PLOS ONE: asociación exclusiva de la mutación de p53 con super alta metilación de genes supresores de tumores p53 en la vía en un único cáncer gástrico Phenotype

Extracto

Antecedentes

Una búsqueda exhaustiva de ADN metilado genes identificados genes supresores de tumores candidato que se han demostrado para participar en el proceso de apoptosis de la p53
vía. En este estudio, se investigó p53
mutación en relación con dicha alteración epigenética en el cáncer gástrico primario

Métodos

Los perfiles de metilación de los genes 3:. PGP9
. 5
, NMDAR2B
, y CCNA1
, que están involucrados en la vía supresora de tumores p53 en combinación con p53 mutación eran
examinado en 163 cánceres gástricos primarios. El efecto de la reversión epigenética en combinación con fármacos quimioterapéuticos sobre la apoptosis también se evaluó de acuerdo con el tumor estado de p53
mutación.

Resultados

p53 gen
se encontraron mutaciones en 44 tumores gástricos primarios (27%), y super-alta metilación de cualquiera de los 3 genes sólo se encontró en los casos de tipo salvaje p53
. Superior aberración p53
vía se encontró en los casos con el sexo masculino (p = 0,003), tipo intestinal (p = 0,005), y el tipo no-infiltrante (p = 0,001). El p53
grupo de la vía aberración exhibieron menos recurrencia en los ganglios linfáticos, órganos distantes, y el peritoneo que el p53
grupo no aberración. En la línea celular de cáncer gástrico NUGC4 ( p53 de tipo salvaje
), epigenética tratamiento aumentada la apoptosis de los fármacos quimioterapéuticos, parcialmente a través de p53
actividad de transcripción. Por otra parte, en la línea de KATO III de células de cáncer ( p53 mutante
), el tratamiento epigenético solo indujo apoptosis robusto, sin trans-activación de p53
.

conclusión

En el cáncer gástrico, p53
existen vías pertinentes y no pertinentes, y los tumores con cualquiera de los tipos vía exhibieron características clínicas únicas. tratamientos epigenéticos pueden inducir la apoptosis parcialmente a través de p53
activación, sin embargo, sus efectos apoptóticos puede explicarse en gran medida por un mecanismo que no sea a través de p53
vías

Visto:. Waraya M, Yamashita K, Ema a, Katada N, Kikuchi S, M Watanabe (2015) asociación exclusiva de p53
mutación con super alta metilación de genes supresores de tumores en el p53
Camino en un único gástrico Fenotipo cáncer. PLoS ONE 10 (10): e0139902. doi: 10.1371 /journal.pone.0139902

Editor: Qian Tao, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong

Recibido: Marzo 31, 2015; Aceptado: 18 Septiembre 2015; Publicado: 8 Octubre 2015

Derechos de Autor © 2015 Waraya et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención-en Ayudas a la Investigación del cáncer del Ministerio de Salud, trabajo y Bienestar de Japón y por la Fundación japonesa para la Tratamiento multidisciplinar del cáncer. Los organismos de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida de datos, o el análisis; en la interpretación de los resultados; en la preparación del manuscrito; o en la decisión de enviar el manuscrito para su publicación

Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

metilación del ADN desempeña un papel central en. el silenciamiento de genes de los genes supresores de tumores en el cáncer humano. Un gen metilación específica del cáncer es una entidad poco frecuente, y la aberración frecuente de metilación en los tejidos tumorales primarias es aún más raro [1, 2]. Hemos identificado los genes metilados específicos del cáncer en cada órgano utilizando un microarray farmacológica desenmascaramiento (PUM) [1, 2] y un PUM modificado [3-5]. Hemos identificado muchos genes supresores de tumores candidato (ETG), como PGP9
. 5 Hoteles en la cabeza y el carcinoma de células escamosas del cuello (CECC) [2], de esófago SCC (CECA) [6] , cáncer gástrico [4], y otros tipos de cáncer [7], NMDAR2B
en CECA [3] y el cáncer gástrico [8], y CCNA1 Hoteles en HNSCC [2]. Los perfiles de metilación de estos genes han sido validados por otros grupos y /o incluso en otros tipos de cáncer [9-14]. Genes que mostraron más del 60% de metilación en los tejidos tumorales fueron designados como genes altamente relevantes metilados (HRMGs) [15]. Por otra parte, se comparó además la frecuencia de tales metilación aberrante de HRMGs candidatos con otros informes de cáncer gástrico [16], y los genes candidatos se redujeron a genes específicos.

Lo más importante, estos genes supresores de tumores candidato había sido informado de que en el p53
vía supresora tumoral (figura 1). Por ejemplo, PGP9
. 5 de
interactúa directamente con p53
y estabiliza p53 fotos: por inhibición de su degradación a través de la ruta de ubiquitinación en hepatocelular [17] , de mama [18], y el cáncer nasofaríngeo [19]. NMDAR2B
induce apoptosis a través de su interacción directa con DAPK
[20], que, a su vez, se ha demostrado para contrarrestar transformación oncogén inducida por la activación de un p19ARF
/ p53 dependiente de
puesto de control de la apoptosis [21]. CCNA1
es un p53 inducida por
gen que media la apoptosis, G2 /M detención, y la catástrofe mitótica en renal humana, ovario y cáncer de pulmón de células [22]. Por lo tanto, el p53
vía es destruida en los tejidos tumorales de cáncer primario de manera epigenética, junto con el tipo salvaje p53
, sin embargo, no ha habido ningún informe con respecto a la asociación de p53
mutaciones y alteraciones epigenéticas en los tejidos tumorales primarios.

en este estudio, se investigó el estado de metilación del ADN de los genes en el p53
vía que son regulados de forma anormal de una manera epigenética en gástrico primario cáncer, y se compara su patrón de metilación con el estado de la mutación de p53
con el fin de determinar la importancia clínica de p53
aberración fenotipos.

Métodos

Cell
líneas y muestras de tejidos

las líneas celulares de cáncer gástrico, KATOIII, NUGC4, AZ521, y SH10 se adquirieron en el Centro RIKEN de bio (Ibaraki, Japón). Y la línea celular de carcinoma hepatocelular HepG2 se adquirió de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Estas líneas celulares, excepto AZ521 y HepG2 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA) suplementado con suero bovino fetal 10%. AZ521 y HepG2 se cultivaron en medio DMEM (GIBCO), suplementado con 10% FBS.

pares (n = 163) de, (FFPE) tejido tumoral fijado en formalina incluido en parafina y las correspondientes muestras de la mucosa normal obtenida en por lo menos 5 cm del borde del tumor fueron obtenidas de pacientes sometidos a cirugía entre el 1 de enero de 2000 y el 31 de diciembre de 2010. Todos los pacientes con estadio II /III GC se había sometido a una resección potencialmente curativa para la GC primaria, y se sometió a adyuvante S -1 quimioterapia después de la cirugía (S-1 tratamiento estándar). La terapia neoadyuvante no se realizó en esta cohorte de pacientes. Los tumores fueron clasificados de la clasificación TNM de acuerdo con el 7 ^{ª edición de la Unión Internacional contra el Cáncer (UICC) y la 14 ª edición de la Clasificación japonesa de carcinoma gástrico (JCGC). características de los pacientes se muestran en la Tabla 1. Se recogieron todas las muestras de tejido en el Hospital de la Universidad de Kitasato, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes y donantes sanos antes de la recogida de muestras. El presente estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Kitasato.}

Análisis de mutantes de p53
genes utilizando un solo polimorfismo de conformación de cadena sencilla (SSCP)

Las mutaciones en los exones 5, 6, 7 y 8 de la p53
genes fueron seleccionados mediante análisis no radiactivo polimorfismo de conformación de cadena sencilla (SSCP), que se realizó a través de nuestros métodos previamente establecidos [23]. muestras de productos de PCR de 10 l se diluyeron tres veces con tampón de carga de gel (95% de formamida desionizada, 20 mmol /l de EDTA, 0,01% de azul de bromofenol, y 0,01% xileno cianol) y se calentó a 95 ° C durante 10 min, seguido por enfriamiento rápido sobre hielo. Partes alícuotas de 3 l se aplicaron a geles de poliacrilamida modificados (PAFG: 18% de poliacrilamida-bis (49: 1), TBE 0,5x, 10% de glicerol, 10% de formamida, persulfato de amonio al 0,05%, y 30 ml TEMED) de dimensiones 120 mm x 150 mm x 0,35 mm. La electroforesis se realizó con TBE 1,5x tampón de corrida a 500 V y 30 mA durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas se detectaron mediante tinción de geles usando una tinción de plata plus kit (Bio-Rad, Hercules, CA), seguido de la fijación, enjuague, el desarrollo, y la parada de la reacción. bandas mutadas detectados con PCR-SSCP fueron evidentes a 1:64 dilución de alelos mutados.

tratamiento con bisulfito del ADN extraído

ADN genómico a partir de tejidos FFPE y líneas celulares fue extraído utilizando el QIAamp DNA FFPE kit Tissue (QIAGEN Sciences, Maryland, MD) y el kit QIAamp DNA Mini (QIAGEN) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Para la desnaturalización del ADN, 2 g de ADN genómico se incubó con 5 g de ADN de esperma de salmón en /l de NaOH 0,3 mol durante 20 minutos a 50 ° C. A continuación, la muestra de ADN se diluyó con 500 l de una solución que contiene 2,5 mol /l de metabisulfito de sodio (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO) /125 mmol /l de hidroquinona (Sigma) /solución de hidróxido de sodio /l 0,4 mol, y se incubó a 70 ° C durante 1,5 horas. La muestra se aplicó a una columna (Asistente de ADN de limpieza del sistema, Promega Inc., Madison, WI), se incubaron con /l de NaOH 0,3 mol durante 10 minutos, y posteriormente se trató con acetato de amonio /l 3 moles por 5 minutos. La muestra se precipitó en etanol al 100%, y el ADN se resuspendió en 50 l de LoTE que contiene 10 mM Tris-HCl, pH 8 y 2,5 M de etileno diamina tetra acético (EDTA), pH 8, y se amplificó posteriormente por una cadena de la polimerasa reacción (PCR). resultados tratamiento con bisulfito en la modificación química de no metiladas, pero no metilados, citosinas a uracilos, lo que permite la distinción entre el ADN genómico metilado y no metilado.

-Quantitative PCR específica de metilación (MSP-Q)

Para el análisis de la metilación cuantitativa, TaqMan PCR específica de metilación (MSP-Q) se llevó a cabo usando el iQ ™ Multiplex Powermix (Bio-Rad) por triplicado en el iCycler iQ ™ sistema de detección de PCR en tiempo real (Bio-Rad). Las condiciones de PCR y las secuencias se proporcionan en la Tabla S1. Diluciones seriadas de bisulfito modificados CpGenome ADN metilado universal (Chemicon International, Temecula, CA) se usaron para construir la curva de calibración en cada placa como controles positivos de metilación y el ADN no metilado universal de CpGenome (Chemicon International) se utilizó como control negativo. El valor de metilación (valor TaqMeth) se define como la relación entre metilado PGP9
. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
, o DAPK
normalizado a metilado β-actina
, que luego se multiplica por 100.

tinción inmunohistoquímica de PGP9.5, NMDAR2B y CCNA1

para la inmunotinción, desenmascaramiento de antígeno se realizó con remojo autoclave, la actividad de peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación en 3% H _{2O 2 /metanol durante 5 minutos, y la unión de anticuerpos no específica fue bloqueada por incubación con 1% diluido suero de caballo normal para 30 minutos. Las secciones se incubaron a continuación a 4 ° C durante la noche con los siguientes anticuerpos: anticuerpo policlonal de conejo PGP9.5 (dilución de 1:. 200, Nonus Biogénesis), anticuerpo de conejo policlonal NMDAR2B (dilución de 1: 100, Millipore), o el ratón ciclina A anticuerpo monoclonal (6E6, dilución de 1:50, Leica Biosystems Newcastle. Ltd). Los complejos inmunes se detectaron con el kit Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA) según las instrucciones del fabricante. Estos complejos inmunes se detectaron usando el sustrato 3,3'-diaminobenzidina (Vector) como cromógeno (PGP9.5 1,5 minutos, NMDAR2B 6 minutos, CCNA1 10 minutos). Las secciones fueron contrastadas con hematoxilina.}

Epigenético tratamiento con 5-Aza-dC y TSA, y el tratamiento quimioterapéutico con CDDP

Las células se dividieron y se sembraron a una densidad baja (1x10 ^{6 /matraz T-75) 24 horas antes del tratamiento. Las células fueron entonces tratadas cada 24 horas durante 4 días, ya sea con 1 o 5 M 5-aza-2 'desoxicitidina (5-Aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) disuelto en ácido acético al 50% o fueron tratados mock con PBS incluyendo la misma cantidad de ácido acético. Como se ha indicado, 100 nM de trichostatinA (TSA; Sigma-Aldrich). Y /o 12,5 M de cis-diaminodicloroplatino (CDDP) (Nichi-Iko Pharmaceutical Co., Ltd., Japón) se añadió a las 24 horas finales}

Western Blot análisis

proteína total fue extraído a partir de líneas celulares que fueron tratadas epigenetically con /sin tratamiento quimioterapéutico, y se sometió a análisis de transferencia de Western usando los siguientes anticuerpos: anticuerpo monoclonal anti-p53 de ratón (1C12, dilución de 1: 1000, Cell Signaling Technology, Inc.) o _{anticuerpo monoclonal 2a de ratón anti-β-actina IgG (dilución de 1: 10.000, Sigma-Aldrich)}

reportero de ensayo p53

Las células (2 x 10 ^{4 células /placa de 96 pocillos) que fueron tratados epigenetically con /sin tratamiento quimioterapéutico se transfectaron con un p53
vector informador (QIAGEN) utilizando kits Reporter señal ™ Pathway ( QIAGEN) y el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Después de 24 horas de incubación, se midió la actividad de reportero usando el sistema de ensayo Dual-Luciferase Reporter (Promega). Las transfecciones se realizaron por triplicado y se analizaron usando el software SoftMax Pro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).}

Apoptosis ensayo

Las células tratadas (1x 10 ^{5 células /muestra) se tiñeron con Anexina V y AAD 7-(reactivo Guava nexina, Guava Technologies, Hayward, CA) para la discriminación de células apoptóticas tempranas y tardías, respectivamente. El experimento se llevó a cabo utilizando el sistema PCA guayaba, realizado por triplicado y se analizó usando el software Cytosoft 2.1.5 (Guava Technologies).}

El análisis estadístico

La prueba exacta de Fisher o la prueba de Mann-Whitney se utilizó la prueba para las variables categóricas, y estudiante de t-test
se utilizó para las variables continuas. Los datos se expresan como media ± desviación estándar (SD). El método de Kaplan-Meier se utilizó para estimar las tasas de supervivencia acumulada, y las diferencias en las tasas de supervivencia se evaluó mediante la prueba de log-rank. la supervivencia libre de recaída (RFS) y la supervivencia global (SG) se midieron a partir de la fecha de la operación a la fecha de recurrencia y muerte, o el último seguimiento. Con respecto a la SSR o el sistema operativo, los pacientes que sobrevivieron durante más de 60 meses (5 años) se analizaron como sobrevivientes. P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Todos los análisis estadísticos se realizaron con los paquetes de software SAS (SAS Institute, Cary, NC).

Resultados

estado de metilación y los perfiles genéticos de p53
PGP9
. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
, y DAPK Hoteles en pStage II-III de cáncer gástrico

p53
se identificaron mutaciones en 44 de 163 pacientes con cáncer gástrico primario (27%) por análisis de SSPC. mutación p53
gen no tenían relevancia pronóstica (figura 2A). A continuación, analizó los perfiles de metilación de PGP9
. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
, y DAPK
en estos tejidos utilizando Q-MSP. El valor TaqMeth de todos los genes fue mayor en los tumores primarios de cáncer gástrico de tipo salvaje con p53
que en aquellos con p53
(orden de la metilación del gen mutante:. PGP9
5 Hotel > NMDAR2B Hotel > CCNA1 Hotel > DAPK
) (figura 3A y S1 y S2 figuras). La metilación del promotor de ADN fue significativamente mayor para CCNA1 gratis (p < 0,0001) y PGP9
5 gratis (p = 0,03), y marginalmente significativamente mayor para los NMDAR2B gratis (p = 0,10) y DAPK gratis (p = 0,05) en el cáncer gástrico primario en comparación con la mucosa normal correspondiente. Es importante destacar que un nivel de super-alta metilación de PGP9
. 5
, NMDAR2B
, y CCNA1
se encuentra exclusivamente en tumores primarios sin p53
de mutación, los valores TaqMeth de corte fueron de 50, 163, y 133, respectivamente (figura 3A). Tal súper alta metilación de PGP9
. 5
, NMDAR2B
y CCNA1
se encontró en el 14, 19 y 8 muestras, respectivamente, y algunas de estas muestras se solapaban (Fig 3B). DAPK
no mostraron esta tendencia, ya que el DAPK
nivel de metilación fue bastante alta en los correspondientes tejidos normales de la mucosa de una porción considerable de los casos (S2) Fig.

El análisis inmunohistoquímico de PGP9.5, NMDAR2N, y la expresión de la proteína en el cáncer gástrico CCNA1 primaria
, NAMDR2B y expresión de proteínas se llevó a CCNA1

tinción inmunohistoquímica para PGP9.5 entonces a cabo tanto en los casos de super-alta y los metilación con baja metilación de estos genes. Se observó una fuerte reducción en la expresión de PGP9.5, NMDAR2B y CCNA1 en tejidos de cáncer gástrico primario cuando el promotor de la metilación de ADN era súper alta (Fig 3). Por otro lado, no se encontró una disminución en la expresión de la proteína de PGP9.5, NMDAR2B, o CCNA1 cuando el promotor de la metilación del ADN fue baja (figura 4).

Análisis clínico-patológica en el cáncer gástrico primario con el estadio patológico II /cáncer gástrico III con el tratamiento estándar

características clinicopatológicas y el pronóstico (RFS 5 años y OS) a continuación se analizaron de forma univariable en el cáncer gástrico con el estadio patológico cáncer gástrico II /III con el tratamiento estándar (cirugía más postoperatoria S-1 de la administración) (Tabla 1). Se clasificaron los pacientes con cáncer gástrico en 3 categorías en función de la p53 estado de mutación
, así como el estado de metilación del ADN de PGP9
. 5
, NMDAR2B
y CCNA1
, que hemos designado como categorías genómicas y epigenéticos, respectivamente (GEC). Estas tres categorías fueron p53 mutante
, p53 de tipo salvaje
con súper alta metilación (SHM) de los 3 genes p53
vía anteriores ( p53
WT /SHM), y p53 de tipo salvaje y sin
(w /o) SHM ( p53
WT w /o SHM).

Curiosamente, los grupos de pacientes clasificado basandose en GECS se correlacionaron significativamente con el sexo (p = 0,0003), la edad (p = 0,08), la histología de Lauren (p = 0,005) y el patrón de infiltración (p = 0,001), pero no con factores pronósticos como factores de parada. Los grupos de pacientes clasificados de acuerdo con GECS también mostró que p53 mutante
y p53 Barcelona Grupos WT /SHM eran similares en términos del número de pacientes para cada característica clínica, pero diferían en este sentido en comparación con el p53
WT w /o grupo SHM. Por lo tanto, se acaba de designar los antiguos grupos ( p53 mutante
más los p53
WT /grupos SHM) como el p53 grupo
aberración, y el último grupo ( p53
WT w /O MAS) fue designado como el p53
grupo no aberración.

a pesar de que el pronóstico no fue significativamente diferente entre los grupos categorizados de acuerdo con GEC (figura 2B ), se encontraron más recurrencias en el p53
grupo aberraciones en comparación con el p53
grupo no aberración (Tabla 1, una diferencia estadísticamente significativa). Esta tendencia se conserva en términos del patrón de repetición de cada uno de los ganglios linfáticos, el peritoneo y órganos distantes (Tabla 2), lo que sugiere que la es probable que exhiben un fenotipo clínicamente único, incluso de un grupo p53
aberración punto de vista pronóstico. Cuando se analizaron sólo los casos con recidivas, el p53 grupo
aberración fue nuevamente asociaron significativamente con la histología de Lauren (Tabla 2; p = 0,01), sin embargo no hubo patrones de repetición que eran únicas a p53
aberración.

por otro lado, el tipo de cáncer gástrico difuso mostraron significativamente mejor pronóstico que el tipo intestinal de cáncer gástrico en el p53 grupo
aberración (figura 5A). Puesto que tales pacientes tendían a ser distribuidos a una etapa más avanzada, estos datos de supervivencia sugieren que la quimioterapia adyuvante postoperatoria S1 es más eficaz para el cáncer gástrico de tipo difuso que para el cáncer gástrico de tipo intestinal en casos de p53
vía aberración (Fig 5B).

por último, como datos de referencia (Tabla 1), el análisis univariable de pronóstico para la SSR y la SG de todos los pacientes identificados los factores pronósticos potenciales clínicamente significativa que representa una baja supervivencia tales como el sexo (p = 0,03, p = 0,1) , edad ≥ 67 años (p = 0,009, p = 0,001), la localización del tumor superior (P = 0,06, p = 0,1), el 14 ^{º JGCA /7 º UICC pt (P = 0,08; p = 0.4), la 14 º JGCA pN (P = 0,001, P = 0,06), y el 14 º JGCA /7 ª etapa de la UICC (P <. 0,0001, p = 0,03)}

tratamiento inducida expresión de la proteína p53 epigenética, concordante con la actividad transcripcional de p53

epigenético tratamiento de líneas celulares de cáncer gástrico NUGC4 (tipo salvaje p53
) con 5 M 5-aza-2' desoxicitidina o 5 M 5-aza-2 'desoxicitidina más tricostatina a apoptosis inducida robustamente en ausencia del agente quimioterapéutico CDDP. El tratamiento adicional con CDDP ve aumentada significativamente estos efectos apoptóticos (Figura 6C). Curiosamente, CDDP en combinación con tratamientos epigenéticos robustamente aumentó el nivel de la proteína p53, que parcialmente, pero no totalmente, que se refleja p53
actividad transcripcional de un gen indicador de luciferasa (Fig 6A y 6B). Estos resultados sugirieron que actividad de transcripción p53
puede ser reactivado por los tratamientos epigenéticos, sin embargo, también sugiere que la apoptosis inducida es sólo parcialmente a través del p53
vía.

Por otra parte, epigenética tratamiento de las líneas celulares de cáncer gástrico KATOIII ( p53
null), con 1 M 5-aza-2 'desoxicitidina o 1 M 5-aza-2' desoxicitidina más tricostatina a apoptosis inducida robustamente en ausencia de CDDP, pero el tratamiento adicional CDDP no más aumentan significativamente los efectos apoptóticos (figura 6C). CDDP en combinación con los tratamientos epigenéticos no aumentó el nivel de la proteína p53, que se refleja en la falta de p53
la actividad de transcripción de un gen indicador de luciferasa (Figura 6A y 6B). Estos resultados sugirieron que No se requiere la actividad de p53
la transcripción de la apoptosis mediante tratamientos epigenéticos en las células KATOIII ( p53
células nulas).

Discusión

Este presente estudio es el primer informe que SHM de genes supresores de tumores en el p53
vía se encuentran exclusivamente en el estadio patológico II /III con cáncer gástrico de tipo salvaje p53 gratis (figura 3). Hemos seleccionado pStage II /III de pacientes con cáncer gástrico con los tratamientos estándar para Análisis de p53
vía, ya que los tratamientos multidisciplinares en estos pacientes tienen el mayor potencial para la consecución de la mejora de pronóstico con total posibilidad de curación [24, 25]. Esta consideración debe ser la primera prioridad al considerar un mayor desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

Se requiere metilación casi completa del promotor islas CpG de ADN para la completa silenciamiento de genes, e incluso pequeñas proporciones de alelos metilados puede inducir robusta expresión de genes [ ,,,0],1-5]. En los tejidos de tumor primario, SHM debe representar metilación casi completa en células de cáncer, y SHM en los tejidos de tumor primario fue de hecho asociado con la expresión de proteínas reducida de tales genes (Fig 4). Este resultado sugiere que SHM de genes en el p53
vía podría ser funcionalmente equivalente a p53
aberración funcional que se produce como resultado de p53
mutación, ya que estos 3 moléculas funcionan de la misma p53
vía.

en el cáncer gástrico, el p53
grupo aberraciones se asoció significativamente con fenotipos clinicopatológicos únicas, tales como la histología intestinal de Lauren, sexo masculino, la edad la edad, y el crecimiento infiltrativo menos (Tabla 1). Nuestras observaciones actuales pueden estar relacionados con los informes previos que demostraron que p53
mutación se correlaciona con la etapa temprana de cáncer gástrico de tipo intestinal, o con la última etapa de cáncer gástrico difuso tipo [26, 27], o de edad avanzada [ ,,,0],28], sin embargo, nuestro análisis clínico-patológico incluye principalmente el cáncer gástrico en la etapa intermedia. Curiosamente, la aberración vía es única y se mantiene incluso en pacientes recurrentes (Tabla 2).

relevancia pronóstica positiva de p53
mutación en el cáncer gástrico es objeto de controversia con los partidarios [29] y los disidentes [30 ] de esta posibilidad. A primera vista parecería nuestros datos para apoyar este último grupo, sin embargo, se debe tener en cuenta que es probable que han sido modificados por la quimioterapia adyuvante post-operatorio (terapia estándar en Japón) nuestros datos de supervivencia. Considerando que, en contraste con el presente estudio, el tipo difuso de cáncer gástrico mostró peor pronóstico que el tipo intestinal de cáncer gástrico en nuestras décadas hospital hace [15, 31], los datos de supervivencia últimas actualizaciones apoyan los resultados opuestos (es decir, el intestinal tipo de cáncer gástrico muestra peor pronóstico que el tipo difuso de cáncer gástrico), que es supuestamente debido a S-1 efectos adyuvantes postoperatorias [32]. Postoperatoria adyuvante S-1 de la quimioterapia se ha propuesto ser significativamente más eficaz para la enfermedad peritoneal que para la metástasis órgano distante [24], y es probable que sea más eficaz para el cáncer gástrico de tipo difuso que para el cáncer gástrico de tipo intestinal [32] . Por estas razones, la más reciente análisis de supervivencia indica que el pronóstico del tipo de cáncer gástrico difuso es mejorada sobre la del tipo intestinal del cáncer gástrico.

No hubo diferencia estadísticamente significativa en la tasa de recurrencia o en el único sitios de recurrencia entre el p53 grupo
aberración y el p53
grupo no aberración, sin embargo, más recurrencias fueron encontrados en cada uno de los sitios de recurrencia de la p53
no aberración en comparación con el grupo p53
grupo aberración. Estos resultados podrían sugerir que el p53
grupo no aberración tiene un fenotipo más agresivo que el p53
grupo aberraciones en su conjunto. En nuestro estudio, el tipo de cáncer gástrico difuso mostró significativamente mejor pronóstico que el tipo intestinal de cáncer gástrico en el p53
grupo aberración. Puesto que tales pacientes tendían a ser distribuidos a una etapa más avanzada, estos datos sugieren que la supervivencia S1 quimioterapia adyuvante postoperatoria es más eficaz para el cáncer gástrico de tipo difuso que para el cáncer gástrico de tipo intestinal en casos de p53
vía aberración. Estos resultados fueron consistentes con los informes anteriores de que mutante p53
y /o la inmunotinción de la proteína p53 podría ser biomarcadores predictivos de los efectos positivos de altas dosis de quimioterapia neoadyuvante en el cáncer gástrico [30].

finalmente evaluaron los efectos del tratamiento epigenéticos en combinación con un agente quimioterapéutico a fin de comparar la importancia de la p53
vía a la vía epigenética en células de cáncer gástrico tratados con CDDP. Inesperadamente, parecía que el p53
vía era poco probable que juegue un papel muy importante en la inducción de apoptosis por CDDP (figura 6). Se demostró recientemente que la carcinogénesis epigenética es posible. En este sistema, iPS sistémica inducida mediante la reprogramación de factores da lugar a la ocurrencia de cáncer sistémico con cambios epigenéticos dinámicos, mientras que reversión sistémica de estos factores de reprogramación vuelve las células de cáncer en las células normales [33]. El cáncer gástrico es susceptibles de albergar menos mutaciones de los genes controladores [34] que el cáncer colorrectal [35], y, de manera similar, las mutaciones distintas de la p53
gen son raros en el cáncer de mama [35], lo que sugiere que la carcinogénesis epigenética es una posible etiología importante a través de la infección crónica por Helicobacter Pylori [36-38]. Recientemente hemos demostrado la hiper-metilación de Reprimo
[39], que a su vez es un gen en el p53
vía, pero que no pudieron ser incluidos en este estudio, y de HOPX
[16] y CDO1
[40] que están ambos implicados en la apoptosis, pero supuestamente no a través del p53
vía. En base a los experimentos funcionales actuales, es probable que sea mucho menor que la de otras vías de la p53
vía de contribución a los efectos del tratamiento epigenéticos (Fig 5). Utilizamos otras líneas celulares (2 líneas celulares de cáncer gástrico y 1 línea celular de cáncer hepatocelular) para determinar con precisión la contribución de la p53
vía a la apoptosis inducida por CDDP en combinación con los tratamientos epigenéticos. Los experimentos adicionales realizados se muestran en la Fig S3. líneas de células HepG2 son AZ521 y p53
tipo salvaje, y la línea celular SH10 es p53 mutante
. se detectó la actividad de p53
en el p53
células de tipo salvaje, sin embargo, su actividad era dependiente de cada línea celular. Por lo tanto, se detectó p53
actividad en las células NUGC4 con CDDP tratamiento y en las células HepG2 AZ521 y sin tratamiento con CDDP. apoptosis fuerte como se evaluó mediante un ensayo de apoptosis (caspasa 3 o nexina Ensayo) no refleja necesariamente el grado de p53
activación transcripcional. En p53
mutante (SH10) o células nulas p53
, p53
actividad transcripcional no fue inducida en todos, se encontró sin embargo apoptosis ser similar a la de p53
células de tipo salvaje. Por lo tanto, en el cáncer gástrico, otras vías de apoptosis que el p53
vía puede ser más relevante para la inducción de la apoptosis de la p53
vía.

En conclusión,
p53 grupos de pacientes no aberración aberración y existen en el cáncer gástrico, la p53
vías podría ser aberrante como resultado de la modificación epigenética de genes en las vías, así como debido a la mutación genómica. El p53
grupo de aberración puede exhibir características clínicas únicas en comparación con el p53
grupo no aberración. control epigenético de la genes p53
vía desempeñan un papel menor en la inducción de apoptosis por un agente quimioterapéutico, y la apoptosis en el cáncer gástrico que es inducida por la reversión epigenética puede explicarse en gran medida por un mecanismo que no sea el p53
vía. Por lo tanto, la p53
vía es poco probable que juegue un papel fundamental en la apoptosis inducida por CDDP en combinación con tratamientos epigenéticos. Sin embargo, el p53
vía se ha informado a desempeñar un papel importante en la carcinogénesis gástrica naturales [41-44]. Por lo tanto, nuestro descubrimiento de que p53
gen de la ruta de metilación se encuentra exclusivamente en el cáncer gástrico con un p53
estado de tipo salvaje puede ser una observación importante, y tales alteraciones en los tejidos tumorales pueden causar la progresión del tumor . Es por estas razones que p53
vía aberración puede tener valor predictivo de los efectos de quimioterapia en el cáncer gástrico.

Apoyo a la Información
S1 Fig. La especificidad de la metilación de PGP9
. 5
, NMDAR2B
, y CCNA1
en el cáncer gástrico.
Los valores (A) TaqMeth de cada gen en el cáncer gástrico y en la mucosa normal correspondiente se muestran. (B) Los valores de cada gen TaqMeth clasificados de acuerdo con el p53
estado del gen del tumor se muestran. Los datos se expresan como media ± SD
doi:. 10.1371 /journal.pone.0139902.s001 gratis (TIF)
S2 Fig.

• PLOS ONE: expresión desregulada de SRC, Lyn y CKB quinasas mediante la metilación del ADN y su posible papel en el cáncer gástrico capacidad de invasión y metástasis
• PLOS ONE: La variación genética en la región 3 'no traducida del gen NBN se asocia con el cáncer gástrico riesgo en una población china