PLoS ONE: Išskirtinis asociacija p53 mutacijos Super High metilinimas naviko slopintuvas genų p53 eigos unikalus skrandžio vėžys Fenotipas

Anotacija

Fonas

detalią paiešką DNR denatūruotas genų nustatyti kandidatas navikas slopintuvas genų, kurie buvo įrodyta, kad būti įtraukti į apoptozės procesą P53 pervežimas keliu , Šiame tyrime mes ištirti P53
mutacijos, susijusios su tokio epigenetinio pakeitimo pirminės skrandžio vėžio

galimybės

metilinimo profiliai 3 genų. PGP9
. 5
NMDAR2B
, ir CCNA1
, kurie dalyvauja p53 naviko slopinamojo keliu kartu su p53 pervežimas mutacija buvo išnagrinėjo 163 pirminių skrandžio vėžio. Iš epigenetinio apgrąžos poveikis kartu su chemoterapiniais vaistais apie apoptozės Taip pat buvo vertinamas atsižvelgiant į naviko P53
mutacijų būklė.

Rezultatai

P53
genų mutacijos buvo rasta 44 pirminių skrandžio navikų (27%), ir super-aukštos metilinimas pagal bet kurį iš 3 genų buvo nustatyta, tik tais atvejais, su laukinio tipo p53
. Didesnis, P53
kelias aberacijos buvo rastas atvejais su vyriškos lyties (p = 0,003), žarnyno tipą (p = 0,005), ir ne infiltrating tipą (p = 0,001). P53
kelias aberacijos grupė eksponuojami mažiau pasikartojimo limfmazgius, tolimų organų ir pilvaplėvės nei P53
ne aberacijos grupei. Į NUGC4 skrandžio vėžio ląstelių linijos ( P53
laukinio tipo), epigenetinius gydymas papildyta apoptozė iki chemoterapiniais vaistais, iš dalies per P53 pervežimas transkripcijos veikla. Kita vertus, KATO III vėžio ląstelių linijos ( P53
mutantas), epigenetinius gydymo vien sukeltas tvirtą apoptozę, be trans-aktyvavimo P53
.

Išvada

skrandžio vėžio p53
atitinkamos ir ne atitinkamos keliai egzistuoja, ir navikai arba rūšyse tipo eksponuojami unikalūs klinikiniai požymiai. Epigenetiniai gydymas gali sukelti apoptozę dalies per P53
aktyvavimo, Tačiau jų Apoptozinės poveikis gali būti paaiškintas daugiausia iš kitų, ne P53
keliai

citavimo mechanizmo. Waraya M, Yamashita K Ema, Katada N Kikuchi S Watanabe M "(2015) Išskirtinis asociacija p53
mutacijos Super High metilinimas naviko slopintuvas genų p53 pervežimas eigos unikaliu skrandžio sulčių Vėžys fenotipas. PLoS ONE 10 (10): e0139902. Doi: 10,1371 /journal.pone.0139902

redaktorius: Qian Tao, Kinijos universiteto Honkonge, Honkongas

Įstojo: Kovo 31, 2015; Priimta rugsėjo 18, 2015 m Paskelbta: Balandis 8, 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Waraya et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

finansavimas:. Šis darbas buvo iš dalies remiamą dotacijos-in pagalba vėžio tyrimų iš sveikatos, darbo ir gerovės Japonijos ministerijos ir Japonijos fondas tarpdisciplininė gydymo nuo vėžio. Finansavimo agentūros neturėjo vaidmenį tyrimo, duomenų rinkimo, arba analizės dizainas; atsižvelgiant į rezultatams interpretuoti; į rankraščio rengimo; arba sprendime pateikti rankraštį paskelbti

konkuruojančių interesų. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

DNR metilinimas vaidina pagrindinį vaidmenį. genai yra nuslopinami naviko slopintuvas genų žmogaus vėžio. Vėžio konkrečių metilinimas genas yra retas subjektas, ir dažnai aberacija metilinimo pradinėse vėžinių audinių dar reta [1, 2]. Mes identifikuoti vėžines konkrečių denatūruoti genų kiekvieno organo naudojant farmakologinį demaskavimo mikrogardeliq (PUM) [1, 2] ir modifikuotas PUM [3-5]. Mes nustatė daug kandidatas navikas slopinančias genus gaminių (GTG), pavyzdžiui, PGP9
. 5
galvos ir kaklo plokščiųjų ląstelių karcinoma (HNSCC) [2], stemplės SLS (ESCC) [6] , skrandžio vėžys [4], ir kitų vėžio [7] NMDAR2B
ESCC [3] ir skrandžio vėžys [8], ir CCNA1
HNSCC [2]. Metilinimo profiliai iš šių genų buvo patvirtinta kitų grupių ir /arba net kitų vėžio [9-14]. Genai, kad išklausyti daugiau kaip 60% metilinimo naviko audiniuose buvo paskirtas labai svarbių denatūruotu genų (HRMGs) [15]. Be to, mes dar palyginti tokio nukrypusiu nuo normos metilinimo kandidačių HRMGs su kitomis ataskaitomis skrandžio vėžio dažnį [16] ir genų kandidatų buvo susiaurinta konkrečių genų.

Svarbiausia, kad šie kandidatas auglio slopinamojo genai buvo pranešama, kad į p53
navikas slopintuvas būdų (1 pav). Pavyzdžiui, PGP9
. 5
Už tiesiogiai sąveikauja su p53 parsisiųsti ir stabilizuoja P53
slopinant jo degradaciją per ubiquitination keliu į kepenų ląstelių [17] , krūties [18], ir nosiaryklės vėžio [19]. NMDAR2B
indukuoja apoptozę per savo tiesiogine sąveika su DAPK
[20], kuri, savo ruožtu, buvo įrodyta, kad neutralizuoti onkogeno sukeltos transformacijos aktyvuojant p19ARF
/ p53
-dependent Apoptozė greičių dėžė [21]. CCNA1
yra P53
indukuotų genas, kuris tarpininkauja apoptozę, G2 /M suėmimą, o mitozės katastrofos žmogaus inkstų, kiaušidžių ir plaučių vėžio ląstelių [22]. Vadinasi, P53
kelias yra išgarina tik navikų audiniuose, pirminės vėžio į epigenetinio būdu kartu su laukinio tipo P53
, tačiau nebuvo ataskaitą dėl iš asociacija p53
mutacija ir Epigenetiniai pakitimai pirminio naviko audiniuose.

šiame tyrime mes ištirti DNR metilinimo statusą genų p53
kelias, kurie yra neįprastai reglamentuojamos epigenetinio būdu pirminės skrandžio vėžys, ir palyginti jų metilinimo modelis su p53
mutacijų būklė, siekiant nustatyti klinikinę reikšmę p53
aberacijos fenotipų.

metodų

Mobilaus ryšio linijos ir audinių mėginių

skrandžio vėžio ląstelių linijas, KatoIII, NUGC4, AZ521 ir SH10 buvo perkami iš RIKEN Bioresource centro (Ibaraki, Japonija). Ir kepenų ląstelių karcinoma ląstelių linija HepG2 buvo įsigytas iš Amerikos tipas kultūros kolekcija (Manassas, VA). Šios ląstelių linijos, išskyrus AZ521 ir HepG2 buvo auginami RPMI 1640 terpė (GIBCO, Carlsbad, CA) papildytas 10% vaisiaus galvijų kraujo serume. AZ521 ir HepG2 buvo auginami DMEM terpe (GIBCO), papildytas 10% FBS.

poros (n = 163) formalinu fiksuotos, parafiną įterptųjų (FFPE) naviko audinyje ir atitinkami normalus gleivinės pavyzdžius, gautus esant mažiau kaip 5 cm nuo naviko krašto buvo gauti iš pacientų, kuriems atliekama operacija nuo sausio 1, 2000, gruodžio 31, 2010. Visos pacientų su II etapo /III GC buvo atlikta potencialiai gydomasis rezekcija dėl pirminės GC ir patyrė adjuvantinis S -1 chemoterapija po operacijos (S-1 standartinis gydymas). Neo-adjuvantinis gydymas nebuvo atlikta šioje pacientų kohortos. Navikai buvo klasifikuojami naudojant TNM klasifikaciją pagal 7 ^{-asis leidimas sąjungos Tarptautinės vėžio kontrolės (UICC), o 14 -asis leidimas Japonijos klasifikatoriaus Skrandžio vėžio (JCGC). Pacientų charakteristikos pavaizduotos 1. Visi audinio mėginiai buvo surinkti tuo Kitasato universitetinės ligoninės lentelėje, ir raštu informuoti sutikimas buvo gautas iš visų pacientų ir sveikų donorų prieš mėginio paėmimo. Šis tyrimas patvirtino Etikos komiteto Kitasato universitete.}

analizė mutavusių P53
genų, naudojant vieną-Strand raumeningumo polimorfizmas (SSCP)

mutacijų egzonų 5, 6, 7 ir 8 straipsnių p53 pervežimas geno buvo tikrinami neradioaktyvaus vieno kryptis raumeningumo polimorfizmas (SSCP) analizė, kuri buvo atlikta naudojant mūsų anksčiau užmegztus metodus [23]. PGR produktas pavyzdžiai 10 pL buvo praskiestas tris kartus su gelio-buferinio tirpalo (95% dejonizuoto formamido, 20 mmol /L EDTA, 0,01% bromfenolio mėlynasis, ir 0,01% ksileno oianolo) ir kaitinamas iki 95 ° C temperatūroje 10 min, po grūdinant ant ledo. Mėginiai 3 įxL buvo taikomi modifikuotų poliakrilamido geliai (PAFG: 18% poliakrilamido-bis (49: 1), 0,5x TBE, 10% glicerolis, 10% formaldehido, 0,05% amonio Persulfate ir 30 ml TEMED), kurių matmenys 120 mm x 150 mm x 0,35 mm. Elektroforezės buvo atlikta su 1,5x TBE buferiu, esant 500 V ir 30 mA 1 valandą kambario temperatūroje. Juostos buvo aptikta Dažymo geliai, naudojant sidabro dėmę plius rinkinį (Bio-Rad, Hercules, CA), po fiksavimo, skalauti, plėtros ir sustoti reakcijos. aptiktos su PCR-SSCP mutavo juostos buvo akivaizdu 1:64 praskiesti mutavusių alelių.

bisulfite gydymas išgauti DNR pervežimas

genomo DNR nuo FFPE audinių ir ląstelių linijų buvo išgauti naudojant QIAamp DNR FFPE audinių rinkinys (QIAGEN mokslai, Maryland, MD) ir QIAamp DNR Mini Kit (QIAGEN) pagal gamintojo protokolai. DNR denatūravimo, 2 mikrogramai genominės DNR buvo inkubuojama su 5 mikrogramų lašišų spermos DNR 0,3 mol /l NaOH už 20 minučių 50 ° C temperatūroje. tada, DNR mėginys buvo praskiestas su 500 pL tirpalo, susidedančio iš 2,5 mol /l natrio metabisulfitas (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO) /125 mmol /l hidrochinono (sigma) /0,4 mol /l natrio hidroksido tirpalo, ir buvo inkubuojamos 70 ° C temperatūroje 1,5 val. tada bandinys buvo taikomas stulpelio (vedlys DNR valymo sistema, Promega Inc, Madison, WI), inkubuojamos su 0,3 mol /l NaOH 10 minučių, ir po to veikiamas 3 mol /l amonio acetatu, kad gautų 5 minutes. Mėginys buvo nusodinamas 100% etanolio, ir DNR buvo resuspenduotos 50 pL LOTE, kurio sudėtyje yra 10 m Tris-HCl, pH 8 ir 2,5 mkm etileno diamino tetra acto rūgštis (EDTA), pH 8, ir vėliau buvo papildytas polimerazės grandinės reakcija (PGR). Bisulfite gydymo rezultatai chemijos pakeitimo nedenatūruotą, bet ne metilo, cytosines į uracilai, leidžiantis tarp denatūruotą ir nedenatūruotu genomo DNR skirtumo.

Kiekybiniai-metilinimas konkrečių PGR (K-JEP)

dėl kiekybiniam metilinimo analizei, TaqMan metilinimas specifinis PGR (K-JEP) buvo atliekamas naudojant IQ ™ Multiplex Powermix (Bio-Rad) trimis egzemplioriais dėl iCycler iQ ™ Realaus laiko PGR aptikimo sistema (Bio-Rad). PGR sąlygos ir sekos yra numatyta S1 lentelėje. Serijiniu būdu atskiedus bisulfitu keistas CpGenome universalų metilintas DNR (Chemicon International, Temecula, Kalifornija), buvo naudojami kuriant kalibravimo kreivė kiekvienos plokštelės kaip metilinimo teigiami kontrolė ir CpGenome universalus nemetilintas DNR (Chemicon Tarptautinė) buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė. Metilinimo reikšmė (TaqMeth vertė) buvo apibrėžiamas kaip santykis denatūruotas PGP9
. 5
NMDAR2B
CCNA1
arba DAPK
normalizuotas metilo beta-aktino
, kuris vėliau buvo padaugintas iš 100.

Imunohistocheminiais dažymo PGP9.5, NMDAR2B ir CCNA1

Imuniniam antigenas demaskavimas buvo atliktas su autoklave mirkymas, endogeninė peroksidazės aktyvumas buvo užblokuotas inkubacijos 3% H _{2O 2 /metanolio 5 minutes, ir nespecifiniai antikūnai privalomas buvo užblokuotas inkubacijos su 1% atskiestu normalaus arklio serumo 30 minučių. tada dalys buvo inkubuotos, esant 4 ° C temperatūroje per naktį su šių antikūnų: triušis PGP9.5 polikloninis antikūnas (praskiedimas 1:. 200, Nonus BIOGENESIS), triušių NMDAR2B polikloninis antikūnas (praskiedimas 1: 100, "Millipore), arba pelės nuo ciklino monokloninis antikūnas (6E6, praskiedimas 1:50, Leica Biosystems "Newcastle". Ltd "). Imuninės kompleksai buvo aptikta su Vectastain Elito ABC Kit (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) pagal gamintojo instrukcijas. Šios imuninės kompleksai buvo aptikta naudojant 3,3'-diaminobenzidinas substrato (Vector) kaip chromogeną (PGP9.5 1,5 minutės, NMDAR2B 6-ąją, CCNA1 10 minučių). Skyriai buvo counterstained hematoksilinu.}

epigenetinius gydymas 5-aza-DC ir TSA, ir chemoterapinių gydymo CDDP

Ląstelės buvo padalinti ir pasėjamos ne mažo tankio (1x10 ^{6 /T-75 kolba) prieš 24 valandas iki gydymo. tada ląstelės buvo gydomi kas 24 valandas 4 dienas yra 1 arba 5 mkm 5-aza-2'-deoksicitidino (5-aza-nuolatinės srovės; Sigma-Aldrich, St Louis, MO), ištirpinto 50% acto rūgšties arba buvo maketas apdorojimo PBS, įskaitant tą patį kiekį acto rūgšties. Kaip minėta, 100 nM trichostatinA (TSA; Sigma-Aldrich). Ir /arba 12,5 mkm MIS-diaminedichloroplatinum (CDDP) (Nichi-Iko Pharmaceutical Co., Ltd, Japonija) buvo įtraukta galutiniams 24 valandas}

imunoblotingu analizė

viso baltymas išgaunamas iš ląstelių linijų, kurios buvo epigenetically gydytų su /be chemoterapinių gydymo ir buvo atliktas Vakarų blotingo analizę, naudojant šiuos antikūnus: pelės anti-p53 monokloninis antikūnas (1C12, praskiedimas 1: 1000, Mobilusis Signalizacijos Technology, Inc) arba pelės anti-β-aktino IgG _{2a monokloninis antikūnas (praskiedimas 1: 10000, Sigma-Aldrich)}

p53 reporterio testą

ląstelių (2x 10 ^{4 ląstelių /96 šulinėlių plokštelės), kurie buvo gydomi epigenetically su /be chemoterapinių gydymo buvo pernešta su p53
reporteris vektorius (QIAGEN) naudojant signalo ™ kelią Reporter Rinkiniai ( QIAGEN) ir Lipofectamine 2000 reagentas (Invitrogen). Po 24 valandų inkubavimo, žurnalistė aktyvumas buvo matuojamas naudojant dvejopo liuciferazės reporterio testą sistema (PROMEGA). Transfekcija buvo atliekami trimis egzemplioriais ir analizuojami naudojant SoftMax Pro programinę įrangą (Molekulinė prietaisai, Saniveilis, Kalifornija).}

Apoptozę tyrimas

paveiktų ląstelių (1x 10 ^{5 ląstelių /mėginių) buvo tamsintas su aneksinu ir 7-AAD (gvajavos Nexin reagentas, gvajavos technologijos, Hayward, CA) už diskriminaciją pradžioje ir pabaigoje apoptozinių ląstelių, atitinkamai. Eksperimentas buvo atliekamas naudojant Guava PCA sistema, vykdoma trimis egzemplioriais ir analizuojami naudojant CytoSoft 2.1.5 programinę įrangą (gvajavos technologijos).}

Statistinė analizė

Tikslus Fišerio testas arba Mann-Whitney U testas buvo naudojamas kategorinių kintamųjų, o Studento , T
-test buvo naudojamas nuolat kintamųjų. Duomenys išreikštas reiškia ± standartinis nuokrypis (SD). Kaplan-Meier metodas buvo naudojamas siekiant įvertinti kaupiamąjį išgyvenimo ir skirtumai išgyvenamumas buvo įvertintas naudojant log-rank testą. Paūmėjimų išgyvenamumas (RFS) ir bendras išgyvenamumas (BI) buvo matuojama nuo operacijos dienos iki pasikartojimo ir mirties, arba paskutinio kontrolinio dienos. Kalbant apie RFS ar OS, pacientai, kurie išgyveno ilgiau nei 60 mėnesių (5 metų) buvo analizuojama kaip maitintojo. P < 0,05 buvo laikomi jei statistinę reikšmę. Visi statistinės analizės buvo atlikta SAS programinės įrangos paketai (SAS Institute, Cary, NC).

Rezultatai

P53
genų būsena ir metilinimo profiliai PGP9
. 5
NMDAR2B
CCNA1
, ir DAPK
pStage II-III skrandžio vėžio

p53
mutacijos buvo nustatyta 44 iš 163 pirminių skrandžio vėžiu sergančių pacientų (27%) pagal SSPC analizė. P53
genų mutacijų neturėjo prognostinę reikšmę (pav 2a). Mes tada analizuojami metilinimo profilius PGP9
. 5
NMDAR2B
CCNA1
, ir DAPK
šių audinių naudojant Q-JEP. TaqMeth vertė visų genų buvo didesnis pirminių navikų skrandžio vėžio laukinio tipo P53
nei tie, su mutantas P53
(genų metilinimo tvarka:. PGP9
5
> NMDAR2B
> CCNA1
> DAPK
) (pav 3A ir S1 ir S2 Figos). Metilinimo promotoriaus DNR buvo žymiai didesnis, CCNA1
(p < 0,0001) ir PGP9
5
(p = 0,03), o šiek tiek žymiai didesnė NMDAR2B
(p = 0,10) ir DAPK
(p = 0,05), pirminis navikas, palyginti su atitinkamu normalaus gleivinę. Svarbu tai, kad super-aukštos metilinimas lygis PGP9 pervežimas. 5
NMDAR2B
, ir CCNA1
buvo rasti tik pirminius navikus su ne p53
mutacijų, kad atpjovimo TaqMeth vertės buvo 50, 163, ir 133, atitinkamai (pav 3a). Toks super aukštos metilinimo PGP9
. 5
NMDAR2B parsisiųsti ir CCNA1
buvo rasta 14, 19 ir 8 mėginiai, atitinkamai, ir kai kurie iš šių mėginių buvo vienas ant (Fig 3b). DAPK
nebuvo rodyti šią tendenciją, nes DAPK
metilinimo lygio buvo gana didelis atitinkamų normalios gleivinės audinių nemaža atvejų (S2 pav).

Imunohistocheminis analizė PGP9.5, NMDAR2N ir CCNA1 baltymų raiškos pirminis navikas

imunohistocheminis dažymas PGP9.5, NAMDR2B ir CCNA1 baltymo ekspresija buvo tada atliekamas tiek tais atvejais, su super dideliu metilinimo ir tiems, su mažo metilinimo šių genų. Stiprus sumažinimas iš PGP9.5, NMDAR2B išraiškos ir CCNA1 buvo pastebėtas pirminis navikas audiniuose, kai projekto vykdytojas DNR metilinimas buvo super aukštas (3 pav). Kita vertus, nėra baltymų ekspresijos PGP9.5, NMDAR2B, arba CCNA1 sumažėjimas buvo nustatyta, kai promotorius DNR metilinimas buvo mažas (4 pav).

klinikos analizė pirminis skrandžio vėžio patologinė II etape /III skrandžio vėžys su standartiniu gydymu

klinikos ypatumai ir prognozės (5 metų RFS ir OS) buvo tada analizuojami univariacinį būdu skrandžio vėžio patologinė etape II /III skrandžio vėžio standartinis gydymas (operacijos plius pooperaciniai S-1 administravimo) (1 lentelė). Mes klasifikuojami skrandžio vėžiu pacientams į 3 kategorijas pagal P53
mutacijų būklė taip pat DNR metilinimas statusas PGP9
. 5
NMDAR2B
ir CCNA1
, kurį mes paskirtas genomo ir epigenetinių kategorijas (atitinkamai GEC). Šios trys kategorijos buvo P53
mutantas P53
laukinio tipo su super aukštos metilinimo (SHM) pirmiau 3 P53
kelią genų ( P53
WT /SHM) ir p53
laukinio tipo be (W /o) SHM ( p53
WT, w /o SHM).

Įdomu, pacientų grupės klasifikuojami remiantis nuo GECs buvo reikšmingai koreliavo su lyties (p = 0,0003), amžius (p = 0,08), Lauren anketa histologija (p = 0,005) ir infiltracijos modelis (p = 0,001), bet ne su prognozinių veiksnių, tokių kaip sustojimo faktorių. Pacientų grupės klasifikuojami remiantis GECs taip pat parodė, kad P53
mutantas ir P53
WT /SHM grupės buvo panašios atsižvelgiant į paciento numeris kiekvienam klinikinė charakteristika, bet skyrėsi šiuo atžvilgiu, palyginti su p53
WT, w /o SHM grupei. Taigi, mes naujai paskirta buvusius grupėms ( P53
mutantas plius P53
WT /SHM grupės) kaip P53
aberacijos grupės, o pastaroji grupė ( p53
WT, w /o SHM) buvo paskirta p53
ne aberacijos grupei.

Nors prognozės reikšmingai nesiskyrė tarp grupių, suskirstytų pagal GEC (pav 2B ), daugiau recidyvo buvo rasti p53 pervežimas aberacijos grupėje, lyginant su p53
ne aberacijos grupės (1 lentelė, nėra statistiškai reikšmingas skirtumas). Ši tendencija išliko požiūriu pasikartojimo modelio kiekvienas limfmazgiai, pilvaplėvės ir tolimi organai (2 lentelė), o tai rodo, kad P53
aberacijos grupė gali eksponuoti kliniškai unikalų fenotipą net nuo prognostinė požiūriu. Kai buvo analizuojami tik atvejai, kurių pasikartojimo, P53
aberacijos grupė vėl buvo reikšmingai susijęs su Lauren anketa histologiją (2 lentelė, p = 0,01), tačiau nebuvo pasikartojimo modeliai, kurie buvo unikalus, P53
aberacijos.

kita vertus, difuzinis tipas skrandžio vėžio parodė žymiai geriau prognozę nei žarnyno tipo skrandžio vėžio p53
aberacijos grupė (pav 5A). Kadangi tokie pacientai linkę būti išplatinta daugiau pažengęs, šie išlikimo duomenys rodo, kad S1 pooperacinis palaikomoji chemoterapija yra efektyvesnis už difuzinis tipo skrandžio vėžiu negu žarnyno tipo skrandžio vėžio atvejais, P53
kelias aberacijos (Pav 5B).

Galiausiai, kaip atskaitos duomenys (1 lentelė), univariacinį prognostinė analizė RFS ir OS visų pacientų nustatyta kliniškai reikšmingų potencialių prognostiniai faktoriai, atstovaujantys prastos išlikimą, pavyzdžiui, lyties (p = 0,03, p = 0,1) , amžius ≥67 metai (p = 0,009, p = 0,001), viršutinių naviko vieta (p = 0,06, p = 0,1), The 14 ^{-asis JGCA /7 -asis UICC pt (p = 0,08, p = 0,4), The 14 -asis JGCA PN (p = 0,001, p = 0,06), o 14 -asis JGCA /7 -asis UICC etape (p. < 0,0001, p = 0,03)}

epigenetinius gydymo sukeltas p53 baltymo raiška, sutinkantis su p53 transkripcijos veiklos

epigenetinius gydymas NUGC4 skrandžio vėžio ląstelių linijas (laukinio tipo p53
) su 5 mkm 5-aza-2'- dezoksicitidino arba 5 mkm 5-aza-2'-dezoksicitidino plius trichostatin A tvirtai sukeltas apoptozę iš chemoterapinio agento CDDP nėra. Papildoma gydymo CDDP toliau gerokai padidėjo šių apoptozinių poveikis (pav 6c). Įdomu tai, kad CDDP kartu su epigenetinių gydymo tvirtai padidėjo Baltymas p53 lygį, kuris iš dalies, tačiau jis nėra visiškai, atsispindi p53
transkripcijos veikla liuciferazės reporterio geno (pav 6A ir 6B). Šie rezultatai rodo, kad P53
transkripcija veikla gali būti suaktyvinta epigenetinių gydymo, tačiau ji taip pat rodo, kad apoptozė yra tik iš dalies sukeltas per P53
kelias.

Be to, epigenetinius gydymas KATOIII skrandžio vėžio ląstelių linijas ( p53
niekinis), 1 mkm 5-aza-2'-deoksicitidino arba 1 mkm 5-aza-2'-deoksicitidino plius trichostatin A tvirtai sukeltas apoptozę nesant CDDP, bet papildomo gydymo CDDP nebuvo dar gerokai padidinti apoptozės poveikis (pav 6c). CDDP kartu su epigenetinių gydymo nepadidino p53 baltymo lygį, kuris rodė ir trūksta, P53
transkripcijos veikla liuciferazės reporterio geno (pav 6a ir 6b). Šie rezultatai rodo, kad P53
transkripcija veikla nėra privaloma apoptozės iki epigenetinių variantuose KATOIII ląstelių ( P53
null ląstelių).

Diskusijos

Dabartinis tyrimas yra pirmoji ataskaita, kad SHM naviko slopintuvas genų p53 pervežimas keliu randama tik patologinio etape II /III skrandžio vėžio laukinio tipo p53
(3 pav). Mes pasirinkome pStage II /III skrandžio vėžiu sergantys pacientai standartinių gydymo P53
rūšyse analizės, nes tarpdisciplininius gydymas tokiems pacientams turi geriausią potencialą pasiekti prognostinę tobulinimą su pilna Uleczalność [24, 25]. Ši aplinkybė turėtų būti teikiamas prioritetas svarstant tolesnę plėtrą naujų terapinių strategijų.

Beveik pilnas metilinimas promotoriaus DNR CpG salų reikalingas pilnas genai yra nuslopinami, ir net mažos proporcijos nedenatūruotą alelių, gali tvirtai sukelti genų ekspresiją [ ,,,0],1-5]. Be pirminių navikų audiniuose, SHM turi atstovauti beveik visiškai metilinimas yra vėžio ląstelių ir SHM į pirminio auglio audinių iš tiesų buvo susijęs su sumažėjusiu baltymo raiškos tokių genų (4 pav). Šis rezultatas rodo, kad SHM nuo genų P53
kelias gali būti funkciškai lygiavertės P53
funkcionalus aberacijos, kuri atsiranda dėl to, P53
mutacija, nes šių 3 molekulių funkcija toje pačioje p53 pervežimas keliu.

skrandžio vėžio, p53
aberacijos grupė buvo reikšmingai susijęs su unikaliomis klinikos fenotipų, pvz Lauren anketa žarnyno Histologija, vyriškos lyties, amžiaus amžius, ir mažiau infiltracine augimas (1 lentelė). Mūsų dabartiniai stebėjimai gali būti susiję su ankstesnėmis ataskaitomis, kad įrodyta, kad P53
mutacijos koreliuoja su anksti žarnyno tipo skrandžio vėžio, arba vėlai difuzinis tipo skrandžio vėžio [26, 27], arba senyvo amžiaus [ ,,,0],28], tačiau mūsų klinikos analizė daugiausia įtrauktos vidurinės stadijos skrandžio vėžį. Įdomu tai, kad kelias aberacijos yra unikalus ir išlaikyti net pasikartojantys pacientai (2 lentelė).

teigiama prognostinė reikšmė P53
mutacija skrandžio vėžys yra prieštaringas su abiem šalininkų [29] ir disidentų [30 ] šia galimybe. Iš pirmo žvilgsnio mūsų duomenų atrodytų, kad palaikyti pastarąją grupę, tačiau ji turėtų būti atsižvelgta į tai, mūsų išlikimo duomenys yra tikėtina, kad buvo pakeista pooperacinio palaikomąja chemoterapija (standartinį gydymą, Japonija). Kadangi, priešingai nei šio tyrimo duomenimis, difuzinis tipas skrandžio vėžio parodė prastesnę prognozę nei žarnyno tipo skrandžio vėžio mūsų ligoninėje prieš kelis dešimtmečius [15, 31], naujausia atnaujinta išgyvenamumo duomenys patvirtina priešingą rezultatus (ty žarnyno tipo skrandžio vėžio rodo prasčiau prognozę nei difuzinio tipo skrandžio vėžio), kuri yra putatively dėl S-1 pooperacinių papildomus poveikius [32]. Pooperacinis adjuvantinis S-1 chemoterapija buvo siūloma būti žymiai efektyvesnis už pilvaplėvės ligos negu tolimoje organų metastazių [24], ir tai gali būti efektyvesnis už difuzinis tipo skrandžio vėžiu negu žarnyno tipo skrandžio vėžio [32] , Dėl šių priežasčių, vėliau išlikimo analizė rodo, kad difuzinio tipo skrandžio vėžio prognozė yra pagerėjo per, kad žarnyno tipo skrandžio vėžio.

nėra statistinio skirtumo pasikartojimo norma ar unikalus pasikartojimo svetainėse tarp p53
aberacijos grupės ir p53
ne aberacijos grupė, tačiau daugiau recidyvo buvo rasti kiekvienoje iš pasikartojimo svetainėse p53
ne aberacijos grupėje, lyginant su p53 pervežimas aberacijos grupei. Šie duomenys gali manyti, kad P53
ne aberacijos grupė turi daugiau agresyvų fenotipą nei P53 pervežimas aberacijos visai grupei. Mūsų tyrimo duomenimis, difuzinis tipas skrandžio vėžio parodė žymiai geriau prognozę nei žarnyno tipo skrandžio vėžio P53 pervežimas aberacijos grupei. Kadangi tokie pacientai linkę būti išplatinta daugiau pažengęs, šie išlikimo duomenys rodo, kad S1 pooperacinis palaikomoji chemoterapija yra efektyvesnis už difuzinis tipo skrandžio vėžiu negu žarnyno tipo skrandžio vėžio atvejais, P53 pervežimas rūšyse aberacijos. Šie rezultatai atitiko ankstesnių pranešimų, kad mutantas, P53 parsisiųsti ir /arba imunodažymu p53 baltymo gali būti prognozuojami biologiniai žymenys skirti teigiamų didelės dozės neoadjuvantas chemoterapijos skrandžio vėžio [30].

pagaliau įvertino epigenetinius gydymo poveikį kartu su chemoterapinių agentas siekiant palyginti su p53 pervežimas kelio reikšmę epigenetinio keliu skrandžio vėžio ląstelių gydomiems CDDP. Netikėtai paaiškėjo, kad P53
kelias buvo mažai tikėtina, kad vaidina labai svarbų vaidmenį apoptozė indukcijos CDDP (6 pav). Jis neseniai buvo įrodyta, kad epigenetinius Kancerogeninis iš tiesų yra įmanoma. Šioje sistemoje sisteminiai iPS sukeltas perprogramavimo veiksniai rezultatus ir sisteminio vėžio atsiradimo dinaminių epigenetinių pokyčių, o sisteminė sugrįžta šių perprogramuoti veiksnių grįžta vėžines ląsteles į normalią ląstelių [33]. Skrandžio vėžys yra tikėtina, kad priglaustų mažiau mutacijas vairuotojų genų [34], nei kolorektalinio vėžio [35], ir panašiai, išskyrus P53
genas yra retas krūties vėžio [35], o tai rodo, kad epigenetinio kancerogenezėje mutacijos yra įmanoma pagrindinis etiologija per lėtinio Helicobacter pylori infekcijai [36-38]. Mes neseniai parodė hiper-metilinimas yra Reprimo
[39], kuriame vėl yra genas P53
kelias bet kuri negalėjo būti įtrauktos į šį tyrimą, ir HOPX
[16] ir CDO1
[40], kad abu dalyvauja apoptozės, bet putatively ne per p53 pervežimas keliu. Remiantis mūsų dabartinių funkcinių eksperimentų, P53
kelias indėlis į epigenetinių gydymo poveikių, gali būti daug mažesnis nei kitų būdų (5 pav). Mes naudojome kitas ląstelių linijas (2 skrandžio vėžio ląstelių linijas ir 1 kepenų ląstelių vėžio ląstelių linija) tiksliai nustatyti P53 pervežimas keliu į apoptozės sukeltos CDDP kartu su epigenetinių gydymo įnašą. Papildomi eksperimentai atlikti yra parodyta S3 pav. AZ521 ir HepG2 ląstelių linijos yra P53
laukinio tipo, o SH10 ląstelių linija yra P53
mutantas. P53
veikla buvo aptikta p53 pervežimas laukinio tipo ląsteles, tačiau jo veikla buvo priklausoma nuo kiekvieno ląstelių linija. Taigi, P53
veikla buvo aptikta NUGC4 ląstelių su CDDP gydymo ir AZ521 ir HepG2 ląstelių be CDDP gydymą. Stiprus apoptozė, kaip vertinama apoptozės tyrime (kaspazės 3 arba Nexin prabavimo) nebūtinai atspindi P53 pervežimas transkripcijos aktyvavimo laipsnį. Be P53
mutantas (SH10) arba P53
null ląstelės P53
transkripcijos veikla nebuvo sukeltas ne visi, tačiau apoptozė buvo nustatyta, kad panašus į p53
laukinio tipo ląsteles. Todėl, skrandžio vėžio, išskyrus P53
kelias gali būti svarbesnis už sukeliama apoptozė nei P53 pervežimas keliu apoptozinių kelius.

Taigi, p53
aberacijos ir ne aberacijos pacientų grupės egzistuoja skrandžio vėžio, p53
keliai gali būti netipinė kaip epigenetinio modifikacijos genų į kelius, taip pat dėl ​​genomo mutacijos rezultatas. P53
aberacijos grupė gali eksponuoti unikalias klinikiniai požymiai, palyginti su P53
ne aberacijos grupei. Epigenetinius kontrolė P53
kelio metu genai vaidina nedidelį vaidmenį apoptozė indukcijos chemoterapinio agento ir apoptozę skrandžio vėžiu, kuris yra sukeltas epigenetinio sugrįžimas gali būti paaiškinta daugiausia išskyrus P53 kelias. Taigi, P53
būdas yra mažai tikėtina, kad vaidinti pagrindinį vaidmenį apoptozės sukeltos CDDP kartu su epigenetinių procedūros. Tačiau P53
kelias buvo pranešta vaidina svarbų vaidmenį gamtos skrandžio kancerogenezėje [41-44]. Taigi, mūsų atradimas, kad P53
kelias genų metilinimas buvo rasti tik skrandžio vėžio su P53
laukinio tipo statusas gali būti svarbus pastebėjimas, ir tokie pakitimai naviko audiniuose gali sukelti naviko progresavimas , Būtent dėl ​​šių priežasčių, kad P53
kelias aberacijos gali turėti prognostinė vertė chemoterapinių poveikį skrandžio vėžio.

Pagalbinė informacija
S1 pav. Ypatumai yra PGP9 pervežimas. 5
NMDAR2B
ir CCNA1
skrandžio vėžio.
(A) TaqMeth vertybių metilinimo kiekvieno geno skrandžio vėžio ir į atitinkamą įprastą gleivinės rodomi. (B) TaqMeth vertės kiekvieno geno klasifikuojami pagal P53 pervežimas genų statuso naviko rodomi. Duomenys išreikštas reiškia ± SD
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0139902.s001
(TIF)
S2 pav.

• PLoS ONE: nereguliuojamoje išraiška SRC, Lyn CKB kinazės DNR metilinimo ir jos galimą vaidmenį skrandžio vėžio invazijos ir Metastasis
• PLoS ONE: genetinės variacijos 3-jų neišverstų regiono NBN Gene yra susijęs su skrandžio vėžiu riziką Kinijos Population