PLoS ONE: epidermalni faktor rasta nalik domene koje sadrže protein 7 (EGFL7) Poboljšava EGF receptor-Akt signalizacije, epitelne-mczcnhimnog tranziciji, i metastaziranja raka želuca Cells

Sažetak pregled

epidermalni faktor rasta nalik domene -containing proteina 7 (EGFL7) je reguliran u ljudskim epitelnim tumorima i tako je potencijalni biomarker za malignosti. Doista, prethodne studije su pokazale da je visoka EGFL7 izraz potiče infiltraciju i metastaza želučanog karcinoma. Prijelaz epitelnog-mezenhimalne (EMT) inicira metastaza kaskadu i daruje stanice raka s invazivnom i migracijskog svojstvu; međutim, nije poznato je li EGFL7 promiče metastaziranje pokreće EMT. otkrili smo da EGFL7 je izraženo u višestrukim ljudskim karcinoma želuca (GC) stanične linije i da pojačana ekspresija promovira staničnu invaziju i migraciju kao što je otkriveno od ogrebotina rana i transjažična migracija testovima. S druge strane, shRNA posredovane EGFL7 obaranje smanjenu invaziju i migraciju. Nadalje, EGFL7-prekomjernom ekspresijom stanice narastu u veće tumore i bili su više vjerojatno da metastaziraju u jetru u odnosu na underexpressing CG stanice slijedeći potkožnom injekcijom u miševa. EGFL7 prekomjerna ekspresija zaštićena GC stanične linije protiv anoikis, pružajući uvjerljivi mehanizam za ovaj poboljšane metastatskim kapaciteta. U izoliranih humanih gastričnih tumora, ekspresija EGFL7 pozitivno koreliraju s razinama ekspresije marker mezenhimalnih vimentin i EMT povezana transkripcije represor puž, i negativnoj korelaciji s ekspresijom epitelne stanice marker E-kadherina. U staničnim linijama GC, EGFL7 obaranje obrnuto morfološke znakove EMT i smanjen kako vimentin i puževa izraz. Osim toga, EGFL7 prekomjerna ekspresija promovirao EGF receptor (EGFR) i protein kinaze B (AKT) fosfo-aktivaciju, učinci znatno potisnute od strane inhibitora kinaze EGFR tirozin AG1478. Štoviše, AG1478 također smanjuje povišen invazivnu i migracijski kapaciteta GC stanicama ekspresijom EGFL7. Zajedno, ovi rezultati snažno sugeriraju da EGFL7 promiče metastaza aktiviranjem EMT kroz EGFR-AKT-puž signalnog puta. Poremećaj EGFL7-EGFR-AKT-puž signalizacije može obećavajuća terapijska strategija za rak želuca pregled

Izvor. Luo B-H, Xiong F, Wang J-P, Li J-H, Zhong M, Liu Q-L, i sur. (2014), epidermalni faktor rasta-sličnu domenu koja sadržava protein 7 (EGFL7) povećava EGF receptor-Akt signalizacije, epitela-mezenhimalnog tranziciji i metastaziranje stanica raka želuca. PLoS ONE 9 (6): e99922. doi: 10,1371 /journal.pone.0099922 pregled

Urednik: Claudia D. Andl, Vanderbilt University, Sjedinjene Američke Države Netlogu

Primljeno: 15. studeni 2013; Prihvaćeno: 19. svibnja 2014; Objavljeno: 19. lipnja 2014 pregled

Copyright: © 2014 Luo et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (br 81001080) i otvorenog fonda za vrijednu i preciznih instrumenata Srednje Južne Sveučilišta (br JJ3121). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca (GC) je četvrti najčešći maligni tumor i drugi vodeći uzrok smrtnosti od raka povezanih svijetu [1], [2]. Otprilike polovica svih GC slučajeva se javljaju u istočno-azijskih zemalja, s posebno visokim incidenata u Japanu, Koreji i Kini [3], [4]. Napredak u sistemsko liječenje GC uvelike povećao kratkoročno preživljavanje; Međutim, pet godina stopa preživljavanja GC pacijenata i dalje je niska, zbog recidiva i metastaza [5]. Štoviše, većina novodijagnosticiranih GC pacijenti već pokazuju metastatske bolesti, što predstavlja glavni izazov za terapijsku oncologists [6]. Pregled

epidermalni faktor rasta, kao što su protein domenom koja sadrži 7 (EGFL7), također poznat kao endotela krvnih žila statin je endotelnih stanica-izvedeni luči faktor koji regulira stvaranje krvnih žila cijevi. Parker et al. [7] su pokazali da EGFL7 je presudno za angiogeneze u zebrica embriogeneze [8]. Novije studije su izvijestili povišenu ekspresiju EGFL7 u nekoliko tumora i staničnih linija raka, uključujući rak bubrega tumora, maligni gliomi, hepatocelularnim karcinomom i debelog crijeva [7] - [10]. Mi smo ranije pokazali da EGFL7 je također izraženo u želučanom karcinomu [11], a izražavanje bilo značajno povezano s patološkim osobinama, kliničke progresije, lošom prognozom i metastaza [10], [12]. Dakle, EGFL7 je kandidat prediktivni faktor za napredovanje karcinoma i metastaza. Međutim, mehanizmi koji su podloga tumorogene učinke EGFL7 nejasni. Pregled

metastaziranje je proces od više koraka, koji uključuje prijelaz epitela-mezenhimalnih (EMT), u kojoj polarizirana epitelnih stanica su pretvoreni u mezenhimske stanice [13], fenotipa s većom invazivnog i migracijskih kapaciteta [14]. EMT je i reverzibilan proces koji se često pojavljuje na invazivne ispred mnogih metastatskog raka [15]. Nekoliko je studija pokazalo da EGF potiče migraciju stanica raka i invaziji istodobno s aktivacijom EMT [16] - [18]. Značajno je EGFL7 sadrži dvije EGF-slične domene, što upućuje na neke funkcionalne homologije [9], [12]. Međutim, da li EGFL7 zapravo radi poboljšati EMT i promicanje raka želuca metastaza još treba utvrditi. Štoviše, molekularni mehanizmi kojima je regulirano EMT u GC i dalje u velikoj mjeri nepoznanica. Cink prst transkripcijski represor puž je kritična za ekspresiju gena koji reprogramiranju tijekom EMT, osobito za represiju međustanična adhezija protein endotela (E) -cadherin, gubitak koji se smatra važan rani događaj u EMT i potrebne za buduću metastazu [ ,,,0],19]. pregled

Ovo je istraživanje imalo bi se utvrdilo da li EGFL7 promiče metastaziranje pokreće EMT. Otkrili smo da EGFL7 pojačana ekspresija aktivira EGFR-AKT put, izaziva EMT, te promiče invaziju GC stanica In vitro pregled i metastaze in vivo pregled. pregled

Materijali i metode

Pacijenti i sakupljanje tkiva pregled

Želučani tkiva karcinoma dobiveni su iz 79 GC bolesnika (58 muškaraca i 21 žena) liječenih kirurške resekcije na Odjelu za kirurgiju Xiangya bolnice, Južna Sveučilišta Central (Kina). Operacije su provedene od siječnja 2010. do prosinca 2012. godine pacijenti su bili 54,7 godina u prosjeku (raspon: od 28 do 82 godina). I nije primila niti kemoterapije, niti zračenje prije operacije pregled

Pacijenti su obaviješteni da kirurški primjerci bi upotrijebiti za konvencionalne patološku dijagnozu i da preostali tkiva mogu se koristiti za istraživanje. Nema osobnih podataka Pacijent je potrebno za ove studije i protokoli provesti bez rizika, tako da samo verbalno informirani pristanak traži od pacijenata. Protokol je odobren od strane Etičkog komiteta Xiangya bolnice, Južna Sveučilišta Central (broj dozvole: 201311389). Pregled

stadija bolesti definirana je prema šestom izdanju TNM sustavu Zajedničkog odbora američkog protiv raka [ ,,,0],20], [21]. Tumori su dobro diferencirani želučane adenokarcinom u 12 slučajeva, umjereno diferencirani u 34 slučajeva, a slabo diferencirani u 33 slučajeva. Svi uzorci su odmah fiksirane s 10% formalinu, dehidriran i prevučeni parafinom. Točno klinički podaci i patološka dijagnoza bila dostupna za sve pacijente. Pregled

Imunohistokem pregled

Za imunohistokemijski, pripremljeni uzorci su inkubirani na 60 ° C tijekom 15 sati i izrezati na 4 um-debljim dijelovima, deparafmizirane u terpentin, osušena i rehidrirane kod etanola smanjuje: destilirana gradijentom voda. Aktivnost endogene peroksidaze bila inaktivira inkubacijom 30 minuta u 0,3% vodikovog peroksida u 0,01 M fosfatnog pufera (PBS). Odresci su zatim inkubirane tijekom 15-20 min u citratnom puferu (pH 6,0) na 95 ° C za dohvat antigena, blokirani s 5% normalnom kozjem serumu u 0.01 M PBS tijekom 15 minuta na 37 ° C, i inkubirani sa primarnim antitijelima razrijeđenim u otopine za blokiranje preko noći na 4 ° C u vlažnoj komori. Korišteni su slijedeći Primarna antitijela: mišji anti-EGFL7 monoklonalno antitijelo (Abcam, USA, 1:400) i zeca monoklonska antitijela koja su nastala protiv E-kadherina (CST, USA, 1:1000), vimentin (CST, USA, 1:1000 ), puž (Proteintech, SAD, 1:1000) i CD34 (Boster, Kina, 1:500). Nakon ispiranja, uzorci su inkubirani s biotiniliranim sukcesivno sekundarno antitijelo i streptavidin peroksidaze hrena (HRP) avidin radne otopine. Imuno vizualizira pomoću kompleta DAB supstrat od Zhongshan Golden Bridge Company (Kina), u skladu s preporukama proizvođača. Na kraju, sekcije su prebrojane s hematoksilinom (Vector Laboratories, SAD), dehidrirana u uzlaznoj etanola: destiliranom gradijent vode i montirati na slajdove pomoću pokrovnim staklom za montiranje medija (Fisher Scientific, USA) pregled

Kvantifikacija su imunohistokemijski signala. pregled

Sve GC i okolnim ne-maligne želučani tkiva su potvrđene patohistološki dva neovisna patologa (K.-JZ i J-HL) slijepe na izvornu dijagnozu. Imunološko je ocijenjena od strane polu-kvantitativna metoda koja smatra kako intenzitet i distribuciju bojanja [22]. Ukratko, pet polja su nasumično odabrani pod malim povećanjem (100 ×, Olympus BX51, Tokyo, Japan), a 200 tumorske stanice se računa iz svakog područja. Intenzitet bojenja je postignuto na slijedeći način: 0, nema bojanja; 1, slabo žuto obojenje; 2, žuta obojenost; 3, smeđe obojenje. Pozitivne stanice su obilježena jasnom granice i žute ili smeđe mrlja razlikuje od pozadine. Postotak pozitivnih stanica (PP) ocijenjena je kao što slijedi: 0, 0%; 1, 1% -25%; 2, 26% -50%; 3, 51% -75%; 4, 76% -100%. Dva rezultati su kombinirani da bi se dobio sljedeći klasifikacija: negativni bojenje, uzorci imunoreaktivnog rezultatom (IRS) od 0 do 2; slabo pozitivno bojenje, uzorci s IRS od 3 do 5; jako pozitivno bojenje, uzorci s IRS od 6 do 7. Uzorci koji su pokazali slabo i jako pozitivno bojenje bili uključeni u statističku analizu. pregled

staničnih linija i kultura pregled

Ljudski GC stanične linije SGC7901 (umjereno diferencirani adenokarcinom), BGC823 (slabo diferencirani adenokarcinom), MKN28 (dobro diferencirani adenokarcinom) i MKN45 (slabo diferencirani adenokarcinom) kao i normalni želučane sluznice epitela GES-1 stanice su kupljeni od Type Culture Collection kineske akademije znanosti (Shanghai, Kina). Sve stanice su kultivirane, a održava se u Roswell Memorial Institute Park (RPMI) 1640 medija (Gibco Biocult, Paisley, UK) koji je sadržavao 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Gibco Biotechnology), 100 U /ml penicilina i 100 ug /ml streptomicina na 37 ° C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5% CO _{2. pregled}

Kratak ukosnica RNA (shRNA) i rekombinantni plazmida ekspresije Pex-2-EGFL7 pregled

stvoriti stanične linije nadekspresijom ili underexpressing EGFL7, native stanične linije stabilno su transficirane s ekspresijskim vektorom ili ciljano shRNA. U shRNA sekvence ljudskog EGFL7 su dizajnirani prema ljudskom EGFL7 DNA sekvence (GenBank NO NM_016215.3.) Od strane Designer 3.0 softvera (Genepharma, http://www.genepharma.com) i eksplozije pretraživanja (http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Ciljne sekvence su uspoređene s bazom podataka ljudskog genoma pomoću BLAST pretraživanje kako bi se osigurao visoki stupanj homologije s drugim kodne sekvence. Sekvence EGFL7-homo-333 i EGFL7-homo-887 su identificirani kao ciljnim mjestima za određenu EGFL7 shRNA. Osim toga, jedan nespecifičan slijed (otimati shRNA) je osmišljen kao negativna kontrola, a GAPDH slijed je osmišljen kao interna kontrola. Su shRNA sekvence su kako slijedi:

EGFL7-shRNA1 protiv EGFL7-homo-333: smislu, 5'-CACCGGTGCTGCTGATGTGGCTTTCAAGAGAAGCCACATCAGCAGCACCTTTTTTG-3 '; antisens 5'-GATCCAAAAAAGGTGCTGCTGATGTGGCTTCTCTTGAAAGCCACATCAGCAGCACC-3 '; EGFL7-shRNA2 protiv EGFL7-homo-887.: razum, 5'-CACCGAGTGGACAGTGCAATGAATTCAAGAGATTCATTGCACTGTCCACTCTTTTTTG-3 '; antisens 5'-GATCCAAAAAAGAGTGGACAGTGCAATGAATCTCTTGAATTCATTGCACTGTCCACTC-3 '; nespecifična smisla, 5'-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3 '; antisens 5'-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3 '; GAPDH smisla, 5'-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3 '; antisens 5'-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3 '. PGPU6 /GFP /neo (zeleni fluorescentni protein, neomicin) vektor (Genepharma Company, Shanghai, Kina) je korišten za izgradnju plazmida. Nukleotidi se poveća otpornost i umetnuti u BamHI i HindIII mjesta i transformiran u DH5a kompetentnim E. coli. Dvojni kanamicin /neomicin-otporne kolonije su odabrani i vektor sekvencije potvrđena je ograničenom probavom i sekvenciranjem DNK.

EGFL7 cDNA koja kodira slijed aminokiselina 533-1353 je subkloniran u pEX-2 plazmid vektor (Genepharma, Shanghai, Kina) koje BglIl /EcoRI bračnim probavu i označen pEX-2-EGFL7. Rekombinantni plazmid je pojačan u DH5a-kompetentne E. coli i vektor sekvenci amplificira PCR-om. Sekvenciranje DNA potvrdilo je da je rekombinantni plazmid sadržavao gen fragment EGFL7 identičan onom u GenBank (GenBank NO. NM_016215.3). Kanamicin /neomicin-otporne kolonije su odabrani i sekvenca potvrđena je ograničenom probavom i sekvenciranjem DNK. Svi primeri su dizajnirani i sintetizirani Genepharma (Shanghai, Kina). Pregled

Stabilno Transformacija i G418 Izbor pregled

Kako osnovati EGFL7-underexpressing klon (i odgovarajuću kontrolu), BGC823 stanice su posađene u šest pa ploče kulture u 1 × 10 ^{6 /jažica i inkubirane 24 sata u RPMI 1640 mediju koji sadrži 10% FBS u vlažnom 5% CO _{2 atmosfera održava se na 37 ° C. Stanice su transficirane s 4 ug pGPU6 /GFP /neo-EGFL7-shRNA1, pGPU6 /GFP /neo-EGFL7-shRNA2, pGPU6 /GFP /neo nespecifične-shRNA ili pGPU6 /GFP /neo-GAPDH-shRNA korištenjem LipofectAMINE 2000 transfekcijski reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) prema uputama proizvođača. Nakon 24 sata, stanice su inkubirane u G418 (Sigma, SAD, 600 ug /ml) za početne selekcije, razrijeđena, nanesene na niske gustoće (~1 stanica /jažici) i održava se u mediju za kulturu uz dodatak G418 na pola početne koncentracije selekcijskog još 3 tjedna. Nastale stabilne stanične linije su ime BGC2-13 (stanična linija koja proizlazi iz pGPU6 /GFP /neo-EGFL7-shRNA1 stabilna transfekcija) i BGC-NC, i proširena za daljnje studije. Razina ekspresije EGFL7 ocijenjena je Western blot i u realnom vremenu RT-PCR. Uspostaviti s povećanom ekspresijom liniju i odgovarajućih kontrolnih, MKN28 stanice su posađene, transficirane sa 4 ug PEX-2-EGFL7 ili PEX-2 plazmida, a odabran je kao što je opisano za BGC823 stanica, osim što je 500 ug /ml G418 je bio korišten za početne selekcije. Nastale stabilne stanične linije su ime MKN28-EGFL7 i MKN28-NC. Razina ekspresije EGFL7 u Klonovi otporni prema G418 procijenjeni Western analizom i kvantitativnom realnom vremenu PCR (QRT-PCR). Pregled}}

Western blot analiza pregled

Nakon stanice dostigle 80% -95% ušće, ukupni proteini ekstrahiran pomoću ekstrakcije stanični lizat pufera (Beyotime Kina) koji sadrži inhibitor proteaze (1 mm temlmetilsultbnil fluorid). Lizat Ukupna koncentracija proteina je određena korištenjem bicinkroniničnoj testu kiselina protein kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Iste količine proteina (25 ug) iz svake grupe su razdvojeni na gelu traku od 8% natrij dodecil sulfat-poliakrilamid gel elektroforeze (SDS-PAGE), te prenese u polivinilidenfluorid (PVDF) membranu (Millipore, Billerica, USA). Membrane se postupno inkubirane s puferom za blokiranje koji se sastoji od Tris-puferiranoj slanoj otopini (TBS) koja sadrži 5% nemasnog suhog mlijeka 2 sata na sobnoj temperaturi, a zatim preko noći na 4 ° C u tom istom puferu s jednim od slijedećih primarnim antitijelima: anti EGFL7 (1:500; Abcam Cambridge Science, Velika Britanija). anti-E-kadherina, anti-vimentin, anti-puž (sve 1:1000, stanično signaliziranje tehnologije, CST, SAD), anti-GAPDH (1:10000, Protech), anti-EGFR, anti-fosfo-EGFR, anti-AKT, anti-fosfo-AKT, anti-ERK i anti-fosfo-ERK (sve 1:800, Anbo Biotech Co., Ltd, USA). Imuno Membrane se potom inkubiraju s HRP konjugiranih sekundarnih antitijela (1:2000, Immunology konzultanti Laboratory, Inc., USA) tijekom 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja s TBST, proteinske vrpce su vizualizirani pomoću poboljšane sustav detekcije chemiluminescence (Advansta Corporation, Menlo Park, California, USA) u skladu s uputama proizvođača. Ekspresija GAPDH je korišten kao kontrola za punjenje i proteina kvantificiran pomoću UTHSCSA slika alat 3.0. ekspresije ciljanog proteina je izračunat kao omjer intenziteta band ciljnog proteina GAPDH. pregled

RNA ekstrakciju i PCR analiza

Stanice su lizirane u Trizol reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i ukupna RNA je pripravljen u skladu s uputama proizvođača. Prvi deformacije cDNA sintetiziran je PrimeScript RT Kit reagensa s gDNA brisač (Takara, Otsu, Japan) i pojačati pomoću PCR korištenjem sljedećih specifičnih prajmera: EGFL7 osjetilne, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; antisens 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '. CDNA za GAPDH umnožena je za kontrolu za količinu cDNA prisutnoj u svakom uzorku (smislu, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 'antisens, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'). PCR amplifikacija je provedena na 94 ° C 5 min, a zatim 30 ciklusa od 94 ° C za 30 s, 57 ° C kroz 30 s, te 72 ° C tijekom 40 sekundi. PCR produkti su odvojeni na 1,0% agaroznom gelu i prepisivanja ciljnih gena kvantificirati kao omjer traci intenziteta ciljnih gena s onom GAPDH pomoću slika alat 3.0 (The University of Texas Health Science Center, San Antonio, Texas, USA).

realnom vremenu PCR pregled

Reakcijska smjesa stvarnom vremenu PCR se sastojao od 10 ul premiksa Ex Taq (Probe qPCR), 0.2 uM svakog EGFL7 i GAPDH (dolje) primera, 0.2 pmol /ml TaqMan probe (EGFL7 ili GAPDH) i 0,4 jal ROX (tetrapropano-6-carboxyrhodamine) Referentni Dye II (Takara Bio, Shiga, Japan). Smjesu se pomiješa s 2 ul cDNA u svaku jažicu 96-jažične ploče (MicroAmp Applied Biosystems, CA, USA) i destilirana voda je korištena da se prilagodi do konačnog volumena od 20 ul. Sljedeći primeri su dizajnirani pomoću Primer Premier 6,0 programski paket (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA): EGFL7: naprijed, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; natrag, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '; GAPDH: naprijed, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; natrag, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. Sve reakcije su izvedene na 7500 u realnom vremenu PCR System (Applied Biosystems, CA, USA). Thermocycle uvjeti bili su početna denaturacija na 95,8 ° C u trajanju od 30 sekundi, nakon čega slijedi 40 ciklusa pojačanja na 95,8 ° C kroz 6 sekundi i 60,8 ° C u trajanju od 30 s. Pregled

Slični eksperimentalni uvjeti su korišteni za procjenu ekspresije drugog geni sa sljedećim primera: E-kadherina: naprijed, 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3 '; natrag, 5'-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; vimentin: naprijed, 5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3 '; natrag, 5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3 '; Puž: naprijed, 5'-TGCTCCACAAGCACCAAGA-3 '; obrnuti, 5'-GCAGAGGACACAGAACCAGAAA-3 '; GAPDH: naprijed, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; natrag, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. Reakcijska smjesa real-time PCR se sastojao od 10 ul SYBR mješavina na Ex TaqTM II, 1,6 ul svakog primera (0,4 uM), 0,4 ul Rox Referentnog Dye, 2 ul predloška cDNA, i 6 ul dietil pirokarbonata tretirati voda. Realnom vremenu PCR je izvedena na 7500 u realnom vremenu PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) uz sljedeće uvjete thermocycle: početni denaturacije na 95 ° C za 10 s, a zatim 40 ciklusa pojačanja na 95 ° C tijekom 5 s i 60 ° C za 34 s. pregled

stanične proliferacije pregled

stanična proliferacija je procijenjena iz 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazolijeva bromida (MTT) test vitalnih stanica. Stanice su nasađene na ploče s 96 jažica pri 2000 /jažicu i kultivirane 12, 24, 48, 72 i 96 sati. Zatim se 20 ul otopine MTT (Sigma) dionicama (5 mg /ml) se doda u 200 ul medija u svaku jažicu, te su ploče inkubirane još 4 sata na 37 ° C. Nakon pažljivog usisavanja medija kulture, 150 ul dimetilsulfoksida (DMSO), je dodan u svaku jažicu za otapanje kristala formazana formirane s MTT od živih stanica. Ploče su potresivane na rotacijskom platformom za 10 minuta i Apsorbancija izmjerena pri 490 nm pomoću čitača mikroploče. Pregled

Plate Colony Formacija Ispitivanje

Stanice su posađene na 200 /jažici u istoj šestero- jažica koji su korišteni za druge analize za procjenu nastanak kolonija u stanične adhezije uvjetima. Nakon 10 dana, stanice su obojene s 1% Giemsa te se broje broj vidljivih kolonija. Indeks relativne formiranje klon je izračunata kao srednji broj kolonija /broj oplodili stanica × 100%.

Blok za zacjeljivanje rana Testovi

Za određivanje migracije stanica, 5 × 10 ^{5 stanice /jamici stavi se u pločicama sa šest jamica prevučene s 10 ug /ml fibronectin (FN) i inkubiraju 24 sata. Monosloj onda je poremećen od strane jednog nule pomoću pipete od 200 jal. Mikrografovi dobiveni su na 0 ° C, 12, 24, 36, 48, i 72 sata nakon ogrebotina fazno-kontrastnog mikroskopa (Olympus BX51, Japan). Broj stanica u izgreban (nerotkinja) regije u mikrotitarske se broje u pet područja (povećanje: × 200). Svi pokusi su provedeni u duplikatu. Pregled}

In vitro pregled invazija i migracije Test pregled

Cell invazija i migracija su procijenjene pomoću transjažičnih komora (Corning, New York, SAD). Invazija analize su provedene u transjažična komore odvojene polikarbonat membranski filter pločicama (8 um pore) za 24 jažica. Svaka komora je obložena sa 100 ul 1:20 Matrigel (Becton, Dickinson and Company, New York, SAD) u hladnoj RPMI 1640 noći na 4 ° C. Nakon toga, stanice (5 x 10 ^{4 /ml x 200 ul) stavljene su u gornjoj komori u mediju bez seruma. Približno 800 ul medija s 10 ug /ml fibronektina je smješten u donji odjeljak transjažice komoru kemoatraktant. Nakon inkubacije od 24 sata pri 37 ° C, a preostali tumorske stanice na gornjoj površini komore su uklonjeni brisanjem mokrim pamučnim briseva. Invazivnih stanica na donjoj strani su fiksirane s 4% paraformaldehidom, obojene s kristal violetom, a radioaktivnost ispod faze kontrastnog mikroskopa (Olympus, Japan) na × 200. Četiri neovisna eksperimenta u triplikatu za sve uvjete liječenja. In vitro pregled migracijske analize su provedene pod istim uvjetima kao i pokusima invazije, ali s nepresvučene niže komore, a upotrebom 1 × 10 5 stanica /mL (200 mL). Pregled}

Anoikis test pregled

poli-hidroksietil-metakrilat (HEMA poli-, Sigma-Aldrich), koji inhibira adheziju stanica na ploče za uzgoj kulture i drugih površina rasta, je stavljen u 95% etanolu do konačne koncentracije od 12 mg /ml. Za dobivanje poli-HEMA-obložene ploče, 2 ml ove otopine doda se u svaku jažicu na ploču s 6 jažica i ostavi da se osuši preko noći u kulturi tkiva laminaru. Zatim 5 × 10 ^{4 stanice su stavljene u triplikatu u svaku jažicu poli-HEMA obložene uobičajenog medija za kulturu. Nakon 24 sata, GC stanice su sakupljene, isprane u PBS i resuspendirane u 500 ul pufera za vezanje iz aneksina V-PE /7-AAD Apoptoza Detection Kit (eBioscience, San Diego, USA). Resuspendiranih stanica se od svakog uzorka se alikvotiraju (100 ul) u četiri cijevi. Tri epruvete označene su ili sa aneksin V-PE, 7-AAD, ili oboje, a četvrta je korišten kao neoznačene kontrolom. Svaka šarža je zatim analiziraju pomoću protočne citometrije na Beckman Coulter FC 500 brojaču (Beckman Coulter, Inc.). Postotak apoptotičnih stanica je izvedena kao zbroj frakcija stanica prikazuju rano apoptozu (aneksin V-pozitivne) i kasno apoptoze (7-AAD-pozitivan). Pregled}

ksenografta modelu golih miševa pregled

Xenografting GC staničnih linija provodi se u skladu s nacionalnim smjernicama za njegu i korištenje laboratorijskih životinja (publikacija br. 86-23, revidiran 1985.), bio je odobren od strane njega i uporaba odbora životinja Trećeg Xiangya bolnice, Central South University ( LLSC [LA] 2013-0010), te uskladiti s trenutnim Kineski zakon o zaštiti životinja (LLSC [LA] 2013-0010). učinjeni su napori kako bi se smanjio broj miševa koriste i njihove patnje. pregled

Trideset i pet BALB /c miševe dob 4-6 tjedan su kupljeni od SLAC laboratorijskih životinja Co. Ltd. (Shanghai, Kina) i smješteni u individualno ventiliranim kavezima. Miševi su bili podijeljeni u BGC823, BGC-NC, BGC2-13, MKN28, MKN28-NC, MKN28-EGFL7 i kontrolu PBS skupine (n = 5 miševa /grupi). Uzgojene stanice su sakupljene i resuspendirane u PBS u 1 × 10 ^{8 stanica /0,2 ml. Suspenzija se injektira subkutano u lijevi gornje ekstremitete svakog golih miševa, osim onih u kontrolnoj grupi, koja je dana injekcija s 0.2 ml PBS-a. Rast tumora je ocijenjena svaka 3 dana mjerenjem promjera tumora Vernierovim kaliperom. volumen tumora (TV) izračunata je prema formuli: TV (mm 3) = D 2 × D /2, gdje je D i D su najkraći i najduži promjeri, respektivno. Miševi su žrtvovani 4 tjedna nakon usađivanja stanica, a tumori su izvađeni i izvagani. Svi jetre ispitani su metastaziranje hematoksilinom i eozinom (H &E) obojenja. Tumori se fiksiraju u 10% formalinu, uklopljeno u parafin, i isiječe na 4 um-debela sekcija. EGFL7 bila je određena pomoću imunohistokemijski kao što je gore opisano. Pregled}

Statističke analize pregled

Sve statističke analize provedene su pomoću SPSS verzija 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) za Windows. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD) iz barem tri neovisna pokusa. sredstva grupe uspoređene su jednosmjernom analizom varijance (ANOVA) s Student-Newman-Keuls (SNK) ili barem značajna razlika (LSD) testova za post hoc par-mudar usporedbe. Spearman Rank Koeficijent korelacije je korištena za određivanje korelacije između EGFL7 i EMT-vezanih razina ekspresije proteina u kirurški izrezano želučanog tkiva raka. P izvoznici < 0,05 smatrana je statistički značajna pregled

Rezultati

EGFL7 Ekspresija je povišen u ljudskim karcinoma želuca staničnim linijama

Western blot i rt. PCR su izvedene za usporedbu EGFL7 izraz u ljudskim GC staničnim linijama SGC7901, BGC823, MKN45 i MKN28 do koje u normalnim želučane sluznice epitela GES-1 stanice. Povišeni EGFL7 razine nađene su u svim staničnim linijama četiri GC odnosu na GES-1, s BGC823 i MKN28 prikazuje najviše i najniže izraz EGFL7, odnosno, kako na razini proteina i mRNA (slikama 1A i 1B). Dakle, BGC823 i MKN28 su korišteni u kasnijim eksperimentima za procjenu učinaka EGFL7 izražavanja na proliferaciju, migraciju i metastaziranja. zaposleni smo stabilnu shRNA transfekcije potisnuti izraz EGFL7 u BGC823 stanice i dizajnirao ljudsko EGFL7 high-plazmid ekspresije (PEX-2-EGFL7) za povećanje ekspresije EGFL7 u MKN28 stanicama. pregled

konstruirali smo dvije shRNA vektori plazmida ciljanje EGFL7 mRNA i provodi QRT-PCR procijeniti djelotvornost ovih kandidata shRNA sekvenci za suzbijanje EGFL7 odnosu na nespecifične sekvenci. U shRNA1 i shRNA2 sekvence postiže 75% i 30% inhibiciju EGFL7, odnosno (slika 1C), tako da je učinkovitiji shRNA1 se koristi za sve kasnije eksperimente. U BGC823 linije stabilno transfektiranih s pGPU6 /GFP /neo-EGFL7-shRNA1 ili pGPU6 /GFP /neo-nespecifične-shRNA su označeni BGC2-13 i BGC-NC, respektivno. U MKN28 linije stabilno transfektirane s PEX-2-EGFL7 i PEX-2-nespecifične su označeni MKN28-EGFL7 i MKN28-NC, respektivno. Razina ekspresije proteina i mRNA EGFL7 u Klonovi otporni prema G418 također su procijenjeni Western blot (Slika 1D) i u realnom vremenu RT-PCR (Slika 1E). Rezultati su izrazito pokazale smanjenu EGFL7 izraz u BGC2-13 stanica u odnosu na BGC-NC stanica i značajno povišen izraz u MKN28-EGFL7 stanica u odnosu na MKN28-NC stanica (sve P izvoznici < 0,05). Nije bilo značajne razlike u mRNA i proteina između BGC-NC i BGC stanica ili između MKN28-NC i MKN28 stanice (sve P izvoznici > 0,05). Pregled

EGFL7 promoviranih GC Cell Invazija i migracije, ali nije utjecala na GC stanične proliferacije

Kako bi istražili ulogu EGFL7 u GC napredovanja, prvo ispituje da li EGFL7 utišavanje ili prekomjerna ekspresija promijenio proliferacijske, invazivni i migracijske sposobnosti GC stanicama. Ogrebotina zarastanje rana je izmjerena migraciju stabilno transfektiranih stanica. Rana je generiran na GC staničnih monoslojeva jednim ogrebotine i broj stanica u zoni ogrebotina u odnosu na 0 i 48 sati. Zatvaranje rane bila je znatno sporiji u BGC2-13 kultura (underexpressing EGFL7) u odnosu na rodni BGC823 i BGC-NC kultura (32% vs.
100% i 98%, i P pregled < 0,05) (Slika 2). Nasuprot tome, zatvarač bio znatno brže u MKN28-EGFL7 kultura (ekspresijom EGFL7) u odnosu na MKN28 i MKN28-NC kultura (99% vs. Pregled 49% i 50%, i P pregled <0,05) (Slika 2B). Štoviše, rana bliže na neko vrijeme post-nule (48 h) bila je veća u srednjoj EGFL7-izražavanje divljeg tipa BGC823 stanica u usporedbi s niskim izražavanje divljeg tipa MKN28 stanica, što znači da endogene razine ekspresije također utjecati na migraciju. Pregled

Transwell testovi provedeni su za potvrdu ovih nalaza i dalje istraživati ​​učinak EGFL7 na invazivni potencijal BGC823 stanica, MKN28 stanica i odgovarajućih stabilnim izraz linije u Matrigel. Bilo je znatno manje EGFL7-underexpressing (BGC2-13) stanice u Matrigel odnosu na BGC-NC i BGC823 stanica (25 ± 3,1 vs pregled 76 ± 2,9 i 79 ± 5,7 stanice /;. I P izvoznici < 0,05), što ukazuje da EGFL7 underexpression značajno smanjenu invazivne sposobnosti (slika 2c). Isto tako, broj BGC2-13 stanica može doseći niže Matrigel bez bunar u transjažična migracija testovima značajno je smanjena u odnosu na BGC823 i BGC-NC stanica (19 ± 1,1 vs. Pregled, 53 ± 2,9 i 54 ± 2,6 , i P izvoznici < 0,05) (Slika 2C). Nasuprot tome, EGFL7 prekomjerna ekspresija u MKN28 stanica značajno pojačava oboje invaziju u Matrigel (MKN28-EGFL7: 79 ± 6,19 stanica /zdenac MKN28-NC: 40 ± 2,00 stanica /zdenac MKN28: 41 ± 4,22, i P
< 0,05; Slika 2D) i migracije (MKN28-EGFL7: 67 ± 4,16, MKN28-NC: 33 ± 5,92, MKN28: 35 ± 3,7; i P izvoznici < 0,05; Slika 2D).

• PLO-ON: 346 Analiza slučaja za Laparoskopska Slezena-Očuvanje br.10 limfni čvor disekcija za proksimalni rak želuca: Studija jednog centra
• PLoS ONE: Prekomjerna ekspresija nuklearnu apoptoze inducira Faktor 1 preinačio proteomskog profila Ljudski raka želuca Cell MKN45 i izazvan staničnog ciklusa u G1 /S Faza