PLoS ONE: Exclusive Association of p53-Mutation mit Super-High Methylierung von Tumorsuppressor-Gene im p53-Pathway in einer einzigartigen Magenkrebs Phenotype

Abstrakt

Hintergrund

Eine umfassende Suche nach DNA methyliert Gene Kandidat Tumor-Suppressor-Gene identifiziert, die nachgewiesen worden sind, in dem apoptotischen Prozess des p53
Weg beteiligt werden. In dieser Studie untersuchten wir p53
Mutation in Bezug auf solche epigenetischen Veränderung in der primären Magenkrebs

Methoden

Die Methylierungsprofile der drei Gene:. PGP9
. 5
, NMDAR2B
und CCNA1
, die in der p53-Tumorsuppressor-Pathway in Kombination beteiligt sind, mit p53
Mutation waren in 163 primären Magenkrebs untersucht. Die Wirkung von epigenetischen Reversion in Kombination mit chemotherapeutischen Arzneimitteln auf die Apoptose wurde auch nach dem Tumor beurteilt p53
Mutationsstatus.

Ergebnisse |

p53-Gen
Mutationen wurden in 44 primären Tumoren des Magens (27%), und Super-High-Methylierung von einem der drei Gene wurde nur gefunden in den Fällen, die mit Wildtyp p53
gefunden. Höhere p53
Weg Aberration wurde in Fällen mit männlichen Geschlecht (p = 0,003), Darm-Typ (p = 0,005) und nicht-Infiltrations Typ (p = 0,001) gefunden. Die p53
Weg Verirrung Gruppe zeigten weniger Rezidive in Lymphknoten, entfernte Organe und Peritoneum als die p53
nicht Verirrung Gruppe. In der NUGC4 Magenkrebs-Zelllinie ( p53
Wildtyp), Augmented epigenetische Behandlung Apoptose durch chemotherapeutischen Arzneimitteln, teilweise durch p53
Transkriptionsaktivität. Auf der anderen Seite, in der Krebszelllinie KATO III ( p53
Mutante), epigenetische Behandlung allein robust Apoptose induziert, ohne trans-Aktivierung von p53
.

Fazit

In Magenkrebs, p53
relevanten und nicht relevanten Wege existieren, und Tumoren mit entweder Weg Typ zeigten einzigartige klinische Merkmale. . Waraya M, Yamashita: Epigenetische Behandlungen können nach anderen Mechanismus als durch p53
Wege

Citation Apoptose teilweise durch p53
Aktivierung jedoch ihre apoptotische Wirkung erklärt werden kann weitgehend induzieren K, Ema A, Katada N, Kikuchi S, Watanabe M (2015) Exclusive Association of Mutation p53
mit super-High Methylierung von Tumorsuppressor-Gene in der p53
Pathway in einer einzigartigen Gastric Krebs Phänotypen. PLoS ONE 10 (10): e0139902. doi: 10.1371 /journal.pone.0139902

Editor: Qian Tao, der Chinese University of Hong Kong, HONG KONG

Empfangen: 31. März 2015; Akzeptiert: 18. September 2015; Veröffentlicht: 8. Oktober 2015

Copyright: © 2015 Waraya et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind innerhalb des Papiers und seiner Hintergrundinformationen Dateien

Finanzierung:. Diese Arbeit teilweise durch die Erteilung-in-Hilfe für Krebsforschung aus dem Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt von Japan und von der japanischen Stiftung unterstützt wurde Multidisziplinäre Behandlung von Krebs. Die Förderagenturen hatten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, Datenerfassung oder Analyse; bei der Interpretation der Ergebnisse; bei der Herstellung der Handschrift; oder bei der Entscheidung, das Manuskript zur Publikation einzureichen

Konkurrierende Interessen:. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

DNA-Methylierung spielt eine zentrale Rolle in. Gen-Silencing von Tumorsuppressorgenen in menschlichen Krebs. Ein Krebs-spezifische Methylierungs Gen ist eine seltene Einheit, und häufige Aberration der Methylierung in primären Tumorgeweben ist noch seltener [1, 2]. Wir identifizierten krebsspezifischen Genen methyliert in jedem Organ eine pharmakologische Demaskierung Mikroarray unter Verwendung von (PUM) [1, 2] und einem modifizierten PUM [3-5]. Wir identifizierten viele Kandidaten Tumor-Suppressor-Gene (gtS), wie zB PGP9
. 5 Hotels in Kopf und Hals Plattenepithelkarzinom (HNSCC) [2], Ösophagus SCC (ESCC) [6] , Magenkrebs [4], und andere Krebsarten [7], NMDAR2B
in ESCC [3] und Magenkrebs [8] und CCNA1
in HNSCC [2]. Die Methylierung Profile dieser Gene wurden durch andere Gruppen bestätigt und /oder auch in anderen Krebsarten [9-14]. Gene, die mehr als 60% Methylierung in Tumorgeweben zeigten, wurden als sehr relevant methylierte Gene (HRMGs) [15] bezeichnet. Darüber hinaus sind weitere wir die Häufigkeit solcher anomale Methylierung von Kandidaten HRMGs mit anderen Berichten von Magenkrebs im Vergleich [16], und Gen-Kandidaten wurden auf spezifische Gene verengt.

Am wichtigsten ist, hatten diese Kandidaten Tumorsuppressor-Gene gewesen berichtet in der p53
Tumorsuppressor-Weg (Bild 1) zu sein. Zum Beispiel: PGP9
. 5
direkt interagiert mit p53
und stabilisiert p53 und Videos dessen Abbau durch die Ubiquitinierung Weg in hepatozellulären [17] Hemmung , Brust [18], und Nasen-Rachen-Krebs [19]. NMDAR2B
induziert Apoptose durch seine direkte Wechselwirkung mit DAPK
[20], das sich wiederum gezeigt wurde Onkogen-induzierten Transformation durch Aktivieren einer p19ARF
/entgegenzuwirken p53
apoptotischen Checkpoint [21] -abhängigen. CCNA1
ist ein p53
-induzierte Gen, das die Apoptose, G2 /M Arrest vermittelt, und mitotische Katastrophe in der menschlichen Niere, Eierstock- und Lungenkrebs-Zellen [22]. Daher wird die p53
Weg in Tumorgewebe von Primärtumoren in einer epigenetischen Weise zusammen mit dem Wildtyp abgetragenen p53
, aber es gab keinen Bericht über die Assoziation von p53
Mutation und epigenetischen Veränderungen in primären Tumorgewebe.

in dieser Studie untersuchten wir die DNA-Methylierungsstatus von Genen in der p53
Weg, der ungewöhnlich in einer epigenetischen Weise in primären Magen reguliert werden Krebs und deren Methylierungsmuster mit der im Vergleich Status p53
Mutation, um die klinische Bedeutung von p53
Verirrung Phänotypen zu bestimmen.

Methoden

Zell Linien und Gewebeproben

die Zelle Magenkrebs Linien, KatoIII, NUGC4, AZ521 und SH10 wurden aus dem RIKEN BioResource Center (Ibaraki, Japan) erworben. Und das hepatozelluläre Karzinom-Zelllinie HepG2 wurde von der American Type Culture Collection (Manassas, VA) erworben. Diese Zelllinien mit Ausnahme AZ521 und HepG2 wurden in RPMI 1640-Medium (GIBCO, Carlsbad, CA), supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum gezüchtet. AZ521 und HepG2 wurden in DMEM-Medium (GIBCO) gezüchtet, das mit 10% FBS ergänzt.

Pairs (n = 163) von in Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Tumorgewebe und entsprechenden normalen Schleimhautproben erhalten bei mindestens 5 cm vom Tumorrand von Patienten erhalten wurden Operation zwischen dem 1. Januar unterziehen, 2000 und 31. Dezember 2010. alle Patienten mit Stadium II /III GC hatte eine potenziell kurative Resektion des Primär GC unterzogen, und unterzog sich Adjuvans S -1 Chemotherapie nach der Operation (S-1 Standard-Behandlung). Neo-adjuvante Therapie wurde in dieser Patientengruppe durchgeführt. Die Tumore wurden unter Verwendung der TNM-Klassifikation klassifiziert nach der 7 ^{th Ausgabe der Union for International Cancer Control (UICC) und dem 14 th Ausgabe der japanischen Klassifikation von Magenkarzinom (JCGC). Die Patientencharakteristika sind in Tabelle 1 Alle Gewebeproben dargestellt an der Kitasato University Hospital gesammelt wurden, und eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Patienten und gesunden Spendern vor der Probensammlung erhalten. Die vorliegende Studie von der Ethikkommission der Universität Kitasato genehmigt wurde.}

Analyse von mutierten p53
Gene unter Verwendung von SSCP (SSCP)

Mutationen in den Exons 5, 6, 7 und 8 des p53
Gen wurden durch nicht-radioaktive SSCP (SSCP) Analyse, die unsere bereits etablierten Methoden durchgeführt wurde gesiebt, [23]. PCR Produktproben von 10 ul wurden dreifach mit Gel-Ladepuffer verdünnt (95% deionisiertes Formamid, 20 mmol /L EDTA, 0,01% Bromphenolblau und 0,01% Xylencyanol) und erhitzt auf 95 ° C für 10 min, gefolgt von Abschrecken auf Eis. Aliquots von 3 &mgr; l wurden auf modifizierte Polyacrylamidgele (18% Polyacrylamid-bis (49: PAFG 1), 0,5x TBE, 10% Glycerin, 10% Formamid, 0,05% Ammoniumpersulfat und 30 ml TEMED) aufgetragen Abmessungs 120 mm x 150 mm x 0,35 mm. Die Elektrophorese wurde mit 1,5 x TBE-Laufpuffer bei 500 V und 30 mA für 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Banden wurden durch Anfärben Gelen unter Verwendung einer Silberfärbung Plus-Kit (Bio-Rad, Hercules, CA), gefolgt von der Fixierung erfaßt, Spülen, Entwicklung, und Stoppen der Reaktion. Mutierte Banden nachgewiesen mit PCR-SSCP waren bei 1:64 Verdünnung von mutierten Allelen evident.

Die Bisulfit-Behandlung von DNA extrahiert

genomischer DNA aus FFPE Geweben und Zelllinien extrahiert wurde die QIAamp DNA FFPE mit Tissue Kit (QIAGEN Sciences, Maryland, MD) und der QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) nach den Protokollen des Herstellers. Für die DNA-Denaturierung, 2 ug genomische DNA wurde bei 50 ° C für 20 Minuten mit 5 &mgr; g Lachssperma-DNA in 0,3 mol /l NaOH inkubiert. Die DNA-Probe wurde dann mit 500 ul einer Lösung, verdünnt mit 2,5 mol /l Natriummetabisulfit enthält (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO) /125 mmol /l Hydrochinon (Sigma) /0,4 mol /l Natriumhydroxid-Lösung, und wurde für 1,5 Stunden bei 70 ° C inkubiert. Die Probe wurde dann auf eine Säule (Wizard DNA Clean-up-System, Promega Inc., Madison, WI), inkubiert mit 0,3 mol /l NaOH für 10 Minuten und anschließend mit 3 mol /l Ammoniumacetat für 5 Minuten behandelt. Die Probe wurde in 100% Ethanol ausgefällt, und die DNA wurde in 50 &mgr; l Lote, enthaltend 10 uM Tris-HCl, pH 8 und 2,5 uM Ethylendiamintetraessigsäure Essigsäure (EDTA), pH 8, und wurde anschließend verstärkt durch eine Polymeraseketten resuspendiert Reaktion (PCR). Die Bisulfit-Behandlung führt in der chemischen Modifikation von nicht-methylierten, aber nicht methyliert, Cytosin zu urazile, so dass die Unterscheidung zwischen methylierter und nicht methylierter genomischer DNA.

Quantitative-Methylierungs-spezifische PCR (Q-MSP)

Für die quantitative Methylierungsanalyse, TaqMan-Methylierungs-spezifische PCR (Q-MSP) wurde die iQ ™ Multiplex Powermix durchgeführt (Bio-Rad) in dreifacher Ausfertigung auf dem iCycler iQ ™ Real-Time PCR Detektionssystem (Bio-Rad). PCR-Bedingungen und die Sequenzen sind in Tabelle S1 vorgesehen. Reihenverdünnungen von Bisulfit modifizierte CpGenome universal methylierte DNA (Chemicon International, Temecula, CA) wurden verwendet, um die Kalibrierungskurve auf jeder Platte zu konstruieren als Methylierungs positive Kontrollen und CpGenome universal unmethylierte DNA (Chemicon International) als negative Kontrolle verwendet wurde. Der Methylierungswert (TaqMeth-Wert) wurde als das Verhältnis von methylierter definiert PGP9
. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
oder DAPK
normiert auf methylierte β-Actin
, die dann von 100.

die immunhistochemische Färbung von PGP9.5 multipliziert wurde, NMDAR2B und CCNA1

Für die Immunfärbung, Antigen Demaskierung mit Autoklaven Einweichen wurde die endogene Peroxidase-Aktivität durch Inkubation für 5 Minuten, und unspezifische Antikörperbindung wurde blockiert durch Inkubation mit 1% verdünntem normalem Pferdeserum in 3% H _{2 O 2 /Methanol 30 blockiert wurde durchgeführt, Protokoll. Die Schnitte wurden dann bei 4 ° C über Nacht inkubiert, mit den folgenden Antikörpern: rabbit PGP9.5 polyklonalen Antikörper (Verdünnung von 1:. 200, Nonus Biogenesis), Kaninchen NMDAR2B polyklonalen Antikörpers (Verdünnung von 1: 100, Millipore) oder Maus-Cyclin A monoklonalen Antikörper (6E6, Verdünnung von 1:50, Leica Biosystems Newcastle. Ltd.). Immunkomplexe wurden mit dem Vectastain Elite ABC Kit (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) nachgewiesen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Diese Immunkomplexe wurden unter Verwendung des detektierten 3,3'-Diaminobenzidin-Substrat (Vector) als Chromogen (PGP9.5 1,5 Minuten, 6 Minuten NMDAR2B, CCNA1 10 Minuten). Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt.}

Epigenetische Behandlung mit 5-Aza-dC und TSA und chemotherapeutische Behandlung mit CDDP

Die Zellen wurden aufgeteilt und entkernt mit einer niedrigen Dichte (1x10 ^{6 /T-75-Kolben) 24 Stunden vor der Behandlung. Die Zellen wurden dann mit alle 24 Stunden für 4 Tage behandelt entweder 1 oder 5 &mgr; M 5-Aza-2'-Desoxycytidin (5-Aza-dC, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) in 50% iger Essigsäure gelöst oder wurden mock behandelt mit PBS die gleiche Menge an Essigsäure einschließlich. Wie bereits erwähnt, 100 nM von trichostatinA (TSA, Sigma-Aldrich). Und /oder 12.5 uM Cis-diaminedichloroplatinum (CDDP) (Nichi-Iko Pharmaceutical Co., Ltd., Japan) wurde für die letzten 24 Stunden hinzugefügt}

Western-Blotting-Analyse

Gesamtprotein wurde aus Zelllinien extrahiert, die epigenetically mit /ohne chemotherapeutische Behandlung behandelt wurden, und wurde in Western-Blot-Analyse unterzogen unter Verwendung der folgenden Antikörper: Maus-anti-p53 monoklonalem Antikörper (1C12, Verdünnung von 1: 1000, Cell Signaling Technology, Inc.) oder Maus-Anti-β-Actin-IgG _{2a monoklonalen Antikörper (Verdünnung von 1: 10000, Sigma-Aldrich)}

p53-Reportertest

die Zellen (2x 10 ^{4 Zellen /96-Well-Platte), die mit /ohne chemotherapeutische Behandlung mit einem wurden epigenetisch behandelt wurden transfiziert p53
Reportervektor (QIAGEN) unter Verwendung von Signal ™ Pathway Reporter Kits ( QIAGEN) und dem Lipofectamine 2000-Reagens (Invitrogen). Nach 24 Stunden Inkubation wurde die Reporteraktivität gemessen, um die Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) verwendet. Transfektionen wurden in dreifacher Ausfertigung und unter Verwendung SoftMax Pro-Software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).}

Apoptosis Assay

Die behandelten Zellen (1x 10 ^{5 Zellen /Probe) wurden gefärbt mit geführt Annexin V und 7-AAD (Guava Nexin Reagenz, Guava Technologies, Hayward, CA) zur Unterscheidung von frühen und späten apoptotischen Zellen. Das Experiment wurde das Guava PCA-System durchgeführt, wobei in dreifacher Ausführung durchgeführt und analysiert CytoSoft 2.1.5 Software (Guava Technologies) verwenden.}

Die statistische Analyse

Fisher-Test oder der Mann-Whitney-U Test wurde für kategoriale Variablen verwendet, und Student t
-Test wurde für kontinuierlichen Variablen verwendet. Daten ausgedrückt werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD). Die Kaplan-Meier-Methode wurde verwendet, kumulative Überlebensrate zu schätzen, und die Unterschiede in der Überlebensraten wurden mit dem Log-Rank-Test bewertet. Relapse freie Überleben (RFS) und Gesamtüberleben (OS) wurden ab dem Zeitpunkt der Operation bis zum Zeitpunkt des erneuten Auftretens und Tod, oder der letzten Follow-up gemessen. Im Hinblick auf RFS oder OS, Patienten, die länger als 60 Monate überlebt (5-Jahre) wurden als Überlebende analysiert. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant anzuzeigen. Alle statistischen Analysen wurden mit SAS-Software-Pakete (SAS Institute, Cary, NC) durchgeführt.

Ergebnisse |

p53
Genstatus und Methylierungsmuster von PGP9
. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
und DAPK
in pStage II-III Magenkrebs

p53
Mutationen wurden in 44 von 163 primären Magenkrebs-Patienten (27%) von SSPC Analyse identifiziert. p53
Gen-Mutation hatte keine prognostische Relevanz (2A). Wir analysierten dann die Methylierungsmuster von PGP9
. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
und DAPK
in diesen Geweben unter Verwendung von Q-MSP. Der TaqMeth Wert aller Gene war höher in Primärtumoren von Magenkrebs mit Wildtyp p53
als in denen mit mutierten p53
(Genmethylierung Ordnung. PGP9
5
> NMDAR2B
> CCNA1
> DAPK
) (3A und S1 und S2 Figuren). Die Methylierung des Promotors war DNA signifikant höher bei CCNA1
(p < 0,0001) und PGP9
5
(p = 0,03), und geringfügig signifikant höher bei NMDAR2B
(p = 0,10) und DAPK
(p = 0,05) in primären verglichen Magenkrebs zu der entsprechenden normalen Schleimhaut. Wichtig ist, dass ein Super-High-Methylierungsgrad von PGP9
. 5
, NMDAR2B
und CCNA1
ausschließlich in Primärtumoren mit nicht gefunden p53
Mutation, die weggeschnittenen TaqMeth Werte waren 50, 163, bzw. 133 (Fig 3A). Solche Super-High-Methylierung von PGP9
. 5
, NMDAR2B
und CCNA1 Hotels in 14 gefunden wurde, 19 und 8 Proben sind und einige dieser Proben wurden überlappend (Fig 3B). DAPK
hat diesen Trend nicht angezeigt werden, weil die DAPK
Methylierungsgrad in den entsprechenden normalen Schleimhaut Gewebe eines beträchtlichen Teils der Fälle (S2) Bild ziemlich hoch war.

Immunhistochemische Analyse von PGP9.5, NMDAR2N und CCNA1 Proteinexpression in primären Magenkrebs

Die immunhistochemische Färbung für PGP9.5, Ausdruck NAMDR2B und CCNA1 Protein wurde dann sowohl mit Super-High-Methylierung in den Fällen durchgeführt und diejenigen, mit geringer Methylierung dieser Gene. Eine starke Verringerung der Expression von PGP9.5, NMDAR2B und CCNA1 wurde in primären Magenkrebs Gewebe beobachtet, wenn die Promotor-DNA-Methylierungs-super-high (Abb 3) war. Auf der anderen Seite, keine Verringerung der Proteinexpression von PGP9.5, NMDAR2B oder CCNA1 gefunden wurde, wenn der Promotor DNA-Methylierung war gering (Bild 4).

Clinicopathological Analyse in primären Magenkrebs mit pathologischen Stadium II /III Magenkrebs mit Standardbehandlung

klinisch-pathologischen Eigenschaften und Prognose (5-Jahres-RFS und OS) wurden dann in einer univariable Weise bei Magenkrebs mit pathologischen Stadium analysiert II /III Magenkrebs mit Standard-Behandlung (Operation plus postoperativen S-1-Verabreichung) (Tabelle 1). Wir stuften die Magenkrebs-Patienten in drei Kategorien, basiert auf der p53
Mutationsstatus sowie die DNA-Methylierungsstatus von PGP9
. 5
, NMDAR2B
und CCNA1
, die wir als genomische und epigenetische Kategorien jeweils bezeichnet (GEC). Diese drei Kategorien waren p53
Mutante, p53
Wildtyp mit superhohen Methylierung (SHM) der oben genannten 3 p53
Pathway-Gene ( p53
WT /SHM) und p53
Wildtyp ohne (w /o) SHM ( p53
WT w /o SHM).

Interessanterweise klassifiziert Patientengruppen basierend auf GECS wurden mit dem Geschlecht (p = 0,0003) signifikant korreliert, Alter (p = 0,08), Lauren Histologie (p = 0,005) und Infiltration Muster (p = 0,001), aber nicht mit prognostischen Faktoren wie Inszenierung Faktoren. Patientengruppen eingestuft basierend auf den GECS zeigte auch, dass p53
Mutante und p53
WT /SHM-Gruppen in Bezug auf die Patientennummer für jede klinische Charakteristik ähnlich waren, aber in dieser Hinsicht unterschied sich, wenn sie die im Vergleich p53
WT w /o SHM-Gruppe. So haben wir neu die früheren Gruppen (die p53
Mutante plus die p53
WT /SHM-Gruppen), wie die p53
Verirrung Gruppe, und die letztere Gruppe bezeichnet ( p53
WT w /o SHM) wurde als p53
nicht Verirrung Gruppe bezeichnet.

Obwohl die Prognose unter den Gruppen nicht signifikant verschieden war nach GEC (2B eingestuft ) wurden mehr Rezidive in der p53
Verirrung Gruppe an die p53
nicht Verirrung Gruppe (Tabelle 1, kein statistisch signifikanter Unterschied) im Vergleich gefunden. Dieser Trend wurde im Hinblick auf das Wiederholungsmuster von jedem der Lymphknoten, Bauchfell und entfernte Organe (Tabelle 2) erhalten, was darauf hindeutet, dass die p53
Verirrung Gruppe wahrscheinlich ist eine klinisch einzigartigen Phänotyp zeigen sogar von einem prognostischer Sicht. Wenn nur die Fälle mit Rezidiven analysiert wurden, die p53
Verirrung Gruppe wieder signifikant mit Lauren assoziiert der Histologie (Tabelle 2, P = 0,01), jedoch gab es keine Wiederholungsmuster, die auf einzigartig waren p53
Verirrung.

auf der anderen Seite zeigte die diffuse Art von Magenkrebs signifikant bessere Prognose als die Darm Typ von Magenkrebs in der p53
Verirrung Gruppe (5A). Da solche Patienten zu einem fortgeschrittenen Stadium verteilt werden neigten, schlug diese Überlebensdaten, dass S1 postoperative adjuvante Chemotherapie für diffuse Art Magenkrebs wirksamer ist, als für die Darmtyp Magenkrebs in Fällen mit p53
Weg Aberration (Abb 5B).

Schließlich als Referenzdaten (Tabelle 1), univariable prognostische Analyse für RFS und OS aller klinisch signifikantes Potenzial Prognosefaktoren darstellen schlechte Überleben wie Geschlecht identifiziert Patienten (p = 0,03, p = 0,1) , Alter ≥67 Jahre (P = 0,009, p = 0,001), obere Tumorlokalisation (P = 0,06, p = 0,1), die 14 ^{th JGCA /7 th UICC pT (P = 0,08, p = 0,4), die 14 th JGCA pN (P = 0,001, p = 0,06), und die 14 th JGCA /7 th UICC-Stadium (p <. 0,0001, P = 0,03)}

Epigenetische Behandlung induzierte p53-Protein-Expression, konkordant mit p53 Transkriptionsaktivität

Epigenetische Behandlung von NUGC4 Magenkrebszelllinien (Wildtyp p53
) mit 5 &mgr; M 5-Aza-2 ' Desoxycytidin oder 5 &mgr; M 5-Aza-2'-desoxycytidin plus eine robuste induzierte Apoptose in Abwesenheit des chemotherapeutischen Mittels CDDP Trichostatin. Eine zusätzliche Behandlung mit CDDP weiter verstärkt signifikant diese apoptotischen Effekte (6C). Interessanterweise CDDP in Kombination mit epigenetischen Behandlungen erhöht robust die p53 Proteinebene, die teilweise, aber nicht vollständig, reflektiert p53
Transkriptionsaktivität eines Luciferase-Reportergen (6A und 6B). Diese Befunde legen nahe, dass p53
Transkriptionsaktivität kann durch epigenetische Behandlungen reaktiviert werden, aber es zeigt auch, dass die Apoptose nur teilweise induziert durch die p53
Weg.

Darüber hinaus epigenetische Magenkrebszelllinien Behandlung von KatoIII ( p53
null), mit 1 &mgr; M 5-Aza-2'-Desoxycytidin oder 1 &mgr; M 5-Aza-2'-desoxycytidin und Trichostatin A robust induzierte Apoptose in Abwesenheit von CDDP, aber zusätzliche CDDP Behandlung nicht weiter signifikant die apoptotische Wirkung (6C) zu erweitern. CDDP in Kombination mit epigenetischen Behandlungen haben die p53 Proteinspiegel nicht erhöht, die durch das Fehlen von p53
Transkriptionsaktivität eines Luciferase-Reportergen (6A und 6B) reflektiert wurde. Diese Befunde legen nahe, dass p53
Transkriptionsaktivität nicht für die Apoptose durch epigenetische Behandlungen in KatoIII Zellen erforderlich ist ( p53
null Zellen).

Diskussion

Diese aktuelle Studie ist der erste Bericht, dass SHM von Tumor-Suppressor-Gene, die in der p53
Weg sind ausschließlich in pathologischen Stadium II /III Magenkrebs mit Wildtyp p53
(Bild 3) gefunden. Wir wählten pStage II /III Magenkrebs-Patienten mit Standard-Behandlungen für p53
Pfadanalyse, weil multidisziplinäre Behandlungen bei solchen Patienten zur Erreichung prognostische Verbesserung mit kompletter Heilbarkeit das beste Potenzial haben [24, 25]. Diese Überlegung sollte die erste Priorität sein, wenn die weitere Entwicklung neuer Therapiestrategien unter Berücksichtigung.

Eine nahezu vollständige Methylierung von Promotor-DNA-CpG-Inseln ist für die vollständige Gen-Silencing erforderlich, und auch geringe Anteile an nicht-methylierte Allele robust Genexpression induzieren [ ,,,0],1-5]. In den primären Tumorgeweben, SHM müssen fast vollständige Methylierung in Krebszellen und SHM in den primären Tumorgeweben darstellen, wurde in der Tat mit reduzierter Protein-Expression solcher Gene (Fig 4) zugeordnet ist. Dieses Ergebnis legte nahe, dass SHM von Genen in der p53
Signalweg funktional äquivalent sein könnte p53
funktionelle Aberration, die von als Ergebnis tritt p53
Mutation, da diese 3 -Moleküle Funktion in der gleichen p53
Weg.

in Magenkrebs, die p53
Verirrung Gruppe signifikant mit einzigartigen klinisch-pathologischen Phänotypen wie Lauren Darm-Histologie, männliches Geschlecht assoziiert war, alt Alter und weniger infiltrative Wachstum (Tabelle 1). Unsere aktuellen Beobachtungen können zu früheren Berichten in Beziehung gesetzt werden, die zeigten, dass p53
Mutation mit frühen Stadium der intestinalen Typ Magenkrebs korreliert ist, oder mit späten Stadium der diffusen Art Magenkrebs [26, 27], oder ältere Alter [ ,,,0],28], aber unsere klinisch-pathologischen Analyse umfasste hauptsächlich mittlere Magenkrebs Stadium. Interessanterweise Weg Aberration ist einzigartig und nachhaltig auch bei rezidivierenden Patienten (Tabelle 2).

Positive prognostische Relevanz von p53
Mutation bei Magenkrebs ist umstritten, mit beiden Anhänger [29] und Abweichler [30 ] von dieser Möglichkeit. Auf den ersten Blick scheint unsere Daten die letztere Gruppe zu unterstützen, es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass unser Überleben Daten wahrscheinlich ist durch postoperative adjuvante Chemotherapie (Standardtherapie in Japan) modifiziert wurden. Während im Gegensatz zu der vorliegenden Studie, die diffuse Art von Magenkrebs zeigte schlechtere Prognose als der intestinalen Typ von Magenkrebs in unserer Klinik vor Jahrzehnten [15, 31], die neuesten aktualisierten Überlebensdaten, die die entgegengesetzte Ergebnisse unterstützen (dh die Darm Art von Magenkrebs zeigt schlechtere Prognose als die diffuse Art von Magenkrebs), die aufgrund von S-1 postoperative adjuvante Wirkung mutmaßlich ist [32]. Die postoperative adjuvante S-1 Chemotherapie wurde vorgeschlagen, signifikant wirksamer für Peritonealdialyse-Krankheit zu sein, als für die Entfernung von Organmetastasen [24], und es ist wahrscheinlich effektiver für diffuse Art Magenkrebs zu sein als für Darm-Typ Magenkrebs [32] . Aus diesen Gründen zeigt die letzte Überlebensanalyse, dass die Prognose des diffusen Art von Magenkrebs gegenüber der des intestinalen Typs von Magenkrebs verbessert wird.

Es gab keinen statistischen Unterschied bei der Rezidivrate oder in der einzigartigen Wiederholung Stellen zwischen den p53
Verirrung Gruppe und die p53
nicht Verirrung Gruppe wurden jedoch mehr Rezidive in jedem der Wiederholungsstellen des p53
nicht Aberration gefunden Gruppe in die p53
Verirrung Gruppe verglichen. Diese Ergebnisse könnte darauf hindeuten, dass die p53
nicht Verirrung Gruppe hat einen aggressiveren Phänotyp als die p53
Verirrung Gruppe als Ganzes. In unserer Studie zeigte die diffuse Art von Magenkrebs signifikant bessere Prognose als die Darm Typ von Magenkrebs in der p53
Verirrung Gruppe. Da solche Patienten zu einem fortgeschrittenen Stadium verteilt werden neigten, schlug diese Überlebensdaten, dass S1 postoperative adjuvante Chemotherapie für diffuse Art Magenkrebs wirksamer ist, als für die Darmtyp Magenkrebs in Fällen mit p53
Weg Aberration. Diese Ergebnisse waren konsistent mit früheren Berichten, dass mutierte p53
und /oder Immunfärbung von p53-Protein prädiktiver Biomarker für die positive Wirkung von hochdosiertem neoadjuvante Chemotherapie bei Magenkrebs sein könnte [30].

Wir schließlich epigenetischen Behandlungseffekte in Kombination mit einem chemotherapeutischen Mittel bewertet, um die Bedeutung der p53
Weg zum epigenetische Weg in Magenkrebszellen mit CDDP behandelt zu vergleichen. Unerwarteterweise schien es, dass die p53
Weg unwahrscheinlich war eine sehr wichtige Rolle bei der Apoptose-Induktion durch CDDP (Bild 6) zu spielen. Es wurde vor kurzem gezeigt, dass epigenetische Karzinogenese in der Tat möglich ist. In diesem System induzierte systemische iPS von Faktoren führt in systemischer Krebs Auftreten mit dynamischer epigenetischen Veränderungen Umprogrammierung, während systemische Reversion dieser Reprogrammierungsfaktoren Krebszellen in normale Zellen kehrt [33]. Magenkrebs ist wahrscheinlich weniger Mutationen von Treiber Gene [34] als Darmkrebs [35], und in ähnlicher Weise Mutationen andere als die p53
Gen sind selten bei Brustkrebs [35], was darauf hindeutet, dass epigenetische Karzinogenese Hafen chronische Infektion mit Helicobacter Pylori [36-38] durch eine mögliche wichtige Ursache. Wir haben kürzlich gezeigt, die Hypermethylierung von Reprimo
[39], was wiederum ein Gen in der p53
Weg aber, die in dieser Studie nicht berücksichtigt werden konnten, und von HOPX
[16] und CDO1
[40], die sowohl in der Apoptose beteiligt sind, aber mutmaßlich nicht durch die p53
Weg. Auf der Basis unserer aktuellen Funktions Experimente, die p53
Weg Beitrag zu ist epigenetischen Behandlungseffekte wahrscheinlich viel geringer zu sein als die anderen Bahnen (Bild 5). Wir haben andere Zelllinien (2 Magenkrebszelllinien und 1 hepatozellulären Krebszelllinie), um genau den Beitrag des p53
Weg zur Apoptose von CDDP in Kombination mit epigenetischen Behandlungen induziert bestimmen. Die zusätzliche Experimente durchgeführt werden, in S3 gezeigt. AZ521 und HepG2-Zelllinien sind p53
Wildtyp und die SH10 Zelllinie ist p53
Mutante. p53
Aktivität wurde in der p53
Wildtyp-Zellen nachgewiesen, jedoch war seine Aktivität auf jede Zelllinie abhängig. So p53
Aktivität wurde in NUGC4 Zellen mit CDDP Behandlung und in AZ521 und HepG2-Zellen ohne CDDP Behandlung nachgewiesen. Starke Apoptose, wie durch einen Apoptose-Assay (Caspase 3 oder Nexin Assay) beurteilt hat spiegeln nicht unbedingt den Grad der p53
Transkriptionsaktivierung. In p53
Mutante (SH10) oder p53
null Zellen, p53
Transkriptionsaktivität überhaupt nicht induziert wurde, wurde jedoch Apoptose gefunden p53
Wildtypzellen. Daher wird bei Magenkrebs, apoptotischen auf anderen Wegen als die p53
Weg für die Induktion der Apoptose mehr relevant sein kann als die p53
Weg.

Abschließend p53
Verirrung und nicht Verirrung Patientengruppen existieren bei Magenkrebs, die p53
Wege als Folge der epigenetischen Veränderung von Genen in die Wege sowie aufgrund genomische Mutation anomale sein könnte. Die p53
Verirrung Gruppe aufweisen können einzigartige klinische Merkmale im Vergleich mit dem p53
nicht Verirrung Gruppe. Epigenetische Kontrolle des p53
Pathway-Gene spielen eine untergeordnete Rolle bei der Apoptose-Induktion durch ein chemotherapeutisches Mittel und Apoptose bei Magenkrebs, die durch epigenetische Reversion induziert wird erklärt weitgehend andere durch den Mechanismus sein kann als die p53
Weg. Somit ist die p53
Weg unwahrscheinlich, dass eine zentrale Rolle bei der Apoptose durch CDDP in Kombination mit epigenetischen Behandlungen induziert zu spielen. Allerdings hat die p53
Weg berichtet eine wichtige Rolle in der natürlichen Magen-Karzinogenese [41-44] zu spielen. So sind unsere Entdeckung, dass p53
Pathway-Gen-Methylierung ausschließlich bei Magenkrebs mit einer gefunden wurde p53
Wildtyp-Status kann eine wichtige Beobachtung sein, und solche Veränderungen im Tumorgewebe kann Tumorprogression führen . Es Aus diesen Gründen ist, dass p53
Weg Aberration prädiktiven Wert von chemotherapeutischen Wirkung bei Magenkrebs haben kann.

Grundinformationen
S1 Abb. Die Spezifität der Methylierung von PGP9
. 5
, NMDAR2B
und CCNA1
bei Magenkrebs.
(A) Die TaqMeth Werte jedes Gens in sind Magenkrebs und in der entsprechenden normalen Schleimhaut gezeigt. (B) Die TaqMeth Werte jedes Gen klassifiziert nach der p53
Genstatus des Tumors gezeigt. Daten ausgedrückt werden als Mittelwert ± SD
doi:. 10.1371 /journal.pone.0139902.s001
(TIF)
S2 Abb.

• PLoS ONE: deregulierte Expression von SRC, LYN und CKB Kinasen durch DNA-Methylierungs und seine mögliche Rolle bei Magenkrebs Invasivität und Metastasierung
• PLoS ONE: Genetische Variation in der 3-untranslatierte Region des NBN Gene ist im Zusammenhang mit Magenkrebsrisiko in einem chinesischen Bevölkerung