PLOS ONE: Epidermal Growth Factor-Like contenant un domaine Protein 7 (EGFL7) Améliore EGF Receptor-AKT Signaling, épithéliale-mésenchymateuses Transition et Métastases du cancer gastrique Cells

Résumé

de domaine de facteur de croissance analogue à Epidermal protéines -Contenant 7 (EGFL7) est régulée positivement dans les tumeurs épithéliales humaines et est donc un biomarqueur potentiel de malignité. En effet, des études antérieures ont montré que l'expression élevée favorise l'infiltration EGFL7 et des métastases du carcinome gastrique. La transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) déclenche la cascade métastatique et lui confère des cellules cancéreuses ayant une capacité invasive et migratoire; Cependant, on ne sait pas si EGFL7 favorise la métastase en déclenchant EMT. Nous avons constaté que EGFL7 a été surexprimé dans plusieurs cancer gastrique humain (GC) des lignées cellulaires et que la surexpression promu invasion cellulaire et la migration comme l'a révélé la blessure à la rayure et Transwell tests de migration. A l'inverse, shRNA médiée EGFL7 knockdown réduit l'invasion et la migration. En outre, les cellules EGFL7-surexprimant ont augmenté dans les tumeurs plus grandes et étaient plus susceptibles de métastaser au foie par rapport aux cellules CG suivantes sous-exprimant injection sous-cutanée chez la souris. EGFL7 surexpression protégé des lignées de cellules GC contre anoikis, fournissant un mécanisme plausible pour cette capacité métastatique améliorée. Dans les tumeurs gastriques humaines excisées, l'expression de EGFL7 était positivement corrélée avec les niveaux de la vimentine marqueur mésenchymateuses et la transcription de EMT-associé expression répresseur Snail et négativement corrélée avec l'expression du marqueur de cellules E-cadhérine épithéliale. Dans les lignées cellulaires du GC, EGFL7 knockdown inversé signes morphologiques de EMT et une diminution à la fois la vimentine et l'expression Snail. En outre, la surexpression EGFL7 promu récepteur de l'EGF (EGFR) et la protéine kinase B (AKT) d'activation phospho, des effets nettement supprimée par l'inhibiteur de EGFR tyrosine kinase AG1478. En outre, AG1478 a également réduit la capacité d'invasion et la migration élevée de lignées cellulaires surexprimant GC EGFL7. Collectivement, ces résultats suggèrent fortement que EGFL7 favorise la métastase en activant EMT par une voie de signalisation EGFR-AKT-Snail. La perturbation de la signalisation EGFL7-EGFR-AKT-Snail peut une stratégie thérapeutique prometteuse pour le cancer gastrique

Citation:. Luo B-H, Xiong F, Wang J-P, Li J-H, Zhong M, Liu Q-L, et al. (2014) Protein 7 (EGFL7) facteur de croissance épidermique-Like-Domain contenant Améliore EGF Receptor-AKT Signaling, épithéliale-mésenchymateuses Transition et la métastase des cellules de cancer gastrique. PLoS ONE 9 (6): e99922. doi: 10.1371 /journal.pone.0099922

Editeur: Claudia D. Andl, Vanderbilt University, États-Unis d'Amérique

Reçu 15 Novembre, 2013; Accepté: 19 mai 2014; Publié: 19 Juin, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Luo et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenu par la national science Foundation naturel de la Chine (n ° 81001080) et le Fonds Open-End pour les précieux et de précision Instruments de Central South University (No. JJ3121). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique (GC) est la quatrième tumeur maligne la plus fréquente et la deuxième cause de mortalité liée au cancer dans le monde entier [1], [2]. Environ la moitié de tous les cas de GC surviennent dans les pays d'Asie orientale, avec notamment une incidence élevée au Japon, en Corée et en Chine [3], [4]. Les progrès dans le traitement systémique de GC a considérablement augmenté la survie à court terme; cependant, le taux de survie à cinq ans des patients GC reste faible en raison de la rechute et les métastases [5]. En outre, les patients du GC plupart nouvellement diagnostiqués présentent déjà une maladie métastatique, ce qui constitue un défi thérapeutique majeur pour les oncologues [6].

La croissance épidermique de facteur analogue à la protéine contenant le domaine-7 (EGFL7), également connu sous le nom de statine endothélial vasculaire , est un facteur endothelial dérivé des cellules sécrété qui régule la formation du tube vasculaire. Parker et al. [7] a démontré que EGFL7 est crucial pour l'angiogenèse lors de poisson zèbre embryogenèse [8]. Des études récentes ont rapporté une expression élevée de EGFL7 dans plusieurs tumeurs et des lignées de cellules cancéreuses, y compris les tumeurs rénales, les gliomes malins, hépatocarcinomes, les cancers du côlon et [7] - [10]. Nous avons déjà démontré que EGFL7 est également surexprimé dans le cancer gastrique [11], et l'expression était significativement corrélée avec les caractéristiques pathologiques, la progression clinique, un mauvais pronostic, et les métastases [10], [12]. Par conséquent, EGFL7 est un facteur de prédiction candidat à la progression du cancer et des métastases. Cependant, les mécanismes sous-jacents aux effets tumorigènes de EGFL7 ne sont pas claires.

métastase est un processus en plusieurs étapes qui implique une transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) dans lequel polarisés cellules épithéliales sont converties en cellules mésenchymateuses [13], un phénotype avec une plus grande capacité invasive et migratoire [14]. Le PSP est un processus réversible qui se produit souvent à l'avant-invasive de nombreux cancers métastatiques [15]. Plusieurs études ont montré que l'EGF favorise la migration des cellules cancéreuses et l'invasion concomitante avec l'activation de l'EMT [16] - [18]. De manière significative, EGFL7 contient deux domaines de type EGF, ce qui suggère une certaine homologie fonctionnelle [9], [12]. Cependant, si EGFL7 fait réellement améliorer la EMT et de promouvoir les métastases du cancer gastrique n'a pas encore été déterminée. En outre, les mécanismes moléculaires par lesquels EMT est réglementée en GC demeurent largement inconnus. Le doigt de zinc répresseur transcriptionnel Snail est critique pour la reprogrammation de l'expression des gènes au cours EMT, notamment pour la répression de l'endothélium de protéine d'adhésion cellule-cellule (E) -cadherin, dont la perte est considérée comme un événement précoce important dans EMT et nécessaire pour les métastases ultérieures [ ,,,0],19].

La présente étude visait à déterminer si EGFL7 favorise la métastase en déclenchant EMT. Nous avons constaté que EGFL7 surexpression active la voie de l'EGFR-AKT, déclenche EMT, et favorise l'invasion des cellules GC in vitro
et les métastases in vivo
.

Matériel et méthodes

patients et Collection de tissus

tissus de carcinome gastrique ont été obtenus à partir de 79 patients du GC (58 mâles et 21 femelles) traités par résection chirurgicale au Département de chirurgie, Hôpital Xiangya, Central South University (Chine). Chirurgies ont été réalisées à partir de janvier 2010 à décembre 2012. Les patients étaient âgés de 54,7 ans en moyenne (extrêmes: 28 à 82 ans). Et reçu ni chimiothérapie ni radiothérapie avant la chirurgie

Les patients ont été informés que les prélèvements chirurgicaux serait être utilisés pour le diagnostic pathologique classique et que les tissus restants pourraient être utilisés pour la recherche. Aucune donnée personnelle patient a été nécessaire pour cette étude et les protocoles ne portait pas de risque, de sorte que le consentement verbal éclairé a été demandée aux patients. Le protocole a été approuvé par le Comité d'éthique de l'hôpital Xiangya, Central South University (Numéro de permis: 201311389).

la mise en scène de la maladie a été définie en fonction de la sixième édition du système de classification TNM de l'American Joint Committee on Cancer [ ,,,0],20], [21]. Les tumeurs étaient bien différenciées adénocarcinome gastrique dans 12 cas, modérément différencié dans 34 cas, et mal différenciés dans 33 cas. Tous les échantillons ont immédiatement été fixées avec 10% de formol, déshydratées, et inclus en paraffine. information clinique précise et diagnostic pathologique étaient disponibles pour tous les patients.

immunohistochimie

Pour immunohistochimie, les échantillons préparés ont été incubées à 60 ° C pendant 15 h et coupés en sections 4 um d'épaisseur, déparaffinées dans térébenthine, séchés et réhydratés dans de l'éthanol décroissante: eau distillée gradient. une activité de peroxydase endogène a été inactivée par incubation pendant 30 minutes dans 0,3% de peroxyde d'hydrogène 0,01 M dans un tampon phosphate salin (PBS). Les tranches ont ensuite été incubées pendant 15 à 20 min dans un tampon citrate (pH 6,0) à 95 ° C pour une récupération d'antigène, bloquées avec 5% de sérum de chèvre normal dans du PBS 0,01 M pendant 15 min à 37 ° C et incubées avec des anticorps primaires dilués dans une solution de blocage pendant une nuit à 4 ° C dans une chambre humidifiée. Les anticorps primaires suivants ont été utilisés: souris anti-EGFL7 monoclonal anticorps (Abcam, USA, 1:400) et le lapin anticorps monoclonaux dirigés contre la E-cadhérine (CST, USA, 1:1000), vimentine (CST, USA, 1:1000 ), Escargot (Proteintech, USA, 1:1000) et CD34 (Boster, Chine, 1:500). Après lavage, les échantillons ont été successivement mises en incubation avec un anticorps biotinylé et de la streptavidine-peroxydase de raifort secondaire (HRP) Solution de travail de l'avidine. Immunomarquage a été visualisé en utilisant le kit de substrat DAB de Zhongshan Golden Bridge Company (Chine) selon les recommandations du fabricant. Enfin, les sections ont été colorées avec de l'hématoxyline (Vector Laboratories, USA), déshydraté dans un mélange éthanol ascendant: distillée gradient d'eau, et montées sur des lames en utilisant Permount supports de montage (Fisher Scientific, USA)

Quantification des signaux immunohistochimie.

Toutes les GC et les tissus environnants gastriques non néoplasiques ont été confirmées histopathologique par deux pathologistes indépendants (K.-SW et J.-HL) aveugles au diagnostic initial. Immunocoloration a été évalué par une méthode semi-quantitative qui a étudié à la fois l'intensité et la répartition de la coloration [22]. En bref, cinq domaines ont été choisis au hasard sous un faible grossissement (100 ×, Olympus BX51, Tokyo, Japon), et les cellules 200 tumorales à compter de chaque champ. L'intensité de la coloration a été évaluée comme suit: 0, pas de coloration; 1, coloration jaune faible; 2, coloration jaune; 3, la coloration brune. Les cellules positives ont été caractérisées par une frontière claire et une coloration jaune ou brune distincte de l'arrière-plan. Le pourcentage de cellules positives (PP) a été notée comme suit: 0, 0%; 1, 1% -25%; 2, 26% -50%; 3, 51% -75%; 4, 76% à 100%. Les deux scores ont été combinés pour obtenir la classification suivante: coloration négative, des échantillons avec score immunoréactive (IRS) de 0 à 2; faiblement coloration positive, les échantillons avec IRS de 3 à 5; fortement coloration positive, les échantillons avec IRS de 6 à 7. Les échantillons qui ont montré faiblement et fortement coloration positive ont été inclus dans l'analyse statistique.

lignées cellulaires et culture

GC Human lignées cellulaires SGC7901 (modérément les cellules adénocarcinome différencié), BGC823 (mal adénocarcinome différencié), MKN28 (adénocarcinome bien différencié), et MKN45 (adénocarcinome peu différencié), ainsi que la muqueuse gastrique épithéliales GES-1 normaux ont été achetés dans le type Culture Collection de l'Académie chinoise des sciences (Shangai, Chine). Toutes les cellules ont été cultivées et maintenues dans Roswell Park Institute Memorial (RPMI) 1640 (Gibco Biocuit, Paisley, Royaume-Uni) complété avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) (Gibco Biotechnology), 100 U /ml de pénicilline et 100 pg /ml streptomycine à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO _2.

court Hairpin ARN (shRNA) et expression plasmide recombinant Pex-2-EGFL7

Pour générer des lignées cellulaires surexprimant ou sous-exprimant EGFL7, les lignées cellulaires natives ont été transfectées de façon stable avec un vecteur d'expression ou shRNA ciblée. Les séquences de shRNA de EGFL7 humaine ont été conçus en fonction de la séquence d'ADN de EGFL7 humaine (GenBank NO NM_016215.3.) Par le logiciel Designer 3.0 (Genepharma, http://www.genepharma.com) et recherches BLAST (http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Les séquences cibles ont été comparées à la base de données du génome humain par recherche BLAST pour assurer aucune forte homologie avec d'autres séquences codantes. Les séquences EGFL7-homo-333 et EGFL7-homo-887 ont été identifiés comme étant des sites cibles pour une EGFL7 shRNA spécifique. En outre, une séquence non spécifique (scramble shRNA) a été conçu comme un contrôle négatif, et la séquence de GAPDH a été conçu comme un contrôle interne. Les séquences de shRNA étaient les suivantes:

EGFL7-shRNA1 contre EGFL7-homo-333: sens, 5'-CACCGGTGCTGCTGATGTGGCTTTCAAGAGAAGCCACATCAGCAGCACCTTTTTTG-3 '; anti-sens, 5'-GATCCAAAAAAGGTGCTGCTGATGTGGCTTCTCTTGAAAGCCACATCAGCAGCACC-3 '; EGFL7-shRNA2 contre EGFL7-homo-887: sens, 5'-CACCGAGTGGACAGTGCAATGAATTCAAGAGATTCATTGCACTGTCCACTCTTTTTTG-3 '; anti-sens, 5'-GATCCAAAAAAGAGTGGACAGTGCAATGAATCTCTTGAATTCATTGCACTGTCCACTC-3 '; sens non spécifique, 5'-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3 '; anti-sens, 5'-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3 '; GAPDH sens, 5'-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3 '; anti-sens, 5'-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3 '. Le vecteur pGPU6 /GFP /Neo (protéine fluorescente verte, néomycine) (Genepharma Company, Shanghai, Chine) a été utilisé pour la construction de plasmide. Les nucleotides ont été annelés et insérés dans les sites BamHI et HindIII et transformé dans E. coli DH5a-compétentes. /colonies résistantes à la néomycine kanamycine double ont été sélectionnés et les séquences de vecteur confirmé par digestion de restriction et séquençage d'ADN.

EGFL7 l'ADNc codant pour la séquence d'acides 533-1353 aminés a été sous-cloné dans un plasmide vecteur pEX-2 (Genepharma, Shanghai, Chine) par double digestion BglII /EcoRI et désignés pEX-2-EGFL7. Le plasmide recombinant a été amplifié dans DH5a compétentes pour E. coli et la séquence de vecteur amplifié par PCR. Le séquençage d'ADN a confirmé que le plasmide recombinant contenait un fragment de gène EGFL7 identique à celui de la GenBank (GenBank n °. NM_016215.3). Kanamycine /colonies résistantes à la néomycine ont été sélectionnées et la séquence confirmée par digestion de restriction et séquençage d'ADN. Toutes les amorces ont été conçus et synthétisés par Genepharma (Shanghai, Chine).

Transfection Stable et G418 Sélection

Pour créer un clone de EGFL7-sous-exprimant (et un contrôle approprié), BGC823 cellules ont été ensemencées dans six -Bien plaques de culture à 1 × 10 ^{6 /puits et incubé pendant 24 h dans un milieu RPMI 1640 contenant 10% de FBS dans un humidifié à 5% de CO _{2 atmosphère maintenue à 37 ° C. Les cellules ont été transfectées avec 4 pg pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1, pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA2, pGPU6 /GFP /Neo-non spécifique-shRNA ou pGPU6 /GFP /Neo-GAPDH-shRNA utilisant Lipofectamine 2000 réactif de transfection (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en suivant les instructions du fabricant. Après 24 h, les cellules ont été mises en incubation dans G418 (Sigma, États-Unis, 600 pg /ml) pour la sélection initiale, diluées, étalées à faible densité (~ 1 cellule /puits) et entretenues dans du milieu de culture supplémenté en G418 à la moitié de la concentration initiale de sélection pendant 3 semaines. Les lignées cellulaires stables résultantes ont été nommés BGC2-13 (lignée cellulaire résultant de pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 transfection stable) et BGC-NC, et élargis pour des études ultérieures. Le niveau d'expression de EGFL7 a été évaluée par Western Blot et en temps réel RT-PCR. Pour établir une ligne surexprimant et de contrôle adapté, les cellules MKN28 ont été ensemencées, transfectées avec 4 pg de PEX-2-EGFL7 ou PEX-2 plasmides, et sélectionnés comme décrit pour BGC823 cellules sauf que 500 pg /ml de G418 a été utilisé pour la sélection initiale. Les lignées cellulaires stables résultantes ont été nommées MKN28-EGFL7 et MKN28-NC. Les niveaux d'expression de EGFL7 dans les clones résistants à G418 ont été évalués par Western blot et quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR).}}

Western Blot Analyse

Après que les cellules ont atteint 80% -95% la confluence, la protéine totale a été extraite à l'aide du tampon d'extraction du lysat cellulaire (Beyotime, Chine) contenant un inhibiteur de protéase (fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM). concentration totale en protéines Lysate a été déterminée en utilisant un kit de dosage de la protéine acide bicinchoninique (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Des quantités égales de protéine (25 ug) de chaque groupe de traitement ont été séparés par gel voie par 8% de sodium dodécyl électrophorèse sur gel polyacrylamide (SDS-PAGE) et transférées vers le difluorure de polyvinylidène (PVDF), les membranes (Millipore, Billerica, États-Unis). Les membranes ont été séquentiellement incubées avec du tampon de blocage consistant en une solution saline tamponnée au Tris (TBS) contenant 5% de lait écrémé sec pendant 2 heures à la température ambiante, puis pendant une nuit à 4 ° C dans ce même tampon avec l'un des anticorps primaires suivants: anti- EGFL7 (1:500; Abcam Cambridge science, Royaume-Uni). anti-E-cadhérine, anti-vimentine, anti-Snail (tous à 1:1000; Cell Signaling Technology, CST, USA), anti-GAPDH (1:10000, Protech), anti-EGFR, anti-phospho-EGFR, anti-AKT, anti-phospho-AKT, anti-ERK, et anti-phospho-ERK (tous 1:800, Anbo Biotech Co., Ltd., USA). membranes immunomarquées ont ensuite été incubées avec un anticorps secondaire conjugué à HRP (1:2000, Immunologie Consultants Laboratory, Inc., USA) pendant 2 h à température ambiante. Après un lavage avec du TBST, les bandes de protéines ont été visualisées en utilisant le système de détection de chimioluminescence amélioré (Advansta Corporation, Menlo Park, Californie, États-Unis) selon les instructions du fabricant. L'expression de GAPDH a été utilisée comme un contrôle de chargement et de protéines quantifiées en utilisant UTHSCSA Image Tool 3.0. expression de la protéine cible a été calculée comme le rapport de l'intensité de la bande de la protéine cible à GAPDH.

Extraction d'ARN et PCR Analyse

Les cellules ont été lysées dans le réactif Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) et l'ARN total a été préparé selon les instructions du fabricant. ADNc de premier souche ont été synthétisés par le kit de réactifs PrimeScript RT avec ADNg Gomme (Takara, Otsu, Japon) et amplifiés par PCR en utilisant des amorces spécifiques suivantes: EGFL7 sens, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; anti-sens, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '. L'ADNc de GAPDH a été amplifié pour contrôler la quantité d'ADNc présent dans chaque échantillon (sens 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ', antisens 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'). L'amplification par PCR a été réalisée à 94 ° C pendant 5 min, suivie de 30 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 57 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 40 s. Les produits de PCR ont été séparés sur 1,0% de gels d'agarose et l'expression du gène cible quantifiée comme le rapport de l'intensité de la bande du gène cible à celui de GAPDH en utilisant Image Tool 3.0 (The University of Texas Health Science Center, San Antonio, Texas, USA).

en temps réel
PCR

Le mélange de réaction pour PCR en temps réel est composée de 10 pi de Taq Ex Premix (Probe qPCR), 0,2 uM de chaque EGFL7 et GAPDH amorce (ci-dessous), 0,2 pmol /Les sondes TaqMan ml (EGFL7 ou GAPDH), et 0,4 pi ROX (tetrapropano-6-carboxyrhodamine) Référence colorant II (Takara Bio, Shiga, Japon). Le mélange a été combiné avec 2 ul d'ADNc dans chaque puits d'une plaque de MicroAmp 96 puits (Applied Biosystems, CA, USA) et de l'eau distillée a été utilisée pour ajuster à un volume final de 20 pi. Les amorces suivantes ont été conçues en utilisant le logiciel 6.0 Primer Premier (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA): EGFL7: avant, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; inverse, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '; GAPDH: avant, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; inverse, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. Toutes les réactions ont été effectuées sur un système 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems, CA, USA). conditions de Thermocycle étaient dénaturation initiale à 95,8 ° C pendant 30 s, suivie par 40 cycles d'amplification à 95,8 ° C pendant 6 s et 60,8 ° C pendant 30 s.

conditions expérimentales similaires ont été utilisées pour évaluer l'expression d'autres gènes avec les amorces suivantes: E-cadhérine: avant, 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3 '; inverse, 5'-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; vimentine: avant, 5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3 '; inverse, 5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3 '; Snail: avant, 5'-TGCTCCACAAGCACCAAGA-3 '; inverse, 5'-GCAGAGGACACAGAACCAGAAA-3 '; GAPDH: avant, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; inverse, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. Le mélange réactionnel pour la PCR en temps réel est composée de 10 pi de SYBR Prémélange Ex TaqTM II, 1,6 pi de chaque amorce (0,4 pM), 0,4 pi de ROX de référence de colorant, 2 ul de matrice d'ADNc, et 6 ul de diéthylpyrocarbonate traitée eau. PCR en temps réel a été réalisée sur un système 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems, CA, USA) avec les conditions de Thermocycle suivantes: dénaturation initiale à 95 ° C pendant 10 s, suivie de 40 cycles d'amplification à 95 ° C pendant 5 s et 60 ° C pendant 34 s.

cellule Essai de prolifération

la prolifération cellulaire a été estimé par le 3- [4,5-diméthylthiazol-2-yl] -2,5 diphényl tétrazolium (MTT) de cellules viables. Les cellules ont été étalées sur des plaques à 96 puits à puits et cultivées 2000/12, 24, 48, 72 et 96 h. Ensuite, 20 ul de solution de MTT (Sigma) du stock (5 mg /ml) ont été ajoutés à 200 pi de milieu de chaque puits et les plaques ont été incubées pendant 4 h supplémentaires à 37 ° C. Après aspiration minutieuse du milieu de culture, 150 pi de sulfoxyde de diméthyle (DMSO) a été ajouté à chaque puits pour dissoudre les cristaux de formazan formés à partir du MTT par les cellules viables. Les plaques ont été agitées sur une plate-forme rotative pendant 10 minutes et l'absorbance mesurée à 490 nm en utilisant un lecteur de microplaques.

Colony Plate Formation Assay

Les cellules ont été ensemencées à 200 /puits dans le même six ainsi que des plaques utilisées pour d'autres essais pour évaluer la formation de colonies dans des conditions cellulaires adhérentes. Au bout de 10 jours, les cellules ont été colorées avec 1% de Giemsa, et le nombre de colonies visibles ont été comptées. L'indice relatif de formation de clone a été calculé comme nombre moyen de colonies /nombre de cellules ensemencées × 100%.

Scratch la guérison des plaies Assays

Pour analyser la migration cellulaire, 5 x 10 ^{5 cellules /puits ont été ensemencées dans des plaques à six puits revêtus de 10 ug /ml de fibronectine (FN) et incubées pendant 24 h. La monocouche a ensuite été perturbée par un seul zéro à l'aide d'une pipette de 200 pi. Micrographies ont été obtenus à 0, 12, 24, 36, 48, et 72 h post-zéro avec un microscope à contraste de phase (Olympus BX51, Japon). Le nombre de cellules dans la zone rayée (stérile) du micro-puits a été comptée dans cinq champs (grossissement x 200). Toutes les expériences ont été effectuées en double.}

In vitro
Invasion et migration Assay

L'invasion cellulaire et la migration ont été évaluées en utilisant Transwell chambres (Corning, New York, USA). des essais d'invasion ont été conduites dans Transwell chambres séparées par des inserts de filtre à membrane de polycarbonate (pores de 8 um) pour des plaques à 24 puits. Chaque chambre a été revêtue avec 100 pi de 01h20 Matrigel (Becton, Dickinson and Company, New York, États-Unis) dans RPMI 1640 froid pendant la nuit à 4 ° C. Par la suite, les cellules (5 x 10 ^{4 /ml x 200 pi) ont été ensemencés dans la chambre supérieure dans un milieu exempt de sérum. Environ 800 pl de milieu conditionné avec 10 pg /ml de fibronectine a été placé dans le compartiment inférieur de la chambre Transwell en tant que facteur chimiotactique. Après incubation pendant 24 h à 37 ° C, les cellules tumorales restantes sur la surface supérieure de la chambre ont été éliminées par essuyage avec des tampons de coton humide. cellules envahissantes sur la surface inférieure ont été fixées avec 4% de paraformaldehyde, colorées avec du cristal violet, et comptés sous un microscope à contraste de phase (Olympus, Japon) à × 200. Quatre expériences indépendantes ont été réalisées en triple pour toutes les conditions de traitement. In vitro
tests de migration ont été réalisés dans les mêmes conditions que les essais d'invasion, mais avec les chambres basses et non couchés en utilisant 1 × 10 5 cellules /ml (200 pi)}

. Anoikis dosage

méthacrylate de poly-hydroxy (poly-HEMA, Sigma-Aldrich), qui inhibe l'adhérence des cellules sur des plaques de culture et d'autres surfaces de croissance, a été reconstitué dans 95% d'éthanol jusqu'à une concentration finale de 12 mg /ml. Pour préparer des plaques de poly-HEMA enrobés, de 2 ml de cette solution ont été ajoutés à chaque puits d'une plaque à 6 puits et on laisse sécher pendant une nuit sous une hotte à flux laminaire de culture tissulaire. Ensuite, 5 x 10 ^{4 cellules ont été étalées en triple dans chaque puits poly-HEMA-revêtues avec des milieux de culture régulière. Après 24 h, les cellules du GC ont été récoltées, rincées avec du PBS et remises en suspension dans 500 pi de tampon de liaison à partir d'un Annexin V-PE /7 AAD-kit de détection de l'apoptose (eBioscience, San Diego, Etats-Unis). les cellules remises en suspension à partir de chaque échantillon ont été aliquotes (100 ul) dans quatre tubes. Trois tubes ont été marquées soit avec l'annexine V-PE, 7-AAD, ou les deux, tandis que le quatrième a été utilisé comme témoin non marqué. Chaque lot a été ensuite analysée par cytométrie en flux sur un Beckman Coulter FC 500 compteur (Beckman Coulter, Inc.). Le pourcentage de cellules apoptotiques a été calculé comme la somme des fractions de cellules présentant une apoptose précoce (annexine V-positif) et la fin de l'apoptose (7-AAD-positif).}

xénogreffe Nude modèle de souris

xénogreffe des lignées de cellules GC a été effectuée conformément aux lignes directrices nationales pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire (publication no. 86-23, révisée 1985), a été approuvé par le soin et l'utilisation des animaux Comité de la Troisième Hôpital Xiangya, Central South University ( SLLC [lA] 2.013 à 0.010), et conforme à la loi chinoise actuelle sur la protection des animaux (SLLC [lA] 2.013 à 0.010). Tous les efforts ont été faits pour réduire au minimum le nombre de souris utilisées et leurs souffrances.

Trente-cinq femelles Balb /c âge de souris nude 4 à 6 semaines ont été achetées chez des animaux de laboratoire Slac Co. Ltd (Shanghai, Chine) et logés dans des cages individuellement ventilées. Les souris ont été répartis au hasard en BGC823, BGC-NC, BGC2-13, MKN28, MKN28-NC, MKN28-EGFL7, et le contrôle des groupes PBS (n = 5 souris /groupe). Les cellules cultivées ont été récoltées et remises en suspension dans du PBS à 1 × 10 ^{8 cellules /0,2 ml. La suspension a été injectée par voie sous- cutanée dans l'extrémité supérieure gauche de chaque souris nue à l'exception de ceux du groupe témoin, qui ont été injectés avec 0,2 ml de PBS. La croissance tumorale a été évaluée tous les 3 jours en mesurant le diamètre de la tumeur avec des pieds à coulisse. Le volume des tumeurs (TV) a été calculé selon la formule: TV (mm 3) = D 2 × D /2, où d et D sont les plus courts et les plus longs diamètres, respectivement. Les souris ont été sacrifiées à 4 semaines après l'implantation des cellules, et les tumeurs ont été extraites et pesées. Tous les foies ont été examinés pour des métastases par hématoxyline et éosine (H & E), la coloration. Les tumeurs ont été fixés à 10% de formaline, noyés dans de la paraffine, et les couper en 4 sections um d'épaisseur. expression EGFL7 a été déterminée par immunohistochimie comme décrit ci-dessus.}

Analyses statistiques

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant SPSS version 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) pour Windows. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type (SD) à partir d'au moins trois expériences indépendantes. des moyens de groupe ont été comparés par une analyse de variance (Anova) avec différence significative (LSD) des tests moins pour les comparaisons post hoc de paires Student-Newman-Keuls (SNK) ou. Le coefficient de corrélation de Spearman Rank a été utilisé pour déterminer les corrélations entre les niveaux d'expression de protéines EMT liées EGFL7 et dans les tissus de cancer gastrique chirurgicalement excisées. A P
< 0,05 a été considérée comme statistiquement significative

Résultats

EGFL7 Expression a été élevée dans des lignées cellulaires de cancer gastrique humain

Western blot et RT. PCR a été effectuée pour comparer l'expression EGFL7 dans les lignées de cellules humaines GC SGC7901, BGC823, MKN45 et MKN28 à celle de la muqueuse gastrique epitheliales GES-1 des cellules normales. niveaux EGFL7 Elevated ont été trouvés dans toutes les lignées cellulaires quatre GC par rapport à GES-1, avec BGC823 et MKN28 affichant l'expression de EGFL7 le plus élevé et le plus bas, respectivement, à la fois à la protéine et les taux d'ARNm (Figures 1A et 1B). Par conséquent, BGC823 et MKN28 ont été utilisés dans les expériences suivantes pour évaluer les effets de l'expression EGFL7 sur la prolifération, la migration et le potentiel métastatique. Nous avons utilisé stable transfection shRNA pour supprimer l'expression de EGFL7 dans BGC823 cellules et conçu un EGFL7 humain haute expression plasmidique (PEX-2-EGFL7) pour augmenter l'expression de EGFL7 dans les cellules MKN28.

Nous avons construit deux vecteurs plasmidiques shRNA ciblant EGFL7 ARNm et mené qRT-PCR pour évaluer l'efficacité de ces candidats de séquences de shRNA pour supprimer EGFL7 par rapport à des séquences non spécifiques. Les séquences shRNA1 et shRNA2 atteint 75% et 30% d'inhibition de EGFL7, respectivement (figure 1C), de sorte que le shRNA1 plus efficace a été utilisée pour toutes les expériences ultérieures. Les lignes de BGC823 transfectées de façon stable avec pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 ou pGPU6 /GFP /Neo-non spécifique-shRNA ont été désignés BGC2-13 et BGC-NC, respectivement. Les lignes MKN28 transfectées de façon stable avec PEX-2-EGFL7 et PEX-2-non spécifique ont été désignés MKN28-EGFL7 et MKN28-NC, respectivement. Les niveaux d'expression de la protéine et de l'ARNm EGFL7 dans les clones résistants au G418 ont été également évalués par Western Blot (figure 1D) et en temps réel, une RT-PCR (figure 1E). Les résultats ont montré nettement diminué EGFL7 expression dans BGC2-13 cellules par rapport aux cellules BGC-NC et significativement élevés expression dans les cellules MKN28-EGFL7 par rapport aux cellules MKN28-NC (tous P
< 0,05). Il n'y avait pas de différences significatives dans l'ARNm et l'expression des protéines entre les cellules BGC-NC et BGC ou entre les cellules MKN28-NC et MKN28 (tous P
> 0,05).

EGFL7 Promu Invasion GC Cell et la migration, mais n'a pas affecté GC prolifération cellulaire

Pour étudier le rôle de EGFL7 dans la progression du GC, nous avons d'abord examiné si EGFL7 silencieux ou surexpression modifié le proliférative, envahissant, et les capacités de migration des cellules du GC. Scratch cicatrisation de la plaie a été utilisé pour mesurer la migration des cellules transfectées de façon stable. Une blessure a été générée en monocouches de cellules GC par un seul zéro et le nombre de cellules dans la zone scratch par rapport à 0 et 48 h. La fermeture de la plaie était significativement plus lente chez BGC2-13 cultures (EGFL7 sous-exprimant) par rapport à BGC823 natif et cultures BGC-NC (32% vs.
100% et 98%, à la fois P
< 0,05) (figure 2A). En revanche, la fermeture était significativement plus rapide dans les cultures MKN28-EGFL7 (surexprimant EGFL7) par rapport aux cultures MKN28 et MKN28-NC (99% vs.
49% et 50%, à la fois P
<0,05) (figure 2B). En outre, la plaie de plus près le post-zéro un certain temps (48 h) était plus élevée dans le type sauvage EGFL7 exprimant BGC823 cellules par rapport aux cellules de faible exprimant sauvage de type MKN28, indiquant que les niveaux d'expression endogènes ont également un impact migration.

essais de Transwell ont été réalisées pour confirmer ces résultats et d'étudier davantage l'effet de EGFL7 sur le potentiel invasif des cellules BGC823, MKN28 cellules, et les lignes d'expression stables respectives dans Matrigel. Il y avait beaucoup moins de EGFL7-BGC2-13) (sous-exprimant les cellules dans le Matrigel par rapport à BGC-NC et BGC823 cellules (25 ± 3,1 vs
76 ± 2,9 et 79 ± 5,7 cellules /puits;. P
< 0,05), indiquant que EGFL7 underexpression significative la capacité invasive réduite (figure 2C). De même, le nombre de cellules BGC2-13 atteignant le puits sans Matrigel inférieur dans Transwell essais de migration a été significativement réduite par rapport aux cellules BGC823 et BGC-NC (19 ± 1,1 vs.
53 ± 2,9 et 54 ± 2,6 , à la fois P
< 0,05) (figure 2C). En revanche, EGFL7 surexpression dans MKN28 cellules amélioré de manière significative à la fois invasion dans Matrigel (MKN28-EGFL7: 79 ± 6.19 cellules /puits, MKN28-NC: 40 ± 2.00 cellules /puits, MKN28: 41 ± 4,22; à la fois P
< 0,05; Figure 2D) et de la migration (MKN28-EGFL7: 67 ± 4.16, MKN28-NC: 33 ± 5,92, MKN28: 35 ± 3,7, à la fois P
< 0,05; Figure 2D).

• PLOS ONE: A 346 Analyse de cas pour laparoscopique Spleen-Préserver No.10 curage ganglionnaire pour cancer gastrique proximal: A Study Center Simple
• PLOS ONE: surexpression de nucléaire induisant l'apoptose Facteur 1 modifié le profil protéomique de Cancer Cell gastrique humain MKN45 et Induced arrêt du cycle cellulaire au G1 /S Phase