PLoS ONE: epidermale groeifactor-achtige domein-bevattend eiwit 7 (EGFL7) Verbetert de EGF-receptor-AKT Signalering,-mesenchymale transitie en metastase van maagkanker Cells

Abstract

epidermale groeifactor-achtige domein -met een eiwit 7 (EGFL7) wordt opgereguleerd in humane epitheliale tumoren en dus is een potentiële biomarker voor maligniteiten. In eerdere studies aangetoond dat hoge EGFL7 expressie stimuleert infiltratie en metastase van maagcarcinoom. De epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) initieert de metastatische cascade en schenkt kankercellen met invasieve en trekkende capaciteit; het is echter niet bekend of EGFL7 bevordert metastase door triggering EMT. We vonden dat EGFL7 werd overexpressie in meerdere menselijke maagkanker (GC) cellijnen en dat overexpressie bevorderd cel invasie en migratie zoals blijkt uit scratch wond en transwell migratie assays. Omgekeerd, shRNA-gemedieerde EGFL7 knockdown verminderd invasie en migratie. Bovendien EGFL7-overexpressie cellen groeide uit tot grotere tumoren en hadden meer kans om uitzaaien naar de lever in vergelijking met underexpressing CG cellen na subcutane injectie bij muizen. EGFL7 overexpressie beschermd GC cellijnen tegen anoikis, die een plausibel mechanisme voor dit verhoogde metastatische capaciteit. In uitgesneden menselijke maag tumoren, werd expressie van EGFL7 positief gecorreleerd met expressieniveaus van de mesenchymale marker vimentine en de EMT-geassocieerde transcriptierepressor Slak en negatief gecorreleerd met expressie van epitheelcel marker E-cadherine. In GC cellijnen, EGFL7 knock-down omgekeerd morfologische tekenen van EMT en verminderde zowel vimentine en Slak expressie. Bovendien EGFL7 overexpressie bevorderd EGF receptor (EGFR) en proteïnekinase B (AKT) fosfo-activatie effecten aanzienlijk onderdrukt door de EGFR tyrosine kinase inhibitor AG1478. Bovendien AG1478 verminderde ook het verhoogde invasieve en trekkende capaciteit van GC cellijnen overexpressie EGFL7. Samen deze resultaten suggereren sterk dat EGFL7 bevordert metastase door het activeren van EMT door middel van een EGFR-AKT-Snail signaalroute. Verstoring van EGFL7-EGFR-AKT-Snail signalering kan een veelbelovende therapeutische strategie voor maagkanker

Citation:. Luo B-H, Xiong F, Wang J-P, Li J-H, Zhong M, Liu Q-L, et al. (2014) epidermale groeifactor-achtige domein-bevattend eiwit 7 (EGFL7) Verbetert de EGF-receptor-AKT Signalering,-mesenchymale transitie en metastase van maagkanker Cells. PLoS ONE 9 (6): e99922. doi: 10.1371 /journal.pone.0099922

Uitgever: Claudia D. Andl, Vanderbilt University, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 15 november 2013; Geaccepteerd: 19 mei 2014; Gepubliceerd: 19 juni 2014

Copyright: © 2014 Luo et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (nr 81001080) en de Open-end fonds voor de waardevolle en precisie-instrumenten van Centraal Zuid-Universiteit (nr JJ3121). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is de vierde meest voorkomende kwaadaardige tumor en de tweede belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte in de wereld [1], [2]. Ongeveer de helft van alle GC gevallen doen zich voor in Oost-Aziatische landen, met een bijzonder hoge incidentie in Japan, Korea en China [3], [4]. Vooruitgang in de systemische behandeling van GC is sterk toegenomen korte termijn overleven; Echter, de vijfjarige overlevingskans van GC patiënten blijft laag als gevolg van een terugval en metastase [5]. Bovendien zijn de meeste nieuw gediagnosticeerde GC patiënten gemetastaseerde ziekte, die een belangrijke therapeutische uitdaging voor oncologen vormt tonen al [6].

epidermale groeifactor-like-domein met eiwit 7 (EGFL7), ook bekend als de vasculaire endotheliale statine , een endotheelcel afgeleide factor uitgescheiden dat vasculaire vaatvorming regelt. Parker et al. [7] blijkt dat EGFL7 cruciaal is voor angiogenese in zebravis embryogenese [8]. Recente studies hebben verhoogde expressie van EGFL7 vermeld voor diverse tumoren en kankercellijnen, waaronder niertumoren, maligne gliomen, hepatocellulaire carcinomen, en darmkanker [7] - [10]. We hebben eerder aangetoond dat EGFL7 ook overexpressie in maagcarcinoom [11], en expressie was significant gecorreleerd met pathologische kenmerken, klinische progressie, slechte prognose en métastase [10], [12]. Daarom EGFL7 is een kandidaat voorspellende factor voor de progressie van kanker en metastase. De mechanismen achter de tumorigene effecten van EGFL7 onduidelijk.

Metastase is een proces van meerdere stappen dat een epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) waarin gepolariseerde epitheelcellen omgezet in mesenchymale cellen [13] omvat, een fenotype met meer invasieve en migrerende vermogen [14]. De EMT is een omkeerbaar proces dat vaak optreedt bij het invasieve aanwezigheid van vele uitgezaaide tumoren [15]. Verschillende studies hebben aangetoond dat EGF bevordert kankercel migratie en invasie gelijktijdig met activering van EMT [16] - [18]. Significant, EGFL7 bevat twee EGF-achtige domeinen, suggereert enkele functionele homologie [9], [12]. Maar of EGFL7 eigenlijk doet verbeteren EMT en bevorderen maagkanker metastase moet nog worden bepaald. Bovendien zijn de moleculaire mechanismen die EMT is geregeld in GC blijven grotendeels onbekend. De zinkvinger transcriptionele repressor Snail is essentieel voor genexpressie herprogrammering gedurende EMT, met name voor onderdrukking van de adhesie van cellen endotheliale proteïne (E) -cadherin wordt het verlies waarvan geacht een belangrijke vroege gebeurtenis in EMT en noodzakelijk voor daaropvolgende metastase [ ,,,0],19].

De huidige studie had als doel om te bepalen of EGFL7 bevordert metastase door triggering EMT. We vonden dat EGFL7 overexpressie activeert de EGFR-AKT pathway, triggers EMT, en bevordert GC cel invasie In vitro
en metastase In vivo
.

Materialen en methoden

patiënten en Tissue Collection

Maagcarcinoom weefsels werden verkregen van 79 GC patiënten (58 mannen en 21 vrouwen) behandeld door chirurgische resectie bij de afdeling Chirurgie, Xiangya Ziekenhuis, Centraal Zuid-University (China). Operaties werden uitgevoerd van januari 2010 tot december 2012. De patiënten waren 54,7 jaar gemiddeld (bereik: 28-82 jaar). En kreeg geen chemotherapie of bestraling voor de operatie

De patiënten werden geïnformeerd dat chirurgische specimens zou worden gebruikt voor conventionele pathologische diagnose en de resterende weefsels kunnen worden gebruikt voor onderzoek. Er worden geen persoonlijke patiëntgegevens nodig was voor deze studie en de protocollen uitgevoerd geen risico, dus alleen verbale informed consent was nodig van de patiënten. Het protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van Xiangya Hospital, Centraal Zuid-Universiteit (Permit Nummer: 201.311.389).

Disease enscenering werd gedefinieerd volgens de zesde editie van de TNM-classificatie van het Gemengd Comité American on Cancer [ ,,,0],20], [21]. De tumoren werden goed gedifferentieerd adenocarcinoom van de maag in 12 gevallen matig gedifferentieerd in 34 gevallen, en slecht gedifferentieerde in 33 gevallen. Alle monsters werden onmiddellijk gefixeerd met 10% formaline, gedehydrateerd en in paraffine ingebed. Nauwkeurige klinische informatie en pathologische diagnose waren beschikbaar voor alle patiënten.

Immunohistochemie

Voor immunohistochemie werden bereid monsters geïncubeerd bij 60 ° C gedurende 15 uur en tot 4 urn dikke secties gesneden, ontdaan van paraffine in terpentijn, gedroogd en opnieuw gehydrateerd in afnemende ethanol: gedestilleerd water gradiënt. Endogene peroxidase activiteit werd geïnactiveerd door incubatie gedurende 30 min in 0,3% waterstofperoxide in 0,01 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Plakjes werden vervolgens gedurende 15-20 minuten in citraatbuffer (pH 6,0) bij 95 ° C gedurende antigen retrieval, geblokkeerd met 5% normaal geit serum in 0,01 M PBS gedurende 15 minuten bij 37 ° C en geïncubeerd met primaire antilichamen verdund in blokkeeroplossing gedurende de nacht bij 4 ° C in een bevochtigde kamer. De volgende primaire antilichamen werden gebruikt: muizen anti-EGFL7 monoklonaal antilichaam (Abcam, USA, 1:400) en konijn monoklonale antilichamen opgewekt tegen E-cadherine (CST, USA, 1:1000), vimentine (CST, USA, 1:1000 ), Slak (Proteintech, USA, 1:1000) en CD34 (Boster, China, 1:500). Na wassen, werden monsters achtereenvolgens geïncubeerd met gebiotinyleerd secundair antilichaam en streptavidine-mierikswortelperoxidase (HRP) avidine werkoplossing. Immunokleuring werd gevisualiseerd met de DAB substraat kit van Zhongshan Golden Bridge Company (China) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Tenslotte werden de secties tegengekleurd met hematoxyline (Vector Laboratories, USA), gedehydrateerd in een oplopende ethanol: gedestilleerd water gradiënt, en bevestigd op objectglaasjes middels fixeermiddelen Permount (Fisher Scientific, USA)

Kwantificering van immunohistochemische signalen.

Alle GC en de omliggende niet-neoplastische maag weefsels histopathologisch bevestigd door twee onafhankelijke pathologen (K.-SW en J.-HL) blind voor de oorspronkelijke diagnose. Immunokleuring werd beoordeeld door een semi-kwantitatieve methode die zowel de intensiteit en verdeling van de kleuring [22] beschouwd. In het kort werden vijf willekeurig gekozen velden onder lage vergroting (100 x Olympus BX51, Tokyo, Japan) en 200 tumorcellen geteld van elk veld. De kleuringsintensiteit werd als volgt gescoord: 0, geen verkleuring; 1, zwakke gele vlekken; 2, gele vlekken; 3, bruine kleuring. Positieve cellen werden gekarakteriseerd door een duidelijke grens en gele of bruine vlekken onderscheiden van de achtergrond. Het percentage positieve cellen (PP) werd als volgt gescoord: 0, 0%; 1, 1% -25%; 2, 26% -50%; 3, 51% -75%; 4, 76% -100%. De twee scores werden gecombineerd om de volgende indeling te verkrijgen: negatieve kleuring, monsters met een immunoreactieve score (IRS) van 0 tot 2; zwak positieve kleuring, monsters met IRS van 3-5; sterk positieve kleuring, monsters met IRS van 6 tot 7. Monsters die te zacht en sterk toonde positieve kleuring werden opgenomen in de statistische analyse.

cellijnen en Cultuur

Human GC cellijnen SGC7901 (matig gedifferentieerd adenocarcinoom), BGC823 (slecht gedifferentieerd adenocarcinoom), MKN28 (goed gedifferentieerd adenocarcinoom), en MKN45 (slecht gedifferentieerd adenocarcinoom) evenals normaal maagslijmvlies epitheliale GES-1-cellen werden gekocht bij de Type Culture Collection van de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China). Alle cellen werden gekweekt en gehandhaafd Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium (Gibco Biocult, Paisley, UK) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) (Gibco Biotechnology), 100 U /ml penicilline en 100 ug /ml streptomycine bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO _2.

korte haarspeld RNA (shRNA) en recombinante expressieplasmide Pex-2-EGFL7

cellijnen genereren overexpressie of underexpressing EGFL7 werden de natieve cellijnen stabiel getransfecteerd met een expressievector of gerichte shRNA. De shRNA sequenties van menselijke EGFL7 werden ontworpen volgens de menselijke EGFL7 DNA-sequentie (GenBank NO NM_016215.3.) Van Designer 3.0 software (Genepharma, http://www.genepharma.com) en BLAST zoekopdrachten (http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). De doelsequenties werden vergeleken met de menselijke genoom database BLAST zoekopdracht geen hoge homologie met andere coderende sequenties garanderen. De sequenties EGFL7-homo-333 en EGFL7-homo-887 werden geïdentificeerd als doelwit plaatsen voor een specifiek EGFL7 shRNA. Bovendien is een niet-specifieke sequentie (scramble shRNA) werd ontworpen als een negatieve controle en de GAPDH sequentie werd ontworpen als een interne controle. De shRNA sequenties waren als volgt:

EGFL7-shRNA1 tegen EGFL7-homo-333: sense 5'-CACCGGTGCTGCTGATGTGGCTTTCAAGAGAAGCCACATCAGCAGCACCTTTTTTG-3 '; antisense, 5'-GATCCAAAAAAGGTGCTGCTGATGTGGCTTCTCTTGAAAGCCACATCAGCAGCACC-3 '; EGFL7-shRNA2 tegen EGFL7-homo-887: sense, 5'-CACCGAGTGGACAGTGCAATGAATTCAAGAGATTCATTGCACTGTCCACTCTTTTTTG-3 '; antisense, 5'-GATCCAAAAAAGAGTGGACAGTGCAATGAATCTCTTGAATTCATTGCACTGTCCACTC-3 '; -specifieke sense, 5'-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3 '; antisense, 5'-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3 '; GAPDH sense, 5'-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3 '; antisense, 5'-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3 '. De pGPU6 /GFP /Neo (groen fluorescerend eiwit, neomycine) vector (Genepharma Company, Shanghai, China) werd gebruikt voor plasmide constructie. De nucleotiden werden gekoppeld en in de BamHI en HindIII-plaatsen ingebracht en getransformeerd in DH5a-competente E. coli. Dual kanamycine /neomycine-resistente kolonies werden geselecteerd en de vectorsequenties bevestigd door restrictiedigestie en DNA-sequentie.

De EGFL7 cDNA dat codeert voor de aminozuursequentie 533-1353 werd gesubkloneerd in een pEX-2 plasmidevector (Genepharma, Shanghai, China) door BglII /EcoRI dubbele ontsluiting en aangeduid pEX-2-EGFL7. Het recombinante plasmide werd geamplificeerd in DH5a competente E. coli en de vectorsequentie geamplificeerd met PCR. DNA-sequentiëring bevestigde dat de recombinante plasmide bevatte een EGFL7 genfragment identiek aan die van GenBank (GenBank Nr. NM_016215.3). Kanamycine /neomycine-resistente kolonies werden geselecteerd en de sequentie bevestigd door restrictiedigestie en DNA-sequentie. Alle primers werden ontworpen en gesynthetiseerd door Genepharma (Shanghai, China).

Stabiele Transfectie en G418 selectie

Om een ​​EGFL7-underexpressing kloon (en passende controle) vast te stellen, BGC823 cellen werden gezaaid in zes -well kweekplaten bij 1 x 10 ^{6 /putje en gedurende 24 h in RPMI 1640 medium dat 10% FBS in een bevochtigde 5% CO _{2 atmosfeer bij 37 ° C. De cellen werden getransfecteerd met 4 ug pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1, pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA2, pGPU6 /GFP /Neo-aspecifieke-shRNA of pGPU6 /GFP /Neo-GAPDH-shRNA gebruik van Lipofectamine 2000 transfectie reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Na 24 uur werden de cellen geïncubeerd in G418 (Sigma, USA, 600 ug /ml) voor de eerste selectie, verdund uitgeplaat bij lage dichtheid (-1 cellen /putje) en aangehouden in kweekmedium aangevuld met G418 aan de helft van de voorselectie concentratie gedurende nog 3 weken. De resulterende stabiele cellijnen werden genoemd BGC2-13 (cellijn als gevolg van pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 stabiele transfectie) en BGC-NC, en uitgebreid voor verdere studies. Het expressieniveau van EGFL7 werd geëvalueerd door Western blot en real-time RT-PCR. Om een ​​overexpressie lijn en gematchte controlegroep vast te stellen, MKN28 cellen werden gezaaid, getransfecteerd met 4 ug van PEX-2-EGFL7 of pEX-2 plasmiden, en geselecteerd zoals beschreven voor BGC823 cellen behalve dat 500 ug /ml G418 werd gebruikt voor de eerste selectie. De resulterende stabiele cellijnen werden genoemd MKN28-EGFL7 en MKN28-NC. De expressieniveaus van EGFL7 in G418-resistente klonen werden geëvalueerd door Western blot en kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR).}}

Western blotanalyse

Na cellen bereikten 80% -95% confluentie totaal eiwit werd geëxtraheerd door gebruik cellysaat extractiebuffer (Beyotime, China) bevattende proteaseremmers (1 mM fenylmethylsulfonylfluoride). Lysaat totale eiwitconcentratie werd bepaald met een bicinchoninezuur eiwit assay kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Gelijke hoeveelheden eiwit (25 ug) uit elke behandelingsgroep werden per gellaan gescheiden door 8% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) en overgebracht op polyvinylideen (PVDF) membranen (Millipore, Billerica, USA). De membranen werden achtereenvolgens geïncubeerd met blokkerende buffer bestaande uit Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) bevattende 5% niet vette droge melk gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en vervolgens overnacht bij 4 ° C in dezelfde buffer met een van de volgende primaire antilichamen: anti EGFL7 (1:500; Abcam Cambridge Science, UK). anti-E-cadherine, anti-vimentine, anti-Snail (alles in 1:1000, Cell Signaling Technology, CST, USA), anti-GAPDH (1:10000, Protech), anti-EGFR, anti-fosfo-EGFR, anti-AKT, anti- fosfo-AKT, anti-ERK en anti-fosfo-ERK (alle 1:800, Abou Biotech Co., Ltd., USA). Immunolabeled membranen werden vervolgens geïncubeerd met een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (1:2000, Immunology Laboratory Consultants, Inc., USA) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Na wassen met TBST werden de eiwitbanden zichtbaar gemaakt met behulp van de versterkte chemiluminescentie detectiesysteem (Advansta Corporation, Menlo Park, California, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Expressie van GAPDH werd gebruikt als een laad controle en eiwitten gekwantificeerd met behulp van UTHSCSA Image Tool 3.0. Doeleiwitexpressie werd berekend als de band intensiteit verhouding van de doeleiwit te GAPDH.

RNA-extractie en PCR-analyse

De cellen werden gelyseerd in TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en totaal RNA werd bereid volgens de instructies van de fabrikant. Eerst stam cDNA's werden gesynthetiseerd door PrimeScript RT reagens kit met gDNA Eraser (Takara, Otsu, Japan) en geamplificeerd door PCR met de volgende primers: EGFL7 sense, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; antisense, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '. Het cDNA van GAPDH werd geamplificeerd om te controleren voor de hoeveelheid cDNA in elk monster (sense 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; antisense, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'). PCR-amplificatie werd uitgevoerd bij 94 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 ° C gedurende 30 s, 57 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 40 s. PCR producten werden gescheiden op 1,0% agarosegels en doelwitgenexpressie gekwantificeerd als de verhouding van het doelwitgen bandintensiteit met die van GAPDH middels Image Tool 3,0 (The University of Texas Health Science Center, San Antonio, Texas, USA).

Real-time PCR

Het reactiemengsel real-time PCR bestond uit 10 ui Premix Ex Taq (Probe qPCR), 0,2 pM van elke primer EGFL7 en GAPDH (hieronder), 0,2 pmol /ml TaqMan sondes (EGFL7 of GAPDH), en 0,4 pl ROX (tetrapropano-6-carboxyrhodamine) Reference Dye II (Takara Bio, Shiga, Japan). Het mengsel werd met 2 pi cDNA in elk putje van een 96-well plaat MICROAMP (Applied Biosystems, CA, USA) en gedestilleerd water werd gebruikt om aan te passen tot een eindvolume van 20 pl. De volgende primers werden ontworpen met behulp van de Primer Premier 6.0 Pakket (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA): EGFL7: forward, 5'- GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; omgekeerd, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '; GAPDH: vooruit, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; omgekeerd, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. Alle reacties werden uitgevoerd op een 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA). Thermocyclus omstandigheden waren initiële denaturatie bij 95,8 ° C gedurende 30 s, gevolgd door 40 amplificatiecycli bij 95,8 ° C gedurende 6 s en 60,8 ° C gedurende 30 s.

Soortgelijke experimentele omstandigheden werden gebruikt om de expressie van andere beoordelen genen met de volgende primers: E-cadherine: forward, 5'- GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3 '; omgekeerd, 5'-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; vimentine: vooruit, 5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3 '; omgekeerd, 5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3 '; Slak: vooruit, 5'-TGCTCCACAAGCACCAAGA-3 '; omgekeerd, 5'-GCAGAGGACACAGAACCAGAAA-3 '; GAPDH: vooruit, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; omgekeerd, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. Het reactiemengsel real-time PCR bestond uit 10 ui SYBR Premix Ex TaqTM II, 1,6 pl van elke primer (0,4 uM), 0,4 ui ROX Reference Dye, 2 pl matrijs cDNA en 6 ui diethylpyrocarbonaat behandeld water. Real-time PCR werd uitgevoerd op een 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) met de volgende thermocyclus omstandigheden: initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 10 s, gevolgd door 40 cycli van amplificatie bij 95 ° C gedurende 5 s en 60 ° C gedurende 34 s.

Cell Proliferation Assay

celproliferatie werd geschat door het 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5- difenyltetrazoliumbromide (MTT) bepaling van levensvatbare cellen. Cellen werden uitgeplaat op 96-well platen met 2000 /putje en gedurende 12, 24, 48, 72 en 96 h. Vervolgens werd 20 ul MTT (Sigma) voorraadoplossing (5 mg /ml) aan 200 ul medium in elk putje toegevoegd en platen werden gedurende nog eens 4 uur bij 37 ° C. Na zorgvuldige afzuiging van het kweekmedium, werd 150 gl dimethylsulfoxide (DMSO) aan elk putje toegevoegd formazan kristallen gevormd uit MTT door levensvatbare cellen ontbinden. De platen werden geschud op een roterende platform 10 minuten en de absorptie gemeten bij 490 nm met behulp van een microplaat-afleesinrichting.

Plaat Kolonie Formatie Assay

De cellen werden geënt bij 200 /putje in dezelfde zes- putjesplaten zoals gebruikt voor andere testen om kolonievorming te analyseren onder cel-hechtende omstandigheden. Na 10 dagen werden de cellen gekleurd met 1% Giemsa, en het aantal zichtbare kolonies werd geteld. De relatieve kloon formatie-index werd berekend als gemiddelde aantal kolonies /aantal gezaaide cellen x 100%.

Scratch wondgenezing Testen

Om celmigratie assay, 5 x 10 ^{5 cellen /putje werden uitgeplaat in platen met zes putjes bekleed met 10 ug /ml fibronectine (FN) en geïncubeerd gedurende 24 uur. De monolaag werd dan verstoord door een enkele kras met behulp van een 200 ul pipetpunt. Micrografische werden verkregen bij 0, 12, 24, 36, 48, en 72 uur na het begin van een fase-contrast microscoop (Olympus BX51, Japan). Het aantal cellen in de krassen (kale) gebied van de microputjes werd geteld in vijf velden (vergroting: x 200). Alle experimenten werden uitgevoerd in tweevoud.}

In vitro
Invasion en Migratie Assay

Mobiele invasie en migratie werden geëvalueerd met behulp van transwell kamers (Corning, New York, USA). Invasie-assays werden uitgevoerd in transwell kamers gescheiden door polycarbonaat membraanfilter inzetstukken (8 urn poriën) voor 24-well platen. Elke kamer werd bekleed met 100 pl 1:20 Matrigel (Becton, Dickinson and Company, New York, USA) in koud RPMI 1640 nacht bij 4 ° C. Vervolgens cellen (5 x 10 ^{4 /ml × 200 ui) werden gezaaid in de bovenste kamer in serumvrij medium. Ongeveer 800 pl medium geconditioneerd met 10 ug /ml fibronectine werd in het onderste compartiment van de transwell kamer als een chemoattractant. Na incubatie gedurende 24 uur bij 37 ° C werden de resterende tumorcellen op het bovenvlak van de kamer verwijderd door deze af met natte wattenstaafjes. Binnenvallende cellen op het onderoppervlak werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde, gekleurd met kristalviolet en geteld onder een fasecontrast microscoop (Olympus, Japan) en 200 x. Vier onafhankelijke experimenten werden uitgevoerd in drievoud voor behandelingsomstandigheden. In vitro
migratie assays werden uitgevoerd onder dezelfde omstandigheden als de invasie assays, maar onbeklede onderste kamers en middels 1 x 10 5 cellen /ml (200 pi).}

anoikis assay

poly-hydroxyethylmethacrylaat (poly-HEMA, Sigma-Aldrich), die celadhesie remt op kweekplaten en andere groeioppervlakken, werd opgelost in 95% ethanol tot een eindconcentratie van 12 mg /ml. Poly-HEMA-beklede platen, 2 ml van deze oplossing werd aan elk putje van een 6-well plaat toegevoegd en men liet een nacht drogen onder een laminaire stroming weefselkweek kap bereiden. Vervolgens werden 5 x 10 ^{4 cellen uitgeplaat in drievoud in elke poly-HEMA gecoate goed met regelmatige cultuur media. Na 24 uur werden GC cellen geoogst, gewassen met PBS en geresuspendeerd in 500 ul bindingsbuffer uit een Annexine V-PE /7-AAD Apoptosis Detection Kit (eBioscience, San Diego, USA). Geresuspendeerde cellen van elk monster werden in porties (100 ui) in vier buisjes. Drie buizen werden gemerkt met hetzij Annexine V-PE, 7-AAD, of beide, terwijl de vierde werd gebruikt als ongelabelde controle. Elke lading werd daarna geanalyseerd met stroomcytometrie op een Beckman Coulter teller FC 500 (Beckman Coulter). Het percentage apoptotische cellen werd verkregen als de som van celfracties weergeven vroege apoptose (annexine V-positief) en late apoptose (7-AAD-positief).}

Naakt xenograft muismodel

Xenografting GC cellijnen werd uitgevoerd in overeenstemming met de nationale richtlijnen voor de zorg en het gebruik van proefdieren (publicatie nr. 86-23, herzien 1985), werd goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de Derde Xiangya Hospital, Centraal Zuid-Universiteit ( LLSc [LA] 2013-0010), en in overeenstemming met de huidige Chinese wet inzake de bescherming van dieren (LLSc [LA] 2013-0010). Alle inspanningen werden geleverd om het aantal gebruikte muizen en hun lijden te minimaliseren.

Vijfendertig vrouwelijke Balb /c naakt muizen leeftijd van 4 tot 6 weken werden gekocht bij SLAC Laboratory Animal Co., Ltd (Shanghai, China) en ondergebracht in individueel geventileerde kooien. De muizen werden willekeurig verdeeld in BGC823, BGC-NC, BGC2-13, MKN28, MKN28-NC, MKN28-EGFL7, en de controle PBS groepen (n = 5 muizen /groep). Gekweekte cellen werden geoogst en opnieuw gesuspendeerd in PBS bij 1 x 10 ^{8 cellen /0,2 ml. De suspensie werd subcutaan geïnjecteerd in de linker bovenste uiteinde van elke naakt muis behalve die in de controlegroep die waren geïnjecteerd met 0,2 ml PBS. De tumorgroei werd elke 3 dagen geëvalueerd door het meten van tumor diameters met Vernier calipers. Tumor volume (TV) werd berekend volgens de formule: TV (mm 3) = d 2 x D /2, waarbij d en D zijn de kortste en de langste diameters resp. De muizen werden gedood op 4 weken na implantatie cellen en de tumoren werden verwijderd en gewogen. Alle levers werden onderzocht op metastase door hematoxyline en eosine (H &E) kleuring. Tumoren werden gefixeerd in 10% formaline, ingebed in paraffine en in 4 urn dikke coupes. EGFL7 expressie werd bepaald door immunohistochemie zoals hierboven beschreven.}

Statistische Analyses

Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS versie 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) voor Windows. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking (SD) van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Groep middelen werden vergeleken door one-way variantie-analyse (ANOVA) met Student-Newman-Keuls (SNK) of minst significant verschil (LSD) tests voor post hoc paarsgewijze vergelijkingen. De correlatiecoëfficiënt Spearman werd gebruikt om de correlaties tussen EGFL7 en EMT-gerelateerde proteïne expressieniveaus in chirurgisch uitgesneden maagkanker weefsels te bepalen. Een P Restaurant < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant

Resultaten

EGFL7 Expressie werd verhoogd in Human Gastric Cancer Cell Lines

Western blot en RT-. PCR werd uitgevoerd om te vergelijken EGFL7 expressie in de humane cellijnen GC SGC7901, BGC823, MKN45 en MKN28 dat in normale maagslijmvlies epitheliale GES-1 cellen. Verhoogde EGFL7 bleken alle vier GC cellijnen vergeleken met GES-1, met BGC823 en MKN28 tonen de hoogste en laagste EGFL7 expressie respectievelijk zowel eiwit als mRNA niveaus (Figuren 1A en 1B). Daarom BGC823 en MKN28 werden in daaropvolgende experimenten om de effecten van EGFL7 uitdrukking op proliferatie, migratie en metastatisch potentieel te beoordelen. We gebruikten een stabiele shRNA transfectie om EGFL7 expressie onderdrukken in BGC823 cellen en ontwierp een mens EGFL7 high-expressieplasmide (pEX-2-EGFL7) naar EGFL7 expressie in MKN28 cellen te verhogen.

Wij geconstrueerd twee shRNA plasmidevectoren targeting EGFL7 mRNA en uitgevoerd qRT-PCR om de werkzaamheid van deze kandidaat-shRNA sequenties EGFL7 onderdrukken in vergelijking met niet-specifieke sequenties te evalueren. De shRNA1 en shRNA2 sequenties bereikt 75% en 30% remming van EGFL7 respectievelijk (figuur 1C), zodat de efficiëntere shRNA1 werd bij alle volgende experimenten. De BGC823 lijnen stabiel getransfecteerd met pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 of pGPU6 /GFP /Neo-aspecifieke-shRNA werden aangeduid BGC2-13 en BGC-NC, respectievelijk. De MKN28 lijnen stabiel getransfecteerd met pEX-2-EGFL7 en pEX-2-aspecifieke werden aangeduid MKN28-EGFL7 en MKN28-NC, respectievelijk. De expressieniveaus van EGFL7 eiwit en mRNA in G418-resistente klonen werden ook beoordeeld door Western blot (figuur 1D) en real-time RT-PCR (figuur 1E). De resultaten toonden duidelijk verminderd EGFL7 expressie in BGC2-13 cellen ten opzichte van BGC-NC-cellen en significant verhoogde expressie in MKN28-EGFL7 cellen in vergelijking met MKN28-NC-cellen (alle P Restaurant < 0,05). Er waren geen significante verschillen in mRNA en eiwitexpressie tussen BGC-NC en BGC cellen of tussen MKN28-NC en MKN28 cellen (alle P Restaurant > 0,05).

EGFL7 Promoted GC Cell Invasion en migratie, maar had geen invloed GC Cell Proliferation

Om de rol van EGFL7 in GC progressie te onderzoeken, onderzochten we eerst of EGFL7 silencing of overexpressie veranderde de proliferatie, invasieve en trekkende capaciteiten van GC cellen. Kras wondgenezing werd gebruikt om migratie van stabiel getransfecteerde cellen te meten. Een wond was generated in GC celmonolagen door een enkele kras en het aantal cellen in de kras zone vergeleken bij 0 en 48 uur. Sluiting van de wond was beduidend langzamer in BGC2-13 culturen (underexpressing EGFL7) in vergelijking met autochtone BGC823 en BGC-NC culturen (32% vs.
100% en 98%, zowel P
< 0,05) (Figuur 2A). In tegenstelling tot sluiting was aanzienlijk sneller in MKN28-EGFL7 culturen (overexpressie EGFL7) in vergelijking met MKN28 en MKN28-NC culturen (99% vs.
49% en 50%, zowel P
<0,05) (Figuur 2B). Bovendien wond dichter bij het enige tijd na de scratch (48 uur) was groter in high-EGFL7 uitdrukken wild type BGC823 cellen in vergelijking met lage expressie wild type MKN28 cellen, wat aangeeft dat de endogene expressie niveaus van invloed zijn ook migratie.

Transwell assays werden uitgevoerd om deze bevindingen te bevestigen en het effect van EGFL7 op de invasieve potentie van cellen BGC823, MKN28 cellen en de respectieve stabiele expressie lijnen in Matrigel verder te onderzoeken. Er waren significant minder EGFL7-underexpressing (BGC2-13) cellen in de Matrigel opzichte van BGC-NC en BGC823 cellen (25 ± 3,1 vs
76 ± 2,9 en 79 ± 5,7 cellen /putje;. Allebei P Restaurant < 0,05), wat aangeeft dat EGFL7 onderexpressie significant verminderd invasief vermogen (figuur 2C). Ook werd het aantal BGC2-13 cellen bereiken van de onderste Matrigel-vrij goed in transwell migratie assays aanzienlijk verminderd in vergelijking met BGC823 en BGC-NC-cellen (19 ± 1,1 vs.
53 ± 2,9 en 54 ± 2.6 , zowel P Restaurant < 0,05) (figuur 2C). In tegenstelling EGFL7 overexpressie in MKN28 cellen aanzienlijk verbeterd zowel invasie in Matrigel (MKN28-EGFL7: 79 ± 6.19 cellen /putje, MKN28-NC: 40 ± 2.00 cellen /putje, MKN28: 41 ± 4.22; zowel P
< 0,05; figuur 2D) en migratie (MKN28-EGFL7: 67 ± 4.16, MKN28-NC: 33 ± 5,92, MKN28: 35 ± 3,7; zowel P Restaurant < 0,05; figuur 2D). Wu et al.

• PLoS ONE: Een 346 geval Analyse voor laparoscopische Milt-Behoud No.10 lymfeklierdissectie voor Proximale maagkanker: A Single Center Study
• PLoS ONE: Overexpressie van Nucleaire apoptose-inducerende factor 1 Veranderde het proteomische profiel van de Cel Human maagkanker MKN45 en geïnduceerde celcyclus in G1 /S fase