FAQ a mRNA Niveauen (Sauerdall 1A an 1B) fonnt. Dofir, BGC823 an MKN28 sech zu Kierzunge Experimenter benotzt d'Auswierkunge vun EGFL7 Ausdrock op Prolifératioun, Migratioun, an metastatic Potential ze bewäerten. Mir ugestallten stabil shRNA transfection EGFL7 Ausdrock vun BGC823 Zellen an entworf engem Mënsch EGFL7 héich-Ausdrock plasmid (pEX-2-EGFL7) gestiermt EGFL7 Ausdrock vun MKN28 Zellen. VerfÜgung Mir gebaut zwee shRNA plasmid vectors gezielt EGFL7 zu oofgesinn mRNA an gehaal qRT-Hinnen alleguer d'Efficacitéit vun dëse Kandidat shRNA Message ze bewäerten EGFL7 Verglach zu nonspecific Message un oofgesinn. D'shRNA1 an shRNA2 Message erreecht 75% an 30% inhibition vun EGFL7, bzw. (Dorënner 1c), also méi efficace shRNA1 war fir all Kierzunge Experimenter benotzt. D'BGC823 Linnen transfected stably mat pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 oder pGPU6 /GFP /Neo-nonspecific-shRNA sech BGC2-13 an BGC-NC designéierte, bzw.. D'MKN28 Linnen stably mat pEX-2-EGFL7 transfected an pEX-2-nonspecific MKN28-EGFL7 an MKN28-NC bezeechent goufen, respektiv. Den Ausdrock Niveau vun EGFL7 FAQ a mRNA zu G418-resistent clones waren och déi westlech blot (Dorënner 1D) an real-Zäit RT-Hinnen alleguer (Dorënner 1E) bewäert. D'Resultater zougedréckt Ofstand EGFL7 Ausdrock vun BGC2-13 Zellen erofgaangen am Verglach zu BGC-NC Zellen an däitlech nik Ausdrock vun MKN28-EGFL7 Zellen am Verglach zu MKN28-NC Zellen (all P VerfÜgung &Si besteet; 0,05). Do ware keng grouss Ënnerscheeder zu mRNA an FAQ Ausdrock tëscht BGC-NC an BGC Zellen oder tëscht MKN28-NC an MKN28 Zellen (all P VerfÜgung > 0,05). VerfÜgung EGFL7 Opstig GC Zell Missiounen a Migratioun, mä net GC Zell prolifération VerfÜgung Afloss huet fir d'Roll vun EGFL7 am GC Werdegang ermëttelen, mir éischt iwwerpréift ob EGFL7 silencing oder overexpression verännert der proliferative, invasiv, an Opbau Kapazitéite vun GC Zellen. Null Meter verkënnegt gouf benotzt Migratioun vun stably transfected Zellen ze moossen. A Meter gouf am GC Zell monolayers vun engem eenheetlechen Null an d'Zuel vun Zellen am Null Zone Verglach op 0 a 48 h entsteet. Zoumaache vun der Wonn war wiesentlech méi lues zu BGC2-13 Kulturen (underexpressing EGFL7) am Verglach zu déem BGC823 an BGC-NC Kulturen (32% vs. VerfÜgung 100% an 98%, souwuel P VerfÜgung &Si besteet; 0,05) (Dorënner 2A). Am Géigesaz, war Zoumaache vill méi séier an MKN28-EGFL7 Kulturen (overexpressing EGFL7) am Verglach zu MKN28 an MKN28-NC Kulturen (99% vs. VerfÜgung 49% an 50%, souwuel P VerfÜgung &Si besteet; 0,05) (Dorënner 2B). Desweideren, gudde Meter méi no bei der Zäit Post-Null (48 h) war eng grouss an héich EGFL7-ausdrécke wëll Typ BGC823 Zellen am Verglach zu niddereg-ausdrécke wëll Typ MKN28 Zellen, wat beweist, datt endogenous Ausdrock Niveauen och Migratioun Impakt. VerfÜgung Transwell assays goufen dës Experienz a weider z'ënnersichen den Effet vun EGFL7 op der invasiv Potential vun BGC823 Zellen ze confirméieren gesuergt, MKN28 Zellen, an déi jeeweileg stabil Ausdrock Linnen an Matrigel. Et goufen vill manner EGFL7-underexpressing (BGC2-13) Zellen am Matrigel Verglach zu BGC-NC an BGC823 Zellen (25 ± 3,1 vs VerfÜgung 76 ± 2,9 an 79 ± 5,7 Zellen /gutt;. Béid P VerfÜgung &Si besteet; 0,05), wat beweist, datt EGFL7 groussen reduzéierte invasiv Kapazitéit (Dorënner 2C) underexpression. Den Zerfall, war d'Zuel vun BGC2-13 Zellen den ënneschten Matrigel-gratis gutt an transwell Migratioun assays Erréchen bedeitend reduzéiert Verglach zu BGC823 an BGC-NC Zellen (19 ± 1,1 vs. VerfÜgung 53 ± 2,9 an 54 ± 2,6 , souwuel P VerfÜgung &Si besteet; 0,05) (Dorënner 2C). Am Géigesaz, EGFL7 overexpression zu MKN28 Zellen verstäerkte vill souwuel Invasioun an Matrigel (MKN28-EGFL7: 79 ± 6,19 Zellen /gutt, MKN28-NC: 40 ± 2,00 Zellen /gutt, MKN28: 41 ± 4,22; souwuel P spontan a Methode
Resultater VerfÜgung
&Si besteet; 0,05; Dorënner 2D) a Migratioun (MKN28-EGFL7: 67 ± 4,16, MKN28-NC: 33 ± 5,92, MKN28: 35 ± 3,7; souwuel P VerfÜgung &Si besteet; 0,05; Dorënner 2D).
Mikroben verbonne mat Häerzinfarkt fanne Studie
Darmmikroben kéinte mat Depressioun verbonne sinn
De Wëssenschaftler beweist d'Roll vum Mikrobiom bei der Adipositas
Fungi a Bakterien am Darm kënne gläichméisseg mënschlech Gesondheet a Krankheet Gravitéit beaflossen
SARS-CoV-2 Infektioun verlängert viral Verloscht a Lymphozytenverloscht bei Patienten mat Kriibs
Highlights a Schlëssel matzehuelen vun der Boston Bacterial Meeting 2019 (BBM)
Genetesch Tweaking Darmbakterien reduzéiert de Risiko vu Kolorektalkriibs bei Mais fënnt Studie
Fuerscher hunn erausfonnt datt dVeraarbechtung vun de Genen vun de Bakterien, déi an den Darm vun de Mais präsent sinn, hëllefe kënnen dEntzündung an de verbonne Risiko vu kolorektalen Kriibs ze reduz
Fuerscher fannen neie Wee fir géint Krankheet am MS Modell ze schützen
Fuerscher am Brigham a Womens Hospital hunn eng nei an onerwaart Manéier fonnt fir Krankheet an engem preklinesche Modell vu Multiple Sklerose (MS) ze vermeiden. Bildkreditt:Lightspring / S
Kriibschemikalie vum gemeinsame Darmmikrobe
Vill üblech Darmbakterien droen Kriibs verursaacht Mutatiounen, seet eng nei Studie déi am Journal publizéiert gouf Natur de 27. Februar 2020. Den Hannergrond Et gi Billiounen Bakterien, déi an