PLoS ONE: Эксклюзивная Ассоциация p53 Мутации с сверхвысокие Метилирование опухолевый супрессор Гены в Pathway р53 в уникальном Желудочный Рак Phenotype

Абстрактный

Фон
<р> Комплексный поиск ДНК метилируется генов, идентифицированных генов-кандидатов-супрессоры, которые были доказаны, чтобы принять участие в апоптозе процессе р53
пути. В данном исследовании мы исследовали p53
мутации по отношению к такому эпигенетического изменения в первичном раке желудка

Методы
<р> метилирования профили 3 генов:. PGP9
. 5
, NMDAR2B
, и CCNA1
, которые участвуют в опухоли р53 супрессоров пути в сочетании с р53
мутации были исследовали в 163 первичного рака желудка. Эффект эпигенетической реверсии в сочетании с химиотерапевтических препаратов на апоптоз также оценивали в соответствии с опухолью p53 статус
мутации.

Результаты

гена р53
мутации были обнаружены в 44 первичных опухолей желудка (27%), и сверхвысокого метилирование любого из 3-х генов найден только в тех случаях, с диким типом p53
. Высшее p53
путь аберрация был найден в случаях с мужским полом (р = 0,003), кишечного типа (р = 0,005), а также типа, не Проникнув (р = 0,001). p53
путь аберрация группы выставлены меньше рецидивов в лимфатические узлы, отдаленные органы и брюшину, чем P53
без аберраций группы. В желудочном линии клеток рака NUGC4 ( p53
дикого типа), эпигенетические лечение дополненной апоптозом химиотерапевтических препаратов, частично через p53
транскрипционной активности. С другой стороны, в линии раковых клеток КАТО III ( р53
мутант), эпигенетические только в лечении индуцированной надежной апоптозу, без транс-активации р53
.

Вывод изображения <р> При раке желудка, p53
существуют соответствующие и не соответствующие пути, и опухоли с любым типом затрагивающего пути выставлены уникальные клинические особенности. Эпигенетические процедуры могут вызывать апоптоз частично через активация p53
, однако их апоптотических эффекты могут быть объяснены в значительной степени иным механизмом, чем через p53
пути
<р> Citation:. Waraya M, Ямашита K, ЕМА, Katada N, Кикучи S, M Ватанабе (2015) Эксклюзив Ассоциация p53
Мутация с сверхвысокие Метилирование опухолевый супрессор Гены в p53
Pathway в уникальном желудочной Рак фенотип. PLoS ONE 10 (10): e0139902. DOI: 10.1371 /journal.pone.0139902
<р> Редактор: Цянь Тао, Китайский университет Гонконга, Гонконг
<р> поступила: 31 марта 2015; Принято: 18 сентября, 2015 года; Опубликовано 8 октября 2015
<р> Copyright: © 2015 Waraya и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> Финансирование:. Эта работа была частично поддержана грантом-в помощи по исследованию рака Министерства здравоохранения, труда и благосостояния Японии и японского Фонда Многопрофильная Лечение рака. Финансирующие учреждения не имели никакой роли в разработке дизайна исследования, сбор данных, или анализ; в интерпретации полученных результатов; в подготовке рукописи; или в решении подать рукопись для публикации
<р> Конкурирующие интересы:. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> метилирование ДНК играет центральную роль в. ген глушителей генов-супрессоров в раковых заболеваний человека. Ген метилирование канцер-специфической является редкой сущностью, и частое аберрация метилирования в первичных опухолевых тканей еще реже [1, 2]. Мы определили рак специфических метилированных генов в каждом органе, используя фармакологический разоблачающий микрочипов (PUM) [1, 2] и модифицированный ГПМ [3-5]. Мы идентифицировали много генов-кандидатов (супрессоры опухолей TSGs), такие как PGP9
. 5
головы и шеи плоскоклеточный рак (ПРГШ) [2], относящийся к пищеводу SCC (ЕШКО) [6] , рак желудка [4], а также другие виды рака [7], NMDAR2B
в ККСЭ [3] и рака желудка [8], и CCNA1
в ПРГШ [2]. Метилирования профили этих генов были подтверждены другими группами и /или даже в других видов рака [9-14]. Гены, которые характеризовались более 60% метилирования в опухолевых тканях были назначены в качестве наиболее релевантных метилированных генов (HRMGs) [15]. Кроме того, мы дополнительно сравнили частоту такого аберрантных метилирования кандидата HRMGs с другими сообщениями о раке желудка [16], и кандидаты генные сужен до специфических генов.
<Р> Самое главное, что эти гены-супрессоры опухолей кандидат был сообщается, что в p53
супрессоров опухолей пути (рис 1). Например, PGP9
. 5
непосредственно взаимодействует с p53
и стабилизирует р53
путем ингибирования его деградации через убиквитинирование пути в гепатоцеллюлярной [17] , молочной железы [18], и рак носоглотки [19]. NMDAR2B
индуцирует апоптоз через прямое взаимодействие с DAPK
[20], который, в свою очередь, было продемонстрировано, чтобы противодействовать онкогена-индуцированной трансформации путем активации p19ARF
/ p53
-зависимые апоптический контрольной точки [21]. CCNA1
является p53
гена, индуцированного апоптоза, посредничает /M арест G2 и митотической катастрофы в человеческой почек, яичников и клеток рака легких [22]. Следовательно, p53
путь является абляции в опухолевых тканях первичных раковых образований в эпигенетической образом вместе с диким типом p53
, однако не было никаких сообщений относительно ассоциации p53
мутации и эпигенетические изменения в первичных опухолевых тканях.
<р> в данном исследовании мы исследовали статус метилирования ДНК генов в p53
пути, которые неправильно регулируются эпигенетическом образом в первичной желудка рак, и сравнили их метилирования с p53
мутационный статус для того, чтобы определить клиническое значение p53
аберраций фенотипов.

Методы

Cell линии и образцы ткани
<р> желудочные клеточные линии рака, KatoIII, NUGC4, AZ521 и SH10 были приобретены у RIKEN биоресурсные центра (Ибараки, Япония). И печеночно-клеточная линия карциномы HepG2 был приобретен у American Type Culture Collection (Manassas, VA). Эти клеточные линии за исключением AZ521 и HepG2 выращивали в среде RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки. AZ521 и HepG2 выращивали в среде DMEM (Gibco), дополненной 10% FBS
. <Р> пар (N = 163) из фиксированных формалином, парафин (FFPE) опухолевой ткани и соответствующие нормальные мукозные образцов, полученных при не менее 5 см от края опухоли были получены от пациентов, перенесших операцию в период с 1 января 2000 года и 31 декабря 2010 г. Все пациенты с II стадии /III GC подверглись потенциально целебное резекцию первичного GC, и подвергся адъювантной S -1 химиотерапии после операции (S-1 стандартное лечение). Нео-адъювантной терапии не проводилось в этой группе пациентов. Опухоли были классифицированы с использованием классификации TNM в соответствии с 7 ^{е издание Союза по международному контролю рака (UICC) и 14 е издание японской классификации Желудочный карцинома (JCGC). Характеристики пациентов приведены в таблице 1. Все образцы ткани были собраны в больнице Сибасабуро университета, а также письменное информированное согласие было получено от всех пациентов и здоровых доноров до взятия пробы. Настоящее исследование было одобрено Комитетом по этике Сибасабуро университета им.}

Анализ мутировавших генов р53
использованием одноцепочечной конформационного полиморфизма (SSCP)

Мутации в экзонов 5, 6, 7 и 8 гена
р53 скринировали с помощью нерадиоактивного однонитевые конформационного полиморфизма (SSCP) анализа, который проводили с использованием наших ранее принятых методов [23]. ПЦР-образцы продукта 10 мкл разбавляли в три раза с гелем-загрузочным буфером (95% деионизированной формамида, 20 ммоль /л ЭДТА, 0,01% бромфенолового синего, и 0,01% cyanol ксилол) и нагревали до 95 ° С в течение 10 мин, с последующим гашением на льду. Аликвоты по 3 мкл наносили на модифицированных гелей полиакриламид (PAFG: 18% -ном полиакриламидном-бис (49: 1), 0.5x КЭ, 10% глицерина, 10% формамид, 0,05% персульфата аммония и 30 мл TEMED) размерностей 120 мм х 150 мм х 0,35 мм. Электрофорез проводили с 1,5х ТВЕ проточном буфере при напряжении 500 В и 30 мА в течение 1 часа при комнатной температуре. Полосы были обнаружены с помощью окрашивания гелей с использованием окрашивания серебром плюс набор (Bio-Rad, Hercules, CA), с последующим закреплением, полоскание, развития и прекращения реакции. Мутантные полосы, обнаруженные с PCR-SSCP были очевидны при разведении 1:64 мутантных аллелей.

бисульфит лечение извлеченной ДНК
<р> геномной ДНК из тканей FFPE и клеточных линий экстрагировали с помощью QIAamp ДНК FFPE Ткань (Qiagen наук, Мэриленд, MD), и QIAamp ДНК Mini Kit (Qiagen) в соответствии с протоколами производителя. Для денатурации ДНК, 2 мкг геномной ДНК инкубировали с 5 мкг ДНК спермы лосося, в 0,3 моль /л NaOH в течение 20 мин при 50 ° C. Образец ДНК затем разбавляют 500 мкл раствора, содержащего 2,5 моль /л метабисульфит натрия (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, МО) /125 ммоль /л гидрохинона (Sigma) /0,4 моль /л раствора гидроксида натрия, и инкубировали при 70 ° С в течение 1,5 часов. Образец затем наносили на колонку с (мастер ДНК очистку системы, Promega Inc., Madison, WI), инкубировали с 0,3 моль /л NaOH в течение 10 мин, а затем обрабатывают 3 моль /л ацетата аммония в течение 5 минут. Образец осаждают в 100% этаноле, а ДНК ресуспендировали в 50 мкл LOTE, содержащем 10 мкМ Трис-HCl, рН 8 и 2,5 мкМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), рН 8, а затем был амплифицирован с помощью полимеразной цепной реакция (ПЦР). Бисульфит обработка приводит к химической модификации неметилированных, но не метилированных, цитозина до урацила, что позволяет различия между денатурированного и неметилированной геномной ДНК.

Количественное-метилирование-специфической ПЦР (Q-ПНС)
<р> Для количественного анализа метилирования, TaqMan метилирования специфической ПЦР (Q-ПНС) проводили с помощью IQ ™ Multiplex Powermix (Bio-Rad) в трех экземплярах на прибора Icycler IQ ™ в режиме реального времени система обнаружения ПЦР (Bio-Rad). Условия ПЦР и последовательности представлены в таблице S1. Серийные разведения бисульфит модифицированный CpGenome универсальный метилированных ДНК (Хемикон Интернэшнл, Temecula, CA), были использованы для построения калибровочной кривой на каждой пластине в качестве положительного контроля метилирования и CpGenome универсальный неметилированная ДНК (Хемикон Интернэшнл) был использован в качестве отрицательного контроля. Значение метилирование (значение TaqMeth) определялась как отношение метилируется PGP9
. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
или DAPK
нормированы на метилированного бета-актина
, которая затем умножается на 100.

иммуногистохимическое окрашивание PGP9.5, NMDAR2B и CCNA1
<р> для иммунным окрашиванием, демаскации антигена проводили с автоклавной замачивания, эндогенная активность пероксидазы блокировали путем инкубации в 3% Н <к югу> 2O <суб> 2 /метанол в течение 5 минут, и связывание неспецифических антител блокировали путем инкубации с 1% разбавленным нормальной лошадиной сыворотки в течение 30 минут. Затем срезы инкубировали при 4 ° С в течение ночи со следующими антителами: кролик PGP9.5 поликлональных антител (разведение 1:. 200, Nonus биогенезом), кролик NMDAR2B поликлональных антител (разведение 1: 100, Millipore), или мышь циклин моноклональное антитело (6E6, разведение 1:50, Leica Biosystems Ньюкасл. Ltd). Иммунные комплексы были обнаружены с комплектом Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Эти иммунные комплексы были обнаружены с использованием 3,3'-диаминобензидина субстрат (Vector) в качестве хромогена (PGP9.5 1,5 минуты, NMDAR2B 6 минут, CCNA1 10 минут). Срезы контрастировали гематоксилином.

Лечение Эпигенетическое с 5-аза-ПСТ и АСП и химиотерапевтического лечения с ЦДДП
<р> Клетки были разделены и высевали при низкой плотности (1x10 6 /Т-75 колбу) за 24 ч до обработки. Затем клетки обрабатывали каждые 24 часа в течение 4-х дней с 1 или 5 мкМ 5-аза-2'-дезоксицитидин (5-аза-ПСТ; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури), растворенного в 50% -ной уксусной кислоты, или были обработаны фиктивный ФБР, в том числе и такое же количество уксусной кислоты. Как указывалось выше, 100 нМ trichostatinA (TSA, Sigma-Aldrich). И /или 12,5 мкМ Cis-diaminedichloroplatinum (CDDP) (Ници-Ико Pharmaceutical Co., Ltd., Япония) была добавлена ​​для заключительных 24 часов

Вестерн-блоттинга
<р> Общий белок экстрагируют из клеточных линий, которые были эпигенетически, обработанных с /без химиотерапевтического лечения, и подвергали Вестерн-блоттинга с использованием следующих антител: мышиного анти-р53 моноклональные антитела (1C12, разведение 1: 1000, Cell Signaling Technology, Inc.) или мышиное анти-β-актина IgG <суб> 2a моноклональное антитело (разведение 1: 10000, Sigma-Aldrich)

p53 репортер анализ <р> клетки (2x 10 ^{4 клеток /96-луночный планшет), которые были обработаны эпигенетически с /без химиотерапевтического лечения трансфицировали с p53
репортер вектор (QIAGEN) с помощью Reporter ™ комплекты сигнала Pathway ( Qiagen) и реагент Липофектамин 2000 (Invitrogen). После 24 часов инкубации, репортер активность измеряли с помощью двойного люциферазы систему анализа (Promega). Трансфекция были выполнены в трех экземплярах и проанализированы с помощью программного обеспечения SoftMax Pro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).}

Апоптоз анализ
<р> Обработанные клетки (1x 10 5 клеток /образец) окрашивали аннексина V и 7-AAD (реагент гуавы нексин, гуавы Technologies, Hayward, CA) для дискриминации ранних и поздних апоптотических клеток соответственно. Эксперимент проводился с использованием PCA системы гуава, выполненную в трех экземплярах и проанализированы с помощью CytoSoft 2.1.5 программного обеспечения (гуавы Technologies).

Статистический анализ
<р> точный критерий Фишера или Манна-Уитни U тест был использован для категориальных переменных и Студента т
-test использовали для непрерывных переменных. Данные выражены в виде средних значений ± стандартное отклонение (SD). Метод Каплана-Мейера использовали для оценки совокупных показателей выживаемости, а также различия в показателях выживаемости оценивали с помощью лог-рангового теста. Безрецидивная выживаемость (RFS) и общей выживаемости (ОВ) были измерены с даты операции до даты рецидива и смерти, или последнего наблюдения. Что касается RFS или ОС, пациенты, которые выжили в течение более чем 60 месяцев (5-лет) были проанализированы в живых. Р &л; 0,05 рассматривалось как для обозначения статистической значимости. Все статистические анализы были проведены с программными пакетами SAS (SAS Institute, Cary, NC).

Результаты

p53 ген
статус и профили метилирования PGP9 <бр>. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
и DAPK
в pStage II-III желудка
рака

p53
мутации были выявлены в 44 из 163 первичных больных раком желудка (27%) с помощью анализа SSPC. мутации гена р53
не имеет прогностическое значение (рис 2А). Затем мы проанализировали профили метилирования PGP9
. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
, и DAPK
в этих тканях с помощью Q-ПМП. Значение TaqMeth всех генов была выше в первичных опухолях рака желудка с диким типом p53
чем у пациентов с мутантным p53
(порядка метилирования генов:. PGP9
5
> NMDAR2B
> CCNA1
> DAPK
) (рис 3А и S1 и S2 рис). Метилирование ДНК промотора была значительно выше CCNA1
(р &л; 0,0001) и PGP9
5
(р = 0,03), и незначительно значительно выше NMDAR2B
(р = 0,10) и DAPK
(р = 0,05) в первичном раке желудка по сравнению с соответствующей нормальной слизистой оболочки. Важно отметить, что супер-высокий уровень метилирования PGP9
. 5
, NMDAR2B
и CCNA1
был исключительно найден в первичных опухолях с нет p53
мутации, Пороговые значения TaqMeth были 50, 163 и 133, соответственно (рис 3А). Такой сверхвысокий метилирование PGP9
. 5
, NMDAR2B
и CCNA1
был найден в 14, 19 и 8 образцов соответственно, и некоторые из этих образцов были перекрытием (фиг.3В). DAPK
не показывать эту тенденцию, потому что DAPK
уровень метилирования был достаточно высок в соответствующих нормальных тканях слизистой оболочки значительной части случаев (S2) Рис.

иммуногистохимический анализ PGP9.5, NMDAR2N и экспрессии белка в CCNA1 первичного рака желудка
<р> иммуногистохимического окрашивания для PGP9.5, NAMDR2B и экспрессия белка CCNA1 затем проводили как в случаях с сверхвысоким метилирования и тех, с низкой метилирования этих генов. Сильное снижение экспрессии PGP9.5, NMDAR2B и CCNA1 наблюдалось в первичных раковых тканей желудка, когда метилирование ДНК промотора сверхвысокого (рис 3). С другой стороны, ни снижение экспрессии белка PGP9.5, NMDAR2B или CCNA1 обнаружено не было, когда метилирование промотора ДНК была низкой (Рис.4).

клинико-патологическими анализа в первичном раке желудка с II патологической стадии /III рак желудка с помощью стандартного лечения
<р> особенности и клинико-патологическими прогноз (5-летний RFS и ОС) были затем проанализированы в univariable образом при раке желудка с патологической стадии II /III рак желудка со стандартным лечением (операции плюс послеоперационные S-1 введение) (таблица 1). Мы классифицировали больных раком желудка на 3 категории, основанные на p53
мутационный статус, а также статус метилирование ДНК PGP9
. 5
, NMDAR2B
и CCNA1
, которую мы обозначены как геномных и эпигенетических категорий соответственно (ГЭЦ). Эти три категории были p53
мутант, p53
дикого типа с сверхвысокой метилирования (ГИМ) из указанных выше 3 генов р53
путь ( p53 <бр> WT /ГИМ) и p53
дикого типа без (ж /о) SHM ( p53
WT ж /о ТИМ).
<р> Интересно, что группы пациентов классифицируются на на ГЭЦ достоверно коррелирует с полом (р = 0,0003), возраст (р = 0,08), гистологии Лорен (р = 0,005) и инфильтрации рисунка (р = 0,001), но не с прогностическими факторами, такими как факторы постановки. Группы пациентов классифицируются на основе ГЭЦ также показал, что p53
мутант и p53
WT /ГИМ группы были сходны с точки зрения количества пациентов для каждого клиническая характеристика, но отличались в этом отношении по сравнению с p53
WT ж /о группе ГИМ. Таким образом, мы вновь обозначили бывших групп ( p53
мутантный плюс p53
WT /группы ГИМ) в качестве p53
аберрация группы, а второй группы ( p53
WT ж /о SHM) была обозначена как p53
без аберраций группы.

Хотя прогноз существенно не отличалась между группами, классифицируемых по ГЭК (рис 2B ), больше рецидивы были найдены в p53
аберраций группе по сравнению с p53
без аберраций группы (таблица 1, статистически значимой разницы). Эта тенденция сохраняется и с точки зрения повторения рисунка каждого из лимфатических узлов, брюшины и отдаленные органы (таблица 2), предполагая, что p53
аберрация группа, вероятно, обладают клинически уникальный фенотип даже от прогностической точки зрения. При анализе только случаи с рецидивами, то p53
аберрация группа была вновь в значительной степени связано с гистологии Лорен (таблица 2, P = 0,01), однако не было никаких моделей рецидивов, которые были уникальны для p53 <бр> аберрация.
<р> с другой стороны, диффузный тип рака желудка показали значительно лучший прогноз, чем кишечного типа рака желудка в p53
аберрация группы (рис 5А). Поскольку такие пациенты, как правило, распространяться на более продвинутой стадии, эти данные по выживаемости предположили, что S1 послеоперационной адъювантной химиотерапии является более эффективным для рака желудка диффузного типа, чем для рака желудка кишечного типа в случаях с p53
путь аберраций (рис 5Б).
<р> и, наконец, в качестве справочных данных (таблица 1), univariable прогностический анализ для RFS и ОС всех пациентов выявлены клинически значимые потенциальные прогностические факторы, представляющие плохое выживание, такие как пол (р = 0,03, р = 0,1) , возраст ≥67 лет (P = 0,009, p = 0,001), верхнее расположение опухоли (р = 0,06, р = 0,1), то 14 ^{й JGCA /7 й UICC пТл (Р = 0,08, р = 0,4), 14 й JGCA Pn (р = 0,001, P = 0,06), а 14 й JGCA /7 й стадии UICC (P &л;. 0,0001, P = 0,03)}

лечение индуцируется экспрессия белка p53 Эпигенетическое, согласные с p53 транскрипционной активности
<р> Эпигенетическое лечение NUGC4 линий рака желудка клеток (дикого типа p53
) с 5 мкМ 5-аза-2'- дезоксицитидин или 5 мкМ 5-аза-2'-дезоксицитидин плюс трихостатин A робастно индуцированный апоптоз в отсутствие химиотерапевтического агента ЦДДП. Дополнительное лечение с CDDP дополнительно значительно увеличены эти апоптотических эффекты (рис 6в). Интересно отметить, что ЦДДП в сочетании с эпигенетическими обработок робастно повышал уровень p53 белка, который частично, но не полностью, отраженную <ЕМ> р53
транскрипционной активности гена люциферазы (рис 6A и 6B). Эти результаты свидетельствуют о том, что p53
активность транскрипции может быть возобновлена ​​с помощью эпигенетических лечения, однако это также предполагает, что апоптоз лишь частично индуцируется через p53
путь.
<Р> Кроме того, эпигенетические лечение KATOIII линий рака желудка клеток ( р53
нуль), с 1 мкМ 5-аза-2'-дезоксицитидин или 1 мкМ 5-аза-2'-дезоксицитидин плюс трихостатин A робастно индуцированный апоптоз в отсутствие CDDP, но дополнительное лечение CDDP не далее значительно увеличить апоптотические эффекты (рис 6в). ЦДДП в сочетании с эпигенетическими лечения не приводило к повышению уровня белка р53, что нашло отражение в отсутствие р53
транскрипционной активности гена люциферазы (рис 6A и 6B). Эти результаты свидетельствуют о том, что p53
активность транскрипции не требуется для апоптоза эпигенетическими обработок в клетках KATOIII ( p53
нулевые клетки).

Обсуждение
<р> Это Настоящее исследование является первым сообщением, что ШМ опухолевых генов-супрессоров в р53
пути встречаются исключительно в патологической стадии II /III рак желудка с диким типом p53
(рис 3). Мы выбрали pStage II /III больных раком желудка с помощью стандартных методов лечения анализа р53
токопровода, так как многопрофильные лечения у таких пациентов имеют лучший потенциал для достижения прогностическую улучшения с полной излечимости [24, 25]. Это соображение должно быть первым приоритетом при рассмотрении вопроса о дальнейшей разработке новых терапевтических стратегий.
<Р> Почти полное метилирование промотора ДНК CpG островков требуется для полного молчанием генов, и даже небольшие пропорции неметилированных аллели могут вызвать робастно экспрессию генов [ ,,,0],1-5]. В первичных опухолевых тканях, ШМ должна представлять почти полное метилирование в раковых клетках, и ШМ в первичных опухолевых тканях в самом деле было связано со снижением экспрессии белка таких генов (рис 4). Этот результат позволяет предположить, что ШМ генов в р53
путь может быть функционально эквивалентны P53
функциональная аберрация, которая возникает в результате р53
мутации, так как эти 3 молекул функция в том же p53
пути.
<р> при раке желудка, то p53
аберрация группа была в значительной степени связано с уникальными клинико-патологическими фенотипами, такими как кишечная гистологии Лорен, мужской пол, старый возраст, и менее инфильтративно роста (таблица 1). Наши текущие наблюдения могут быть связаны с предыдущими сообщениями, которые показали, что р53
мутации коррелировали с ранней стадией рака желудка кишечного типа, или с поздней стадией рака желудка диффузного типа [26, 27], или пожилой возраст [ ,,,0],28], однако наш анализ клинико-патологическими основном включены средней стадии рака желудка. Интересно отметить, что путь аберрация является уникальным и устойчивым даже при рецидивных больных (таблица 2)
. <Р> Положительная прогностическая значимость р53
мутации при раке желудка является спорным с обеих сторонников [29] и инакомыслящих [30 ] этой возможности. На первый взгляд наши данные, по-видимому поддержку последней группы, тем не менее, следует принимать во внимание, что наши данные по выживаемости, вероятно, были модифицированы путем послеоперационной адъювантной химиотерапии (стандартной терапии в Японии). В то время как, в отличие от настоящего исследования, диффузный тип рака желудка показали худший прогноз, чем кишечного типа рака желудка в нашей больнице несколько десятилетий назад [15, 31], последние обновления данные по выживаемости поддерживают противоположные результаты (то есть кишечный тип рака желудка показывает худший прогноз, чем диффузный типа рака желудка), который предположительно из-за S-1 послеоперационного адъювантной эффектов [32]. Послеоперационное адъювантной S-1 химиотерапии было предложено, чтобы быть значительно более эффективным для перитонеального заболеваний, чем для отдаленными метастазами органов [24], и он, вероятно, будет более эффективным для рака желудка диффузного типа, чем для рака желудка кишечного типа [32] , По этим причинам, последний анализ выживаемости указывает на то, что прогноз диффузного типа рака желудка улучшается по сравнению кишечного типа рака желудка.
<Р> Там не было никакой статистической разницы в скорости повторения или в уникальном рекуррентные сайты между p53
аберрация группа и p53
не-аберрация группа, однако больше рецидивы были обнаружены в каждом из рекуррентных участков p53
не-аберрацией группы по сравнению с p53
аберраций группы. Эти данные могли бы предположить, что p53
без аберраций группы имеет более агрессивный фенотип, чем p53
аберраций группы в целом. В нашем исследовании, диффузный тип рака желудка показали значительно лучший прогноз, чем кишечного типа рака желудка в p53
аберраций группы. Поскольку такие пациенты, как правило, распространяться на более продвинутой стадии, эти данные по выживаемости предположили, что S1 послеоперационной адъювантной химиотерапии является более эффективным для рака желудка диффузного типа, чем для рака желудка кишечного типа в случаях с p53
затрагивающего пути аберрацией. Эти результаты согласуются с предыдущими сообщениями, что мутант p53
и /или иммунное белка р53 может быть прогностические биомаркеры для положительных эффектов высоких доз неоадъювантной химиотерапии при раке желудка [30].
<Р> Мы наконец оценивали эпигенетических эффектов лечения в сочетании с химиотерапевтическим агентом для того, чтобы сравнить значение р53
пути к эпигенетическом пути в желудочном раковых клеток, обработанных CDDP. Неожиданно оказалось, что p53
путь вряд ли играют очень важную роль в индукции апоптоза CDDP (рис 6). Недавно было показано, что эпигенетические канцерогенез действительно возможно. В этой системе, системные плюрипотентных индуцированных путем перепрограммирования факторов приводит системного возникновения рака с динамическими эпигенетических изменений, в то время как системное реверсия этих факторов перепрограммирования возвращает раковые клетки в нормальные клетки [33]. Рак желудка, вероятно, укрывает меньше мутаций генов водителя [34], чем колоректального рака [35], и, аналогично, за исключением ген p53
редко при раке молочной железы [35], предполагая, что эпигенетические канцерогенеза мутации является возможным главным этиология через хронической инфекции Helicobacter Pylori [36-38]. Недавно мы продемонстрировали гипер-метилирование Reprimo
[39], что опять-таки является ген в p53
путь, но которые не могли быть включены в это исследование, и HOPX
[16] и CDO1
[40], которые оба участвуют в апоптоз, но предполагаемо не через р53
пути. Основываясь на наших текущих функциональных экспериментах р53
пути вклад эпигенетических эффектов лечения, вероятно, будет намного меньше, чем у других путей (рис 5). Мы использовали другие клеточные линии (2 желудка клеточных линий рака и 1 гепатоцеллюлярной линии клеток рака), чтобы точно определить вклад р53
пути к апоптозу, вызванному CDDP в сочетании с эпигенетических лечения. Дополнительные эксперименты, проведенные показаны на рис S3. клеточные линии AZ521 и HepG2 являются p53
дикого типа, а SH10 клеточная линия p53
мутант. p53
активность была обнаружена в p53
клеток дикого типа, однако, его активность зависит от каждой клеточной линии. Таким образом, p53
активность была обнаружена в клетках NUGC4 с обработкой CDDP и в AZ521 и клетках HepG2 без лечения ЦДДП. Сильный апоптоз, как оценивали с помощью анализа апоптоза (каспазы 3 или нексин пробирной) не обязательно отражает степень р53
активации транскрипции. В p53
мутант (SH10) или p53
нулевые клетки, p53
транскрипционный активность не индуцируется вовсе, однако апоптоз оказался похож на что в р53
клеток дикого типа. Таким образом, в рак желудка, другие, чем p53
путь может быть более актуальным для индукции апоптоза, чем р53
пути апоптоза.
<Р> В заключение p53
аберрация и не аберрация группы пациентов существуют при раке желудка, то p53
путей может быть аберрантное в результате эпигенетической модификации генов в пути, а также из-за геномной мутации. p53
аберрация группа может демонстрировать уникальные клинические особенности по сравнению с p53
без аберраций группы. Эпигенетическое управления из гены p53
проводящих путей играют незначительную роль в индукции апоптоза химиотерапевтического агента, и апоптоз при раке желудка, который индуцируется эпигенетической реверсии можно объяснить в основном за счет механизма, отличного от p53
путь. Таким образом, p53
путь вряд ли будет играть ключевую роль в апоптозу, вызванному CDDP в сочетании с эпигенетических лечения. Тем не менее, p53
путь, как сообщается, играют важную роль в естественном желудочном канцерогенезе [41-44]. Таким образом, наше открытие, что p53
гена путь метилирование исключительно найден при раке желудка с p53
статус дикого типа может быть важным наблюдением, и такие изменения в тканях опухоли может привести к опухолевой прогрессии , Именно по этим причинам, что p53
путь аберрация может иметь прогностическое значение химиотерапевтических эффектов при раке желудка.

Поддержка Информация
S1 Рис. Специфичность метилирования PGP9
. 5
, NMDAR2B
и CCNA1
при раке желудка.
Значения (A) TaqMeth каждого гена в развитии рака желудка, а также в соответствующей нормальной слизистой оболочки показаны. (B) Значения TaqMeth каждого гена, классифицированных в соответствии с р53
статус гена опухоли показаны. Данные выражены в виде среднего ± SD
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0139902.s001
(TIF)
S2 Рис.

• PLoS ONE: дерегулируемых Выражение SRC, Lyn и ЦКБ киназ с помощью метилирования ДНК и его потенциальную роль в рак же…
• PLoS ONE: генетическая изменчивость в 3-нетранслируемой области гена NBN связано с раком желудка Риск в китайского…