PLoS ONE: epidermio augimo faktoriaus-panašų domeną, kurių sudėtyje yra baltymų 7 (EGFL7) Pagerina EGF receptoriaus AKT signalizacijos, epitelio-mezenchiminių pereinamuoju laikotarpiu, o metastazes Skrandžio vėžio ląsteles

Anotacija

epidermio augimo faktoriaus-kaip domenas, kurių sudėtyje yra baltymų 7 (EGFL7) yra aktyvinama žmogaus epitelio navikų, todėl yra potencialus biologinis dėl piktybinio naviko. Iš tiesų, ankstesni tyrimai parodė, kad didelės EGFL7 išraiška skatina infiltraciją ir metastazes skrandžio karcinoma. Epitelio-mezenchiminių perėjimas (EMT) inicijuoja metastazavusiu kaskadą ir apdovanoja vėžines ląsteles invazinių ir migracijos pajėgumus; Tačiau, tai nėra žinoma, ar EGFL7 skatina metastazių sukeliant EMT. Mes nustatėme, kad EGFL7 buvo ekspresija keliomis žmogaus skrandžio vėžys (GC) ląstelių linijas ir raiška skatinamas ląstelių invaziją ir migracija atskleidė įbrėžimams žaizdos ir transwell migracijos tyrimus. Priešingai, shRNR tarpininkaujant EGFL7 triuškinantis mažesnę invaziją ir migracija. Be to, EGFL7-ekspresija ląstelės išaugo į didesnius navikus ir buvo labiau linkę metastazuoti į kepenis, palyginti su underexpressing CG ląsteles po oda injekcijos pelėms. EGFL7 raiškos apsaugotas GC ląstelių linijas nuo anoikis, teikiant įtikinamą mechanizmą šio sustiprinto metastazavusiu talpos. Be pašalintų žmogaus skrandžio auglių, išraiška EGFL7 buvo teigiamai koreliuoja su ekspresijos lygmenis mezenchiminių žymeklio vimentin ir EMT susijęs transkripcijos slopinančioje sraigė, ir neigiamai koreliuoja su išraiškos epitelio ląstelių žymuo E-cad. GC ląstelių linijų, EGFL7 nokdaunas atstatomi morfologinių požymių EMT ir sumažėjo tiek vimentin ir sraigė išraiška. Be to, EGFL7 raiškos skatinamas EGF receptorių (EGFR) ir baltymų kinazės B (AKT) fosfo-aktyvavimo, poveikį žymiai sumažėjusi dėl EGFR tirozino kinazės inhibitorius AG1478. Be to, AG1478 taip pat sumažino GC ląstelių linijų ekspresija EGFL7 padidėjęs invazinės ir migracijos pajėgumus. Bendrai šie rezultatai aiškiai rodo, kad EGFL7 skatina metastazių aktyvuojant EMT per EGFR AKT-sraigė signalizacijos keliu. Sutrikimų EGFL7-EGFR AKT-sraigė signalizacijos gali perspektyvus terapinis strategija skrandžio vėžio

nurodomoji dalis:. Lo B H Xiong F Wang J-P, Li J O Zhong M Liu K-L et al. (2014) epidermio augimo faktoriaus-panašų domeną, kurių sudėtyje yra baltymų 7 (EGFL7) Pagerina "EGF receptoriaus AKT signalizacijos, epitelio-mezenchiminių Perėjimas ir metastazes Skrandžio vėžio ląsteles. PLoS ONE 9 (6): e99922. Doi: 10,1371 /journal.pone.0099922

redaktorius: Klaudija D. apatinių, Vanderbilt universiteto, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Lapkričio 15, 2013 m Priėmė: 19 2014 m Paskelbta: Birželis 19, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Lo et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė Nacionalinis gamtos mokslo fondo Kinijos (Nr 81.001.080) ir atviro fondo už vertingas ir tikslieji prietaisai Centrinės Pietų universiteto (Nr JJ3121). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra ketvirtoji dažniausia piktybinis navikas ir antra pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusio mirtingumo visame pasaulyje [1], [2]. Maždaug pusė visų GC atvejais pasitaiko Rytų Azijos šalyse, su ypač didele sutrikimus Japonijoje, Korėjoje ir Kinijos [3], [4]. Pažanga sisteminio gydymo GC smarkiai išaugo trumpalaikį išlikimą; Tačiau penkerių metų išgyvenamumas GC pacientų išlieka žemas dėl recidyvo ir metastazių [5]. Be to, dauguma naujai diagnozuota GC pacientai jau rodo metastazavusiu liga, kuri yra didžiausia terapinė iššūkis onkologai [6].

epidermio augimo faktoriaus-kaip domenas, kurių sudėtyje yra baltymų 7 (EGFL7), taip pat žinomas kaip kraujagyslių endotelio statinu , yra endotelio ląstelių kilmės išskiriami faktorius, kuris reguliuoja kraujagyslių vamzdis išsidėstymą. Parker ir kt. [7] parodė, kad EGFL7 yra labai svarbus angiogenezę metu zebras žuvų embriogenezės [8]. Naujausi tyrimai pranešė, padidėjusi išraiška EGFL7 keliose auglių ir vėžio ląstelių linijų, įskaitant inkstų navikai, piktybine glioma, kepenų ląstelių karcinoma, ir storosios žarnos vėžio [7] - [10]. Mes anksčiau parodė, kad EGFL7 taip pat ekspresija skrandžio karcinoma [11], ir išraiška reikšmingai koreliavo su patologinių savybes, progresavi-, blogos prognozės ir metastazių [10], [12]. Todėl EGFL7 yra kandidatas prognozavimo veiksnys vėžio progresavimo ir metastazių. Tačiau mechanizmus, sukeliančius tumorogeninį poveikį EGFL7 yra neaiški.

Metastazė yra kelių etapų procesas, kuris apima epitelį-mezenchiminių perėjimą (EMT), kurioje poliarizuota epitelio ląstelės yra konvertuojami į mezenchiminių ląstelių [13], fenotipą su didesniu invazinės ir migracijos pajėgumų [14]. EMT taip pat yra grįžtamas procesas, kuris dažnai įvyksta invazinės daugelio metastazavusio vėžio [15] priekyje. Keletas tyrimų parodė, kad EGF lėšomis skatina vėžinių ląstelių migraciją ir invazija, kartu vartojantiems su aktyvavimo EMT [16] - [18]. Žymiai, EGFL7 yra du EGF-kaip domenus, tai rodo, kai kuriuos funkcinius homologiją [9], [12]. Tačiau, ar EGFL7 tiesų pagerinti EMT ir skatinti skrandžio vėžio metastazių dar turi būti nustatyta. Be to, molekulinius mechanizmus, pagal kurią EMT reglamentuojami GC daugiausia lieka nežinoma. Cinko pirštu transkripcijos represoriaus sraigė yra svarbus genų ekspresijos perprogramuoti metu EMT, ypač represijas ląstelių ląstelių sukibimą baltymų endotelio (R) -cadherin, kurio praradimas laikomas svarbia anksti renginys EMT ir būtina tolesniam metastazių [ ,,,0],19].

Šis tyrimas skirtas nustatyti, ar EGFL7 skatina metastazių sukeliant EMT. Mes nustatėme, kad EGFL7 raiškos suaktyvina EGFR AKT kelyje, sukelia EMT ir skatina GC ląstelių invaziją in vitro parsisiųsti ir metastazių vivo
.

Medžiagos ir metodai

pacientai ir audinių kolekcija

Skrandžio vėžys audiniai buvo gauti iš 79 GC pacientų (58 vyrai ir 21 moterys), gydytų tuo chirurgijos departamento Xiangya ligoninė, Centrinis Pietų universiteto (Kinija) chirurginės rezekcijos. Operacijos buvo atliktos nuo Jan 2010 į gruodis 2012 pacientai buvo 54,7 metai, vidutiniškai (ribos: nuo 28 iki 82 metų). Ir gavo nei chemoterapija, nei radioterapija prieš operaciją

pacientai buvo pranešta, kad chirurginės bandiniai būtų būti naudojami paprastųjų patologinės diagnozės ir kad likę audiniai galėtų būti naudojami tyrimams. Jokia asmeninė paciento duomenys buvo reikalaujama šiame tyrime ir protokolai atlikti jokio pavojaus, todėl tik žodinis sutikimas buvo reikalaujama iš pacientų. Protokolas buvo patvirtintas etikos komiteto Xiangya ligoninė, Centrinis Pietų universiteto (leidimo numeris: 201311389).

Ligos sustojimo buvo apibrėžta atsižvelgiant į šeštą leidime TNM Amerikos jungtinio komiteto vėžio [ ,,,0],20], [21]. Augliai buvo gerai diferencijuotas skrandžio adenokarcinoma 12 atvejų, vidutiniškai diferencijuoti 34 atvejų, ir prastai diferencijuojamas 33 atvejais. Visi mėginiai buvo nedelsiant fiksuojamas 10% formalino, dehidratuoti, ir parafiną įdėta. Tiksli klinikinė informacija ir patologinis diagnozė buvo galima visiems pacientams.

imunohistocheminis

imunohistocheminiu, paruošti mėginiai buvo inkubuojami 60 ° C temperatūroje 15 h ir supjaustyti 4 pm storio sekcijų, deparaffinized į terpentinas, džiovinti, ir rehidrataciją į mažėja etanolio: distiliuotas vanduo nuolydžio. Endogeninės peroksidazės aktyvumo inaktyvuodavo inkubacijos 30 min 0,3% vandenilio peroksido 0,01 M fosfato buferio druskų tirpalo (PBS). tada griežinėliai buvo inkubuojamos 15-20 min citrato buferio (pH 6.0), esant 95 ° C antigeno gavimą, užblokuotas su 5% normalaus ožkų serumo 0,01 M PBS 15 min 37 ° C temperatūroje, ir inkubuojami su pirminiais antikUnais praskiesti blokuojančiu tirpalu per naktį 4 ° C temperatūroje drėgnoje kameroje. buvo naudojami šie pirminiai antikūnai: pelės anti-EGFL7 monokloninis antikūnas (Abcam, JAV, 1:400) ir triušis monokloninius antikūnus iškelta E-cad (BST, JAV, 1:1000), vimentin (CST, JAV, 1:1000 ), sraigė (Proteintech, JAV, 1:1000) ir CD34 (Boster, Kinija, 1:500). Po plovimo, mėginiai buvo paeiliui inkubuojamos su biotinilintu antrinis antikūnas ir streptavidino-krienų peroksidazės (HRP) avidino darbinio tirpalo. Immunolabeling buvo ryškinamos naudojant TBP substrato rinkinį iš Zhongshan Golden Bridge Company (Kinija) pagal gamintojo rekomendacijas. Galiausiai, sekcijos buvo counterstained hematoksilinu (Vector Laboratories, JAV), dehidratuoti didėjimo Etanolis: distiliuoto vandens gradientas ir montuojamas ant skaidres naudojant Permount montavimo laikmenos (Fisher Scientific, JAV)

kiekybinis Imunohistocheminiais signalus.

Visos GC ir aplinkinių ne navikiniai skrandžio audinių pasitvirtino histopathologically dviejų nepriklausomų patologai (K.-SW ir J.-hl) aklųjų į pradinį diagnozę. Imunodažymu buvo rūšiuojami pagal pusiau kiekybinis metodas, kuris mano, kad abu intensyvumą ir paskirstymą dažymą [22]. Trumpai tariant, penki laukai buvo atsitiktinai parinkti esant žemam priartinimas (100 × Olympus BX51, Tokijas, Japonija), ir 200 naviko ląstelės skaičiuojamas nuo kiekvieno lauko. Dažymo intensyvumas pelnytas taip: 0, ne dažymo; 1, silpnas geltona dažymo; 2, geltonos dėmės; 3, rudos dėmės. Teigiami ląstelės buvo būdingas aiškus sienos ir geltonos arba rudos dažymo skiriasi nuo fono. Teigiamų ląstelių procentinė dalis (PP) pelnytas taip: 0, 0%; 1, 1% -25%; 2, 26% -50%; 3, 51% -75%; 4, 76% -100%. Du balų buvo sujungti į vieną gauti tokią klasifikaciją: neigiamą dažymo mėginius, kurių imunoreaktyvių rezultatą (IRS) nuo 0 iki 2; silpnai teigiama dažymo, mėginiai su IRS nuo 3 iki 5, stipriai teigiamas dažymo, mėginiai su IRS nuo 6 iki 7. Mėginiai, parodė silpnai ir stipriai teigiamą dažymo buvo įtrauktos į statistinę analizę.

Mobilaus ryšio linijos ir kultūra

Žmogaus GC ląstelių linijos SGC7901 (vidutiniškai diferencijuota adenokarcinoma), BGC823 (blogai diferencijuota adenokarcinoma), MKN28 (gerai diferencijuota adenokarcinoma), ir MKN45 (blogai diferencijuota adenokarcinoma), taip pat normalus skrandžio gleivinės epitelio GES-1 ląstelės buvo įsigytas iš tipo kultūros kolekcijos Kinijos mokslų akademijos (Šanchajus, Kinija). Visos ląstelės buvo auginamos ir prižiūrimos Roswell Park memorialinis instituto (RPMI) 1640 terpė (Lanksčiai Biocult, Paisley, Jungtinė Karalystė) papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) (Lanksčiai biotechnologijos), 100 V /ml penicilino ir 100 mikrogramų /ml streptomicino 37 ° C drėgnoje atmosferoje, kuriame 5% CO _2.

Trumpas segtukas RNR (shRNR) ir ekspresijos plazmidžių Pex-2-EGFL7

Norėdami sukurti ląstelių linijų ekspresija arba underexpressing EGFL7, gimtoji ląstelių linijos buvo stabiliai perkeltų ekspresijos vektoriumi ar tikslinių shRNR. Į shRNR sekos žmogaus EGFL7 buvo sukurta pagal žmogaus EGFL7 DNR sekos (GenBank NE NM_016215.3.) Dizaineris 3.0 programinės įrangos (Genepharma, http://www.genepharma.com) ir sprogimo paieškų (http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Tikslinės sekos buvo palyginti su žmogaus genomo duomenų bazę BLAST paieškos, kad būtų užtikrinta aukšto homologiją su kitais kodavimo sekų. Sekos EGFL7-homo-333 ir EGFL7-homo-887 buvo nurodyti kaip tikslinės svetainių konkretaus EGFL7 shRNR. Be to, vienas nespecifinis seka (užsikeberioti shRNR) buvo sukurtas kaip neigiama kontrolė, ir GAPDH seka buvo sukurtas kaip vidaus kontrolės. Į shRNR sekos buvo taip: Rīga,

EGFL7-shRNA1 prieš EGFL7-homo-333: prasmė, 5'-CACCGGTGCTGCTGATGTGGCTTTCAAGAGAAGCCACATCAGCAGCACCTTTTTTG-3 "; Priešprasminis, 5'-GATCCAAAAAAGGTGCTGCTGATGTGGCTTCTCTTGAAAGCCACATCAGCAGCACC-3 '; EGFL7-shRNA2 prieš EGFL7-homo-887: prasmė, 5'-CACCGAGTGGACAGTGCAATGAATTCAAGAGATTCATTGCACTGTCCACTCTTTTTTG-3 "; Priešprasminis, 5'-GATCCAAAAAAGAGTGGACAGTGCAATGAATCTCTTGAATTCATTGCACTGTCCACTC-3 '; nespecifinis jausmas, 5'-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3 "; Priešprasminis, 5'-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3 '; GAPDH jausmas, 5'-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3 "; Priešprasminis, 5'-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3 '. PGPU6 /GFP /Neo "(žalia fluorescencinė baltymų, neomicino) vektorius (Genepharma Įmonės, Šanchajus, Kinija) buvo naudojamas plazmidžių statybos. Nukleotidai buvo atkaitinami ir įterpiamas į BamHI ir Hind III vietų ir virsta DH5a-kompetentingų E. coli. Dual kanamicino /neomicino atsparus kolonijos buvo atrinkti ir vektorinės sekas patvirtino apribojimas virškinimą ir DNR sekos.

EGFL7 kDNR kodavimas 533-1353 amino rūgščių seką buvo subklonuotas į PEX-2 plazmidžių vektoriaus (Genepharma, Šanchajus, Kinija) pagal BglII /EcoRI dvigubo virškinimą ir paskirta PEX-2-EGFL7. Gauta rekombinantinė plazmidė buvo amplifikuotos DH5a-kompetentingos E. coli ir vektoriaus sekos amplifikuotas. DNR sekos patvirtino, kad rekombinantinis plazmidė turi žinutę EGFL7 genų fragmentą toks pat kaip ir GenBank (GenBank NR. NM_016215.3). Kanamicino /neomicino-atsparus kolonijos buvo atrinkti ir seka patvirtino restrikcijos virškinimo ir DNR sekos. Visi gruntai buvo suprojektuoti ir sintetinamas Genepharma (Šanchajus, Kinija).

Stabilus transfekcijq ir G418 atranka

Jei nustatyti EGFL7-underexpressing klonas (ir atitinkamą kontrolę), BGC823 ląstelės buvo pasėjamos šešiose -well kultūra plokšteles 1 × 10 ^{6 /duobutėje ir inkubuojami 24 h į RPMI 1640 terpėje, turinčioje 10% FBS drėgmėje, 5% CO _{2 atmosfera palaikoma 37 ° C temperatūroje. Ląstelės buvo pernešta su 4 mikrogramų pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1, pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA2, pGPU6 /GFP /Neo-nespecifinis-shRNR arba pGPU6 /GFP /Neo-GAPDH-shRNR naudojant Lipofectamine 2000 transfekcija reagentas (Invitrogen, Karlovi Varai, CA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Po to, kai 24 h, ląstelės buvo inkubuojami G418 (Sigma, JAV, 600 mikrogramų /ml) pirminės atrankos, atskiesti, pasėja mažo tankio (~1 ląstelių /gerai) ir palaikoma kultūrinėje terpėje, papildytoje G418 už pusę pradinio atrankos koncentraciją už papildomą 3 savaites. Gauti stabilios ląstelių linijos buvo pavadintas BGC2-13 (ląstelių, gautą iš pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 stabili transfekciją) ir BGC-NC, ir išplėtė vėlesnių tyrimų. Sąvoka lygis EGFL7 vertino Vakarų dėmė ir realaus laiko RT-PGR. Norėdami sukurti ekspresija liniją ir suderinti kontrolės, MKN28 ląstelės buvo pasėjamos, perkeltų su 4 mikrogramų PEX-2-EGFL7 arba PEX-2 plazmidės ir pasirinktas kaip aprašyta BGC823 ląstelių išskyrus tai, kad 500 mikrogramų /ml, G418 buvo naudojamas pirminio atrankos. Gauti stabilios ląstelių linijos buvo pavadintas MKN28-EGFL7 ir MKN28-NC. Sąvoka lygiai EGFL7 in G418 atsparių klonų vertino Vakarų dėmė ir kiekybinės realiojo laiko PGR (KRL-PGR).}}

Vakarų dėmė analizė

Po ląstelės pasiekė 80% -95% santaka, bendras baltymų buvo ekstrahuojamas naudojant ląstelių lizatas ekstrakcijos buferio (Beyotime, Kinija), kuriame yra proteazės inhibitorių (1 mM fenilmetilsulfonilfluoridą fluorido). Lizate bendro baltymo koncentracija buvo nustatoma naudojant bicinchoninic rūgštis baltymų Bandymo rinkinį (Pierce Biotechnologijos, Rockford, IL, JAV). Lygios sumos baltymų (iki 25 mikrogramų) iš kiekvienos gydymo grupėje buvo atskirtas už gelio juostos pagal 8% natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforezės (SDS-PAGE) ir perkelti į polivinilideno difluoridą (PVDF) membranų (Millipore ", BILLERICA, JAV). Membranos buvo iš eilės inkubuojamas su blokuojančiu buferiu, sudarytas iš tri-buferio druskų tirpalu (TBS), kuriame yra 5% Nonfat sauso pieno už 2 valandas kambario temperatūroje, po to per naktį 4 ° C tame pačiame buferio su vienu iš šių pirminių antikūnų: anti- EGFL7 (1:500; Abcam Kembridžo Mokslas, Jungtinė Karalystė). Anti-E-cad, anti-vimentin anti-sraigė (visi tuo 1:1000; Cell Signaling technologija, CST, JAV), anti-GAPDH (1:10000, Protech), anti-EGFR, anti-fosfo-EGFR, anti-AKT anti-PHOSPHO-AKT anti-ERK, ir anti-PHOSPHO-ERK (visi 1:800, Anbo Biotech Co, Ltd, JAV). tada Immunolabeled Membranos buvo inkubuojamos su HRP-konjuguoto antrinio antikūno (1:2000, Imunologija Konsultantai laboratorijos, Inc, JAV) 2 valandas kambario temperatūroje. Po plovimo su TBST, baltymų juostos buvo ryškinamos naudojant sustiprintą chemiluminescencja aptikimo sistemą (Advansta Corporation, Menlo Park, Kalifornija, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Išraiška GAPDH buvo naudojamas kaip krovinio kontrolę ir baltymų kiekybiškai naudojant UTHSCSA Image Tool 3.0. Tikslinė baltymo ekspresija buvo skaičiuojama kaip grupė intensyvumo santykis tikslinės baltymų GAPDH.

RNR ekstrakcijai ir PGR analizė

Ląstelės buvo lizuoti į TRIzol reagento (Invitrogen, Karlovi Varai, CA, JAV) ir bendras RNR buvo paruoštas pagal gamintojo instrukcijas. Pirmieji įtempimo kDNR buvo sintetinamas PrimeScript RT reagentų rinkinys su gDNA Eraser (TAKARA, Otsu, Japonija) ir sustiprina PGR naudojant šiuos specifinius pradmenis: EGFL7 prasme, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 "; Priešprasminis, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '. Iš GAPDH kDNR buvo papildyta, kad būtų kontroliuoti kDNR sumos kiekviename mėginyje (prasme, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; Priešprasminis, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'). PGR amplifikacija buvo atlikta 94 ° C temperatūroje 5 min, o po to 30 ciklų 94 ° C temperatūroje 30 S, 57 ° C temperatūroje 30 s, ir 72 ° C temperatūroje 40 s. PGR produktai buvo atskirtas nuo 1,0% agarozės gelyje ir taikinio geno išraiškos skaičiais išreikštų kaip taikinio geno juostos intensyvumo santykį kad GAPDH naudojant Image Tool 3.0 (Teksaso sveikatos mokslo centras, San Antonijas, Teksasas, JAV universitetas).

realaus laiko PGR

reakcijos mišinys realaus laiko PGR sudarė 10 įxL Pašaro Ex Taq (zondas qPCR), 0,2 mkm kiekvieno EGFL7 ir GAPDH gruntas (žemiau), 0,2 pmol /ml TaqMan zondai (EGFL7 arba GAPDH) ir 0,4 mikrol ROX (tetrapropano-6-carboxyrhodamine) Nuoroda Dažų II (Takara Biografija, Shiga, Japonija). Mišinys buvo kartu su 2 mikrol, kDNR į kiekvieną 96 šulinėlių MICROAMP plokštelės duobutę (Applied Biosystems, CA, USA) ir distiliuotas vanduo buvo naudojamas siekiant prisitaikyti prie galutinio tūrio 20 pL. Šie gruntai buvo sukurta naudojant Gruntas Premier 6.0 programinės įrangos paketą ( "Premier" Biosoft International ", Palo Alto, Kalifornija, JAV): EGFL7: pirmyn, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3"; pakeisti, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 "; GAPDH: pirmyn, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 "; pakeisti, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 ". Visos nepageidaujamos reakcijos buvo atliekami ant 7500 Realaus laiko PGR sistema (Applied Biosystems, CA, JAV). Thermocycle sąlygos buvo pradinis denatūravimas ne 95,8 ° C temperatūroje 30 s, po to 40 ciklų amplifikacijos ne 95,8 ° C temperatūroje 6 s ir 60,8 ° C temperatūroje 30 s.

buvo naudojamas analogiškų eksperimentinių sąlygos įvertinti kita išraiška genai su šiais pradmenimis: e-cad: Pirmyn, 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3 "; pakeisti, 5'-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 "; vimentin: pirmyn, 5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3 "; pakeisti, 5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3 "; Sraigė: pirmyn, 5'-TGCTCCACAAGCACCAAGA-3 "; pakeisti, 5'-GCAGAGGACACAGAACCAGAAA-3 "; GAPDH: pirmyn, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 "; pakeisti, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 ". Reakcijos mišinys realaus laiko PGR sudarė 10 įxL SYBR Pašaro Ex TaqTM II, 1,6 įxL kiekvieno gruntas (0,4 mikromolių), 0,4 įxL ROX Skelbimo dažų, 2 įxL šablonų kDNR, o 6 įxL dietilo pyrocarbonate gydytų vandens. Realaus laiko PGR buvo atliekamas su 7500 realaus laiko PGR sistemos (Applied Biosystems, CA, USA) su šių thermocycle sąlygomis: pradinį denatūraciją, esant 95 ° C temperatūroje 10 s, o po to 40 ciklų amplifikacijos 95 ° C temperatūroje 5 s ir 60 ° C temperatūroje 34 s.

ląstelių proliferacijos Analizės

ląstelių proliferacija buvo vertinama pagal 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5 difenilo tetrazolio bromido (MTT) gyvų ląstelių tyrimas. Ląstelės buvo padengtu 96 duobučių plokšteles 2000 /duobutėje ir kultivuojamos 12, 24, 48, 72, ir 96 h. Tada, 20 mikrol MTT (Sigma) tirpalo (5 mg /ml) buvo įtraukta į 200 pL terpės kiekvieną šulinėlį, ir lėkštelės buvo inkubuojamos papildomą 4 h, esant 37 ° C temperatūroje. Po to, kai atidžiai aspiracijos mitybinės terpės, 150 mikrol, dimetilsulfoksido (DMSO) buvo įtraukta į kiekvieną šulinėlį, kad ištirptų formazano susidariusių kristalų išskyrimą iš MTT pagal gyvybingų ląstelių. Lėkštelės susvyravo ant sukamosios platformos 10 min ir absorbcijos išmatuoto esant 490 nm, naudojant microplate skaitytuvą.

NL kolonija formavimas Analizės

Ląstelės buvo pasėtos ne 200 /gerai tos pačios šešių gerai plokštės kaip naudojami kiti tyrimai, siekiant įvertinti kolonijų susidarymą pagal ląstelių adhezija sąlygomis. Po 10 dienų, ląstelės buvo tamsintas su 1% Giemsa, ir buvo suskaičiuotos matomų kolonijų skaičius. Santykinis klonas formavimas indeksas apskaičiuojamas kaip vidutinis kolonijų skaičių /skaičių sėklomis ląstelių × 100%.

įbrėžimams žaizdų gijimą tyrimai

Jei bandinys ląstelių migraciją, 5 × 10 ^{5 ląstelės /duobutėje buvo padengtą šešių-duobučių lėkštelėse padengtų su 10 mikrogramų /ml fibronektino (FN) ir inkubuojama 24 h. Tada monosluoksniui buvo sutrikdyta vieno nulio naudojant 200 iL pipetės galiuką. Mikrografijos buvo gauti 0, 12, 24, 36, 48, ir 72 val po įbrėžimams su fazinio kontrasto mikroskopu ( "Olympus BX51, Japonija). Ląstelių viduje subraižyti (nevaisinga) regione microwell skaičius buvo skaičiuojami penki laukai (Didinimas: × 200). Visi eksperimentai buvo atliekami dviem egzemplioriais.}

in vitro
invazija ir migracijos Analizės

Mobilusis invazija ir migracija buvo įvertintas naudojant transwell kameras (Corning, Niujorkas, JAV). Invazija tyrimai buvo atliekami transwell rūmų atskirtų polikarbonato membraninį filtrą intarpais (8 mkm porų) už 24-duobučių lėkštelėse. Kiekviena kamera buvo padengtas 100 pL 1:20 Matrigel (Becton, Dickinson and Company, New York, JAV) šaltame RPMI 1640 per naktį 4 ° C temperatūroje. Vėliau ląstelės (5 × 10 ^{4 /ml × 200 pl) buvo pasėjamos viršutiniame kambaryje terpėje serumo nemokamai. Maždaug 800 įxL vidutinio kondicionieriai 10 mikrogramų /ml fibronektino buvo dedamas apatinėje kameroje transwell kameroje kaip chemoattractant. Po inkubacijos 24 h esant 37 ° C, likę naviko ląstelės ant viršutinio paviršiaus kameroje buvo pašalintas nušluostydami drėgnomis medvilnės tamponai. Invazija ląstelės ant apatinio paviršiaus buvo nustatytos su 4% paraformaldehido, tamsintas su violetinei ir skaičiuojami pagal fazinio kontrasto mikroskopu (Olympus, Japonija) ne × 200. Keturi nepriklausomi bandymai buvo pakartotas tris kartus visiems apdorojimo sąlygų. in vitro
migracijos tyrimai buvo atliekami tomis pačiomis sąlygomis kaip invazija tyrimus, tačiau su nedengtų mažesnių kamerų ir naudojant 1 × 10 5 ląstelių /ml (200 pl).}

Anoikis tyrimas

poli-hidroksietil metakrilato (poli-HEMA, Sigma-Aldrich), kuris slopina ląstelių sukibimą su kultūros plokščių ir kitų augimo paviršių, buvo ištirpinti 95% etanolio, kad galutinė koncentracija yra 12 mg /ml. Paruošti poli-HEMA dengtos plokštės, 2 ml šio tirpalo buvo pridėta į kiekvieną 6 šulinėlių plokštelės šulinėlį ir leidžiama į išdžiūti per naktį pagal laminarinio srauto audinių kultūros gaubtu. Tada 5 × 10 ^{4 ląstelės buvo padengtas trimis egzemplioriais kiekviena poli-HEMA dengtos pat reguliariai terpėje. Po to, kai 24 h, GC Ląstelės buvo surinktos, skalaujami PBS, ir resuspenduojamos 500 pL rišikliais buferį iš aneksino V-PE /7-AAD Apoptozę aptikimo rinkinys (eBioscience, San Diego, JAV). Sumaišymo ląstelių iš kiekvienos mėginio buvo padalinamas alikvotinėmis dalimis (100 pl) į keturias vamzdžiai. Trys vamzdžiai buvo pažymėtas arba aneksino V-PE, 7-AAD, arba abu, o ketvirtasis buvo naudojamas kaip nežymėtu kontrolės. tada Kiekviena partija buvo analizuojami tėkmės citometrijos ant Beckman Coulter FC 500 prekystalio (Beckman Coulter, Inc.). Iš apoptozinių ląstelių procentas buvo kilęs kaip ląstelių frakcijų kuriuose pasireiškė anksti apoptozę suma (aneksinu teigiamas) ir vėlyvas apoptozė (7-AAD teigiamas).}

ksenografiniuose nude Pelės Modelis

Xenografting GC ląstelių linijų buvo atlikta pagal nacionalines gaires dėl priežiūros ir naudojimo laboratorinių gyvūnų (leidinys Nr. 86-23, peržiūrėta 1985), buvo patvirtintas gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komiteto Trečiojo Xiangya ligoninė, Centrinis Pietų universiteto ( LLSC [TA] 2013-0010) ir atitiko dabartinės Kinijos įstatymus dėl gyvūnų apsaugos (LLSC [LA] 2013-0010). buvo dedamos visos pastangos, siekiant sumažinti naudojamų pelių ir jų kančias, skaičių.

Trisdešimt penki patinėliai BALB /c nuogas pelės amžiaus 4 iki 6 savaičių buvo įsigytas iš SLAC laboratorinių gyvūnų Co Ltd (Šanchajus, Kinija) ir įsikūręs atskirai vėdinamiems narvuose. Pelės buvo atsitiktinai suskirstyti į BGC823, BGC-NC, BGC2-13, MKN28, MKN28-NC, MKN28-EGFL7 ir kontroliuoti PBS grupes (N = 5 pelėms /grupė). Kultūringas ląstelės buvo nukirsta ir sumaišymo PBS esant 1 × 10 ^{8 ląstelių /0,2 ml. Suspensija buvo įšvirkščiamas po oda į kairėje viršutinėje galūnių kiekvieno nuogas pelės, išskyrus tuos, su kontroline grupe, kuri buvo suleistos su 0,2 ml PBS. Naviko augimo buvo įvertintas per 3 dienas matuojant auglio skersmens su Vernier žnyplių. Naviko tūris (televizija) buvo apskaičiuojamas pagal formulę: TV (mm 3) = D 2 × D /2, kur D ir D yra trumpiausias ir ilgiausias skersmuo, atitinkamai. Pelės buvo paaukotos per 4 savaites po ląstelių implantacijos, ir navikai buvo ekstrahuojamas ir pasverti. Visi kepenys buvo tiriama metastazių pagal hematoksilinu ir eozinu (H & E) dėmių. Navikai buvo nustatytas 10% formalino, įterptųjų parafinu ir supjaustyti į 4 mkm storio sekcijas. EGFL7 išraiška lėmė imunohistocheminiu, kaip aprašyta aukščiau.}

Statistinės analizės

Visi statistinės analizės buvo atlikta naudojant SPSS 16.0 versija (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), skirtas Windows. Duomenys pateikti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD) iš ne mažiau kaip trijų nepriklausomų eksperimentų. Grupė priemonės buvo lyginamos pagal vieną pusę dispersinė analizė (ANOVA) su Studentų Newman-Keuls (SNK) arba mažiausiai reikšmingas skirtumas (LSD) bandymų post hoc poros išmintingas palyginimų. Spearman koreliacijos koeficientas buvo siekiama nustatyti ryšį tarp EGFL7 ir EMT susijusių baltymų ekspresijos lygį koreliacijas chirurginiu akcizais apmokestinamų skrandžio vėžio audiniuose. P
< 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas

Rezultatai

EGFL7 išraiška buvo padidėjusi žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų

Vakarų dėmė ir RT-. PGR buvo atliekama palyginti EGFL7 išraišką žmogaus GC ląstelių linijų SGC7901, BGC823, MKN45 ir MKN28 į taip, kad įprastomis skrandžio gleivinės epitelio GES-1 ląstelių. Padidėjęs EGFL7 lygiai buvo rasta visuose keturiuose GC ląstelių linijų, palyginti su GES-1 su BGC823 ir MKN28 rodyti geriausius ir prasčiausius EGFL7 išraišką, atitinkamai, tiek baltymų ir iRNR lygiui (skaičiais 1A ir 1B). Todėl BGC823 ir MKN28 buvo naudojamos vėlesniais eksperimentais įvertinti EGFL7 raiškos poveikį dauginimosi, migracijos ir metastazavusiu potencialą. Mes dirbo stabiliai shRNR transfekcijq slopinti EGFL7 išraišką BGC823 ląsteles ir sukūrė žmogaus EGFL7 aukštos raiškos plazmidės (PEX-2-EGFL7) padidinti EGFL7 išraišką MKN28 ląsteles.

Mes pastatytas dviejų shRNR plazmidės vektorius orientacija EGFL7 iRNR ir atliko KRL PGR, įvertinti šių kandidačių shRNR sekų slopinti EGFL7 palyginti su nespecifinių sekų veiksmingumą. Į shRNA1 ir shRNA2 sekas pasiekti 75% ir 30% slopinimą EGFL7, atitinkamai (1c pav), todėl efektyviau shRNA1 buvo naudojamas visais vėlesniais eksperimentais. Į BGC823 linijos stabiliai transfektuotose pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 ar pGPU6 /GFP /Neo-nespecifinio-shRNR buvo paskirta BGC2-13 ir bgc-nc, atitinkamai. Į MKN28 linijos stabiliai perkeltų su PEX-2-EGFL7 ir PEX-2-nespecifinio buvo paskirta MKN28-EGFL7 ir MKN28-nc, atitinkamai. Sąvoka lygiai EGFL7 baltymų ir mRNR G418 atsparus klonai taip pat buvo įvertinta Vakarų dėmė (1d pav) ir realaus laiko AT-PGR (1E pav.) Rezultatai parodė, gerokai sumažėjo EGFL7 išraišką BGC2-13 ląstelių, palyginti su BGC-NC ląstelių ir žymiai padidėjusi išraišką MKN28-EGFL7 ląstelių, palyginti su MKN28-NC ląstelių (visi P
< 0,05). Nebuvo jokių reikšmingų skirtumų mRNR ir baltymų raiška tarp BGC-NC ir bgc ląstelių arba tarp MKN28-NC ir MKN28 ląstelių (visų P
> 0,05).

EGFL7 Paaukštintas GC Mobilusis invazija ir migracijos, tačiau neturėjo įtakos GC ląstelių proliferaciją

ištirti EGFL7 vaidmenį GC progresavimo, pirmiausia išnagrinėjo, ar EGFL7 triukšmo slopinimo arba padidėjusi pakeitė proliferacijos, invazinę ir migracijos gebėjimus GC ląsteles. Įbrėžimams žaizdų gijimas buvo naudojamas matuoti migraciją stabiliai transfekuotų ląstelių. Žaizdų buvo sugeneruotas per GC ląstelių monosluoksnių vieno nulio ir ląstelių skaičiaus nulio zonoje, palyginti 0 ir 48 val. Uždarymas žaizdos buvo žymiai lėtesnis BGC2-13 kultūrų (underexpressing EGFL7), palyginti su gimtąja BGC823 ir BGC-NC kultūrų (32% vs.
100% ir 98%, ir P
< 0,05) (2A pav). Priešingai, uždarymas buvo žymiai greičiau MKN28-EGFL7 kultūrų (ekspresija EGFL7), palyginti su MKN28 ir MKN28-NC kultūrų (99% vs.
49% ir 50%, ir P
< 0,05) (2B pav). Be to, likviduojama arčiau tuo šiek tiek laiko po nulio (48 h) buvo didesnis aukštos EGFL7 ekspresija laukinio tipo BGC823 ląsteles, palyginti su mažai išreikšti laukinio tipo MKN28 ląstelių, nurodant, kad endogeninių ekspresijos lygis taip pat įtakos migracijai.

Transwell tyrimai buvo atliekami siekiant patvirtinti šias išvadas ir toliau tirti EGFL7 poveikį invaziniam BGC823 ląstelių, MKN28 ląstelių, ir atitinkamų stabilių mimikos raukšlės į Matrigel potencialą. Yra žymiai buvo mažiau EGFL7-underexpressing (BGC2-13) ląstelės Matrigel palyginti su BGC-NC ir BGC823 ląstelių (25 ± 3,1, vs
76 ± 2,9 ir 79 ± 5,7 ląstelių /gerai;. P
< 0,05), nurodant, kad EGFL7 underexpression žymiai sumažėjo invazinių talpa (2c pav.) Panašiai BGC2-13 ląstelių pasiekė apatinę Matrigel be gerai transwell migracijos tyrimų skaičius buvo žymiai sumažintas, palyginti su BGC823 ir BGC-NC ląstelių (19 ± 1,1, vs.
53 ± 2,9 ir 54 ± 2,6 , tiek P
< 0,05) (2C pav.) Priešingai, EGFL7 ekspresija MKN28 ląstelių gerokai padidinti tiek invazija į Matrigel (MKN28-EGFL7: 79 ± 6.19 ląstelių /gerai, MKN28-NC: 40 ± 2,00 ląstelių /gerai, MKN28: 41 ± 4,22; abu p
< 0,05; 2D brėžinį) ir migracija (MKN28-EGFL7: 67 ± 4,16, MKN28-nc: 33 ± 5,92, MKN28: 35 ± 3,7; abu P
< 0,05; 2D brėžinį).

• PLoS ONE: a 346 Byla analizė Laparoskopinė Blužnis konservavimo Nr.10 limfmazgių skrodimo už Proksimalios skrandžio vėžys: vieno centro Study
• PLoS ONE: Padidėjusi atominės apoptozę sukeliančių Factor 1 pakeitė PROTEOMIKOS Profilio žmogaus skrandžio vėžio ląstelių MKN45 ir sukeltas ląstelės ciklo arešto metu G1 /S Phase