PLoS ONE: MicroRNA-10a säätyy alas DNA Metylointi ja funktiot tuumorisuppressorina mahasyövän Cells

tiivistelmä

Background

MikroRNA toimivat posttranskriptionaalisella sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen monissa biologisissa prosesseissa. Heidän sääntelyn purkaminen esiintyy yleisesti mahasyövän (GC). Vaikka DNA: n metylaatio on tärkeä mekanismi microRNA sääntelyn syövän, tällä alalla pitkälti edelleen tutkimatta.

Menetelmät /Principal Havainnot

Yhteensä RNA eristettiin kudoksista 100 potilaalla on GC ja neljä mahalaukun syöpäsolulinjoilla. Ilmentymistasojen miR-10a määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä, joilla on erityisiä TaqMan-koettimia. Lisäksi toiminnallinen analyysi miR-10a säätelyssä solujen lisääntymistä, muuttoliike ja invaasio suoritettiin. Sen jälkeen, kvantitatiivinen metylaatiospesifinen PCR (qMSP) käytettiin havaitsemaan DNA: n metylaation tila CpG-saarekkeiden ylävirtaan miR-10a
. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että ilmentyminen miR-10a GC-soluissa oli alhaisempi kuin normaaleissa soluissa, mikä johtui hypermetylaatiota CpG-saarekkeiden ylävirtaan miR-10a
. Olemme myös vahvisti hieman pienempi ilmentyminen miR-10a GC kudoksissa kuin niiden vieressä ei-neoplastisten kudosten 100 GC potilaiden ja vahvisti hypermetylaatiota CpG-saarekkeiden ylävirtaan miR-10a
joillakin potilailla. Lisäksi uudelleen aloittamisen miR-10 a GC soluihin kykeni estävät solujen jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja hyökkäystä. Bioinformatiikan ja immunoblot-analyysi osoitti, että tuumorisuppressorigeenin roolit miR-10a GC-soluja mahdollisesti kohdistuvat HOXA1.

Johtopäätökset /merkitys

tiedot osoittavat, että miR-10a toimii tuumorisuppressorina GC-soluissa ja osittain vaiennetaan DNA hypermetylaation GC, mikä viittaa siihen, että miR-10a voi toimia mahdollisena diagnostinen tai terapeuttinen kohde GC.

Citation: Jia H, Zhang Z, Zou D, Wang B, Yan Y, Luo M, et al. (2014) MicroRNA-10a säätyy alas DNA Metylointi ja funktiot tuumorisuppressorina mahasyövän Cells. PLoS ONE 9 (1): e88057. doi: 10,1371 /journal.pone.0088057

Editor: Jorg Tost, CEA - Institut de Genomique, France

vastaanotettu 26. tammikuuta 2013 Hyväksytty: 04 tammikuu 2014; Julkaistu: 31 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Jia et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (2011, 91129716, ja JY), Pekingin Kunnan Science & Teknologia-komissio (2010B071, jotta J.Y.), Institute of Basic Medical Sciences, Kiinan Academy of Medical Sciences (2009RC03, jotta J.Y .; 2010PYB06, jotta J.Y .; 2012G04, että J.Y.). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on toiseksi yleisin kuolinsyy syöpään maailmassa [1]. Tähän mennessä harvat tuumorisuppressorigeeneille ja kasvaimeen liittyvien geenien on raportoitu GC. Vaikka laajoja tutkimuksia on tehty tunnistamaan geneettisen reittejä ja mekanismeista syövän kehitykseen, muutamia parannuksia varhaista diagnosointia syövän on tehty. MikroRNA (miRNA) ovat endogeenisiä pienet ei-koodaavat RNA: t, jotka on tunnistettu posttranskriptionaalisella sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA kohdistavat niiden toiminnot läpi epätäydellinen emäspariutumista kanssa 3'untranslated alue (3'UTR) kohde- mRNA: iden [2] ja miRNA on tutkittu laajasti yhteydessä solukierron säätelyssä, erilaistumiseen, kehitys ja apoptoosin [3], [4]. Kertyneet todisteet osoittavat, että miRNA sääntely on purettu eri sairauksien, erityisesti syövän. Esimerkiksi miR-216B on selvästi alassäädetty nenänielun karsinooma [4]; miR-340 on vapautettu rintasyövän ja voivat estää rintasyöpäsolujen muuttoliike ja invaasiota [5]; ja miR-31 todettiin onkogeenin ruokatorven okasolusyöpä [6]. Yhdessä miRNA on tunnistettu mahdollisia ehdokkaita uusiin diagnostiikan biomarkkerit tai terapeuttisina kohteina syövän.

MiR-10a on raportoitu tärkeitä rooleja syntyyn ja kehitykseen erilaisten ihmisen syövissä. Esimerkiksi miR-10a vapautetaan säännöstelystä pään ja kaulan okasolusyöpää ja myös maksasolukarsinoomassa [7], [8]. Lisäksi ihmisen kohdunkaulansyövän, miR-10a toimii onkogeenin säätelemällä CHL1 [9]; alas-säätely miR-10a kroonisen myelooisen leukemian edistää CD34 ^{+ solujen lisääntymistä [10]. Kuitenkin toiminta miR-10a ja mekanismia taustalla mahasyövän jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa olemme tarkasti mitattuna ilmentymistä miR-10a 100 potilaasta mahalaukun syöpä ja tutkitaan rooleja miR-10a mahalaukun syöpäsoluja. Huomasimme, että miR-10a oli säädellä vähentävästi GC kudoksissa ja täytäntöön ilmentymistä miR-10a tukahduttanut jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja invaasion GC soluja.}

Epigeneettiset muutoksia mukaan lukien DNA hypermetylaation, histonien deasetyloitumista ja histoni metyloinnin läheisesti liittyy geenin toiminnan lopettamisesta. Promoottori hypermetylaation uskotaan olevan vaihtoehto mekanismi alas-säädellä tuumorisuppressorigeeneille ihmisen syövissä [11]. MiRNA jonka ekspressio on tukahdutettu DNA: n metylaatio on raportoitu muutamissa ihmisen syövissä [12] - [14]. Tutkia tarkemmin, ovatko alas-säätely miR-10a peräisin hypermetylaatiota genomisen alueen ylävirtaan miR-10a
, olemme analysoineet DNA metylaatio CpG saaren promoottorialueen asennuspalveli- 10a
55 GC potilailla ja totesi, että alas-säätely miR-10a GC kudoksissa saattaa johtua hypermetylaatiota CpG-sekvenssit sen promoottori.

Materiaalit ja menetelmät

potilaille ja näytteet

Ihmisen kliiniset näytteet kerättiin kirurgisista näytteistä 100 potilaalla on GC Cancer Institute ja sairaalan, kiina Academy of Medical Sciences, General Hospital kansan vapautusarmeija ja Shanxi Cancer Hospital. Vastaava vieressä olevaan ei-neoplastisten kudosten makroskooppinen kasvaimen raja eristettiin samanaikaisesti ja käytettiin kontrolleina. Kasvaimet lavastettu mukaan TNM (2010) luokituskriteerien unionin International Cancer ohjaus (UICC). Kaikki näytteet jaettiin kahteen osaan ja otettiin heti jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA. Neljä mahasyövän solulinjoissa (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 ja MKN-45) olivat kaikki säilynyt laboratoriossamme ja ylläpidetään DMEM tai 1640 10% FBS. Clinical Research Ethics komitean Institute of Basic Medical Sciences, Kiinan Academy of Medical Sciences hyväksyi tutkimussuunnitelmissa ja kirjallinen suostumus saatiin osallistujille.

RNA Extraction, cDNA synteesi mRNA: iden ja miRNA, ja Real- PCR-määritykset

Kokonais-RNA uutettiin mahasyöpä kudoksia ja soluja käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA kvantitoitiin absorbanssilla 260 nm: ssä, ja cDNA syntetisoitiin M-MLV käänteistranskriptaasia (Invitrogen) 2 ug kokonais-RNA: ta. Oligo (dT) 18: ta käytettiin RT-alukkeina käänteistranskriptioon mRNA. Varsi-silmukka RT-aluketta käytettiin käänteistranskriptio miRNA. Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin Bio-Rad CFX96 reaaliaikainen PCR System (Bio-Rad, CA, USA) käyttäen SYBR Esisekoite Ex Taq (Takara, Dalian, Kiina) tai Taqman (Applied Biosystems, Foster City, CA , USA) mukaan valmistajan ohjeiden. PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 95 ° C 30 s, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 s ja 60 ° C: ssa 34 s. Sillä mRNA: t, data normalisoitiin käyttämällä endogeenista GAPDH kontrolli. Sillä miRNA, U6 snRNA käytettiin endogeenisen ohjaus. Suhteellinen määrä miR-10a mitattiin 2 ^{-ΔΔCT menetelmällä. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S1.}

DNA Extraction, Metylaatiospesifinen PCR (MSP) ja määrälliset Metylaatiospesifinen PCR (qMSP) B

Korkean molekyylipainon genomista DNA: ta uutettiin mahasyöpä kudoksista käyttäen DNA Extraction Kit (Biomed, BJ, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Bisulfiittimodifikaatio suoritettiin käyttäen Epitect bisulfiitti sekvensointi (Qiagen, Hilden, Saksa) protokollan mukaisesti. Enintään 2 ug genomista DNA: ta käytettiin lähtöaineena. Normaali lymfosyytin DNA käsiteltiin CpG- metyylitransferaasi (M.SssI) (NEB, MA, USA) käytettiin positiivisena kontrollina, ja reaktio järjestelmä ilman templaattia käytettiin nollakoe.

natrium- bisulfate- käsitelty DNA: ta monistettiin käyttäen Bio-Rad CFX96 reaaliaikainen PCR System (Bio-Rad) käyttäen KAPA SYBR® FAST qPCR Kits (Kapa Biosystems) kanssa seuraavissa olosuhteissa: 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 30 s, 54 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C: ssa 30 s ja lopullinen pidentäminen 72 ° C: ssa 10 min. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. qMSP reaktiot suoritettiin kolmena kappaleena. Metylointi taso näytteessä arvioitiin Lu L et al. on kuvattu [15]. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S1.

5-atsa-2'-deoxyazacytidine hoito

Mahasyöpää-soluja ympättiin 10 cm: n maljoille (1 x 10 ^{6 solua per malja) päivää ennen lääkehoitoa. Soluja käsiteltiin 1 uM 5-atsa-2'-deoxyazacytidine (5-AZA) (Sigma, MO, USA) 24 tunnin välein 3 päivän ajan.}

Soluviljelmä ja Oligonukleotidit transfektio

ihmisen mahalaukun solulinjat HGC-27, SGC-7901 ja MKN-45 viljeltiin RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, ja MGC-803 pidettiin DMEM: ssä (Gibco, BRL , UK), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia. Nämä solulinjat pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmassa, joka sisälsi 5% CO _2.

miR-10a matkivat, hajotus- matkia, siHOXA1 siRNA ja ryntäily siRNA syntetisoitiin GenePharma (Shanghai, Kiina ) ja transfektoitiin soluihin loppupitoisuuteen 50 nmol /L käyttäen DharmaFECT1 reagenssia (Dharmacon, TX, USA).

Cell Proliferation ja Colony muodostumisen määritys

mimic- tai siRNA- transfektoidut solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille (5000 solua /kuoppa). Soluja inkuboitiin 10% CCK-8 (Dojindo, Japan) 37 ° C: ssa, kunnes visuaalinen väri konversio tapahtui. Proliferaationopeudet määritettiin 0, 12, 24, 48, 72, 96 tuntia transfektion jälkeen.

matkivat-transfektoidut solut trypsinoitiin ja maljattiin uudelleen 200 solua per kuoppa 6-kuoppaisille levyille ja niitä ylläpidetään 1640 10% FBS: ää. Soluja viljeltiin 7 päivää, kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla 20% metanolissa 15 minuutin ajan.

solukuoleman määritys

Apoptosis määritykset suoritettiin HGC-27 ja MGC-803 solulinjoissa käyttämällä anneksiini V-FITC Apoptosis Detection kit I (BD Biosciences) mukaan valmistajan protokollaa ja sitten analysoitiin Calibur Flow Cytometer (Becton Dickinson).

Cell Migration ja Invasion Analyysit

arpeutumisprosessit määritys suoritettiin arvioimaan solujen vaeltamiseen. Keinotekoinen haava on luotu konfluentin yksisolukerroksen ilman FBS käyttäen 200 ui pipetin kärki 24 tuntia transfektion jälkeen. Visualisoida vaeltavien solujen ja haavan paranemista, kuvat otettiin 0, 12, 24, 36, 48, 60 tuntia.

siirtokuoppaan invaasio määritykset, HGC-27 ja MGC-803 solut suspendoidaan 0,2 ml RPMI 1640 tai DMEM ilman FBS pantiin päälle kammion kunkin insertin (Millipore, MA, USA) esipäällystetty 40 ui 1 mg /ml matrigeeliä. Alempi kammio täytettiin 600 ui RPMI 1640 tai DMEM, jossa oli 10% FBS: ää, kuten ravitsemukselliset houkutinta. 24 tuntia myöhemmin, hyökkäys solut kiinnitetty alapintaan fiksoitiin 20% metanolia ja värjättiin May-Gruwald-Giemsa (MGG). Sitten kalvoja veistetty ja upotettu alla peitinlaseja. Solut kolmessa eri näkökentät laskettiin, ja kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.

Western-blottaus

Western blot -analyysi suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti. Proteiinit erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin sitten PVDF-kalvoille (Amersham, Buckinghamshire, UK). Membraanit blokattiin yli yön 5% rasvatonta kuivamaitoa, ja inkuboitiin 2 h anti-HOXA1 vasta-ainetta (Bio- world, MN, USA) 1:500 laimennosten tai anti-GAPDH-vasta-ainetta (Proteintech, Chicago, USA) 1: 50000 laimennoksia. Pesun jälkeen TBST (10 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, ja 0,1% Tween 20: tä), kalvoja inkuboitiin 2 h sekundaarista vasta-ainetta (zsgb-bio, Peking, Kiina).

Tilastot

Jokainen koe toistettiin vähintään kolme kertaa. Opiskelijan t-testiä (kaksisuuntainen) ja x ^{2 testi suoritettiin, ja tilastollinen merkitsevyys määritettiin α = 0.05 (kaksi-puoli). Keinot ± SD näkyvät kuvissa.}

Tulokset

miR-10a alassäädetty mahasyövän Cells

tarkasteltiin ilmentymisen kypsän miR-10a neljä ihmisen mahasyövän solulinjoissa (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 ja MKN-45) ja ihmisen mahalaukun epiteelin solulinja (GES). Ilmaisu taso miR-10a GES oli merkittävä korkeampi kuin tasot kaksi mahasyövän solulinjoissa (HGC-27 ja MGC-803) ja oli ei-merkitsevästi mutta havaittavasti korkeampi kuin tasot kahdessa muussa mahasyövän solulinjoissa (MKN-45 ja SGC-7901) (kuvio. 1a). Nämä tiedot osoittivat, että alas-säätely miR-10a saattaa olla merkitystä synty ja kehitys GC.

Expression of miR-10a kliinisen GC Potilaat ja heidän Korrelaatio kliinis Ominaisuudet

edelleen tutkia suhdetta miR-10a ja GC genesis, havaitsimme ekspressiota miR-10a 100 kliinisissä potilaiden TaqMan-koettimella on johdettu reaaliaikainen PCR edellä kuvatulla tavalla. Out of 100 paria GC näytteiden ilmaus miR-10a oli alassäädetty 58 tapauksessa (58/100, 58%) verrattuna vastaaviin viereisiin kudoksiin (kuvio. 1b). Kaiken ilmaus miR-10a oli säädellä vähentävästi GC kudoksissa verrattuna viereisiin kudoksiin, vaikka alassäätöä ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,148, pariksi t-testi, kaksihäntäinen) (kuvio. 1 c).

arvioimiseksi korrelaatiota ilmentymisen miR-10a ja kliinis ominaisuudet, potilaat jaettiin kahteen ryhmään sen mukaan, suhteellista ilmentymistä miR-10a syövän kudoksissa mukaan aiemmin julkaistu paperi [16] . Kuten on esitetty taulukossa S2, tilastollisesti merkitsevä assosiaatio havaittiin kahden TNM ryhmää. On enemmän potilaita, jotka ovat I + II vaihe ryhmässä alhaisempi ilmaus miR-10a niiden GC kudoksissa. Tämä suhde osoitti, että miR-10a voi olla tärkeämpää alussa syöpä syövän synnyn. Kuitenkin meidän tiedot osoittivat, että ilmentymistaso miR-10a ollut mitään korrelaatiota iän, sukupuolen, histologinen tyyppi, kasvain prosenttiosuus, laskimoiden invaasio, hermo invaasio, asema, Borrmann kirjoittamalla, pT vaiheessa pN vaihe tai pM vaiheessa.

miR-10a Estää Cell Proliferation in vitro

tutkia roolia miR-10a mahasyövän, transfektoimme miR-10a matkivat GC solulinjoihin HGC-27 ja MGC-803, jotka molemmat osoittivat korkean transfektiotehokkuuden (kuvio. 2a). Kuten käy ilmi CCK-8 kasvun määrityksissä 0, 1, 2, 3 ja 4 päivää sen jälkeen, kun matkivat transfektion, yliekspressio miR-10a vähensi solujen proliferaation molemmissa solulinjoissa, kun taas hajotus- matkivat ei ollut vaikutusta solujen proliferaatiota verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuvio. 2b). Sen jälkeen, pesäkkeiden muodostumisen määritykset suoritettiin arvioimaan proliferatiivinen kyky matkia-transfektoitujen HGC-27 ja MGC-803-soluja ja osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-10a HGC-27-soluissa vähentää pesäkemuodostusta (kuvio. 2c). Kuitenkaan yksikään MGC-803 solut muodostivat pesäkkeitä, mikä saattaa johtua solujen suhteellisen heikko noudattaminen. Edelleen käsitellä vaikutusta miR-10a solun apoptoosin kaksi GC solulinjat, varhainen apoptoosi MGC-803 ja HGC-27-soluissa tutkittiin anneksiini V-värjäys miR-10a matkivat transfektiota. Kuten odotettua, muutaman varhainen apoptoottiset solut (20,8% HGC-27 ja 22,9% vuonna MGC-803) havaittiin ryntäily matkivat käsiteltyjä soluja, kun taas miR-10a jäljittelee käsittely lisäsi prosenttiosuutta varhaisen apoptoottisten solujen (28,4% vuonna HGC -27 ja 27,7% vuonna MGC-803) (kuvio. 2d). Yhdessä me päätellä, että miR-10a voi tukahduttaa solujen selviytymistä GC soluissa indusoimalla apoptoosia.

miR-10a Estää Cell Migration and Invasion in vitro

entisestään arvioi vaikutukset miR-10a solumigraation ja invaasio, jotka olivat keskeisiä tekijöitä pahanlaatuisten etenemisen ja etäpesäkkeiden. Siirtyminen Kyky osoitettiin haavan paranemisen /naarmu määritystä HGC-27 ja MGC-803 soluja. Molemmat solulinjat käsiteltiin miR-10a matkivat oli leimallisesti vähemmän muuttavia kuin käsitelty ryntäily valvontaa tai käsittelemättömiä soluja 12, 24, ja 36 tunnin kuluttua raapiminen (kuvio. 3a). Lisäksi teimme Matrigel solu invaasiomääritys ja värjätään hyökkäsi solujen mitata suuntaava hyökkäys kyvyt solujen jälkeen ektooppisesti ilmentävät miR-10a kahdessa solulinjassa. Invasiivisuus transfektoitujen solujen miR-10a matkivat dramaattisesti vähentynyt verrattuna sekoituskoodin ohjaus ja käsittelemättömien solujen (kuvio. 3b). Nämä tulokset osoittivat, että miR-10a pelataan tärkeä rooli säätelyssä solujen vaeltamiseen ja invasiivisuus GC ja ehdotti, että alas-säätely miR-10a saattaisi edistää kasvaimen metastaaseja mahasyövän.

miR-10a Tavoitteet HOXA1 vuonna GC

miRNA biologisia toimintoja kautta negatiivisesti säätelevät niiden kohdegeenien. On raportoitu, että onkogeeni HOXA1 on välittömänä kohteena miR-10a Megakaryosyyttien ja ihmisen haimasyövän [17] - [19]. Kuten ennustaa PicTar, oli komplementaarinen sekvenssi välillä on-miR-10a ja HOXA1 3'UTR (kuvio. 4a). On kuitenkin epävarmaa, miR-10a säätelee solujen lisääntymistä, muuttoliike ja hyökkäyksen GC kohdistamalla HOXA1. Selventämään sääntelyn suhteen, me ensimmäinen havaittu proteiini- ja mRNA tasot HOXA1 in miR-10a matkivat transfektoiduissa HGC-27 ja MGC-803-soluissa käyttäen western blotting ja RT-PCR. Havaitsimme ilmeinen lasku HOXA1 proteiinin taso läsnäollessa miR-10a jäljittelee verrattuna ryntäily säädin kaksi solua (kuvio. 4b). MRNA taso HOXA1 myös säädellä vähentävästi HGC-27 soluihin, mikä viittaa siihen, että miR-10a estää HOXA1 ilmentymistä hajottamalla mRNA HOXA1 in HGC-27 soluihin. Oli kuitenkin pieni muutos mRNA tasolla HOXA1 in MGC-803 soluja, mikä viittaa siihen, että miR-10a saattaisi vaimennussäätelevät HOXA1 ilmaisun translaation tukahduttaminen mutta ei mRNA: ksi lohkeamisen MGC-803-soluissa (kuvio. 4c). Lisäksi olemme analysoineet proteiinin tasot HOXA1 24 GC potilailla. Näistä näytteistä oli 12 potilasta, joille miR-10a oli alassäädetty niiden GC kudosten ja 12 potilasta, joille miR-10a oli säädellään ylöspäin niiden GC kudoksissa (kuvio. 4d). HOXA1 oli säädelty useimmissa potilaille, joille miR-10a oli alassäädetty niiden GC kudoksissa. Samoin HOXA1 oli alassäädetty useimmissa potilaille, joille miR-10a oli säädellään ylöspäin niiden GC kudoksissa. Vertailu miR-10a tasoa ja proteiinin tasot HOXA1 GC paljasti käänteinen korrelaatio miR-10a ja HOXA1 (r ^{2 = 0,1839, P = 0,0366) (kuvio. 4e). Yhdessä nämä havainnot tarjoavat vahvaa näyttöä siitä, että HOXA1 on välittömänä kohteena miR-10a GC. Olemme myös havainneet mRNA tasoa HOXA1 näillä potilailla ja havaittiin, että mRNA taso HOXA1 useille potilaille ei vastannut proteiinin tasoa, mikä osoitti, että miR-10a säätelee ilmaus kohteeseensa, HOXA1 kautta translationaalinen tukahduttaminen mutta ei mRNA pilkkominen näillä potilailla (kuvio. S1).}

Knock-down of HOXA1 Tukahdetut Mahalaukun syöpäsolujen kasvua ja Migration in vitro

Seuraavaksi kysytään HOXA1 pelataan tärkeä rooleja mahalaukun syöpäsoluja. Jotta voidaan tutkia roolia HOXA1 GC, me pudotti endogeenisen HOXA1 in HGC-27 ja MGC-803 solulinjojen havaitsemiseksi vaikutus soluproliferaatioon ja solujen vaeltaminen. Havaitsimme, että HOXA1 tukahduttaminen esti solujen lisääntymistä ja migraatio HGC-27 ja MGC-803-soluissa, vastaavasti (kuvio. 5a ja 5b). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-10a toimii tuumorisuppressori GC-soluissa tukahduttamalla HOXA1 ilmaisu.

miR-10a epigeneettiseltä Silenced GC Cell Lines

selventämiseksi, onko alhaisen ilmentymisen asennuspalveli- 10a GC kudosta oli seurausta epigenetical muutoksia, käsittelimme HGC-27, MGC-803, SGC-7901 ja MKN-45-solut, joilla on DNA: n metylaatio inhibiittorin 5-AZA. Ilmaisu Mir-10a oli säädellään ylöspäin HGC-27, SGC-7901 ja MKN-45-solut, kun niitä käsiteltiin AZA, mikä viittaa siihen, että ilmaus miR-10a voidaan tukahdutettu näissä soluissa DNA: n metylaatio (kuvio. 6a).

tutkia sääntely miR-10a DNA: n metylaatio, etsittiin ihmisen genomin tietokanta esiintyminen CpG saarten ympärillä miR-10a käyttäen "CpG Island Etsijä" ohjelmisto ja tunnistaa CpG saari sijaitsee 1638 bp ylävirtaan miR-10a
(kuvio. 6b). Lisäksi havaitsimme DNA metylaatiostatus käyttäen qMSP ja MSP neljässä GC solulinjat. CpG Saari oli hypermetyloitunut kaikissa neljässä GC solulinjoissa, mikä oli sopusoinnussa alhainen ilmentyminen miR-10a näissä GC solulinjoissa. Kun GC solut linjat käsiteltiin 5-atsa-CdR, metylointi taso laski verrattiin DMSO ryhmän (kuvio. 6c).

Down-regulation of miR-10a GC Potilaat johtui hypermetylaatiota sen CpG Islands

tutki vielä metylaatiostatuksen CpG saaren GC kudosten ja viereisen normaalia kudosta 55 satunnaisesti valittua tapausta läpi qMSP. Metylointi taso 55 GC kudokset oli korkeampi kuin viereisen ei-syöpä kudoksiin (p < 0,01), mikä oli sopusoinnussa alhainen ilmentyminen miR-10a GC kudoksissa (kuvio. 6d). Lisäksi meillä satunnaisesti valittu kaksi paria näytettä, joista analysoimaan DNA metylaatio tasolla bisulfaatti sekvensoimalla PCR (BSP) vahvistaa tarkkuutta MSP. Tulokset BSP oli yhteneväinen qMSP ja täydennettiin kuin kuvio. S2. Lisäksi metylointi taso miR-10a (M /M + U) näillä GC potilailla esiintyi käänteinen korrelaatio ilmaus miR-10a (r ^{2 = 0,1956, P = 0,0006) (kuvio. 6e). Olemme myös havainneet metylointi taso miR-10a normaaleissa mahalaukun soluissa ja mahasyövän solulinjoissa. Tulokset qMSP ilmeni, että CpG saari oli osittain metyloitu GES soluissa, mutta äärimmäisen hypermetyloitunut kahdessa mahasyövän solulinjoissa HGC-27 ja MGC-803, joka ehdotti myös, että CpG-saarekkeen ylävirtaan miR-10a
oli hypermetyloitunut GC soluissa (kuvio. 6f). Yhdessä nämä havainnot antavat vahvaa näyttöä siitä, että ilmaus miR-10a säädeltiin DNA: n metylaation näillä GC potilailla. Alas-säätely miR-10a GC potilailla johtui hypermetylaatiota sen CpG-saarekkeiden.}

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa totesimme, että miR-10a oli alassäädetty ihmisen mahasyöpä osittain johtuen sen DNA promoottorin hypermetylaatio. Lisätutkimukset osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-10a tukahdutetaan solujen proliferaatiota, migraatiota ja invasiivisuuden GC solulinjoissa HGC-27 ja MGC-803, mahdollisesti kohdistaminen onkogeeni HOXA1.

miRNA on raportoitu säännellä eri kehityshäiriöitä ja solutason prosesseja, ja ne yhdistetty moniin ihmisen sairauksiin, erityisesti syöpään. MiRNA tukahduttaa geenien ilmentyminen kohdistamalla mRNA: t sitoutumalla niiden 3 'UTR. Nämä miRNA näytteille sääntelyn roolit patogeneesissa syövän ja osallistuvat soluproliferaation, erilaistumisen, apoptoosin, metastaasin ja vastus [4], [20]. MiR-10a on tärkeä rooli useissa syövissä, mukaan lukien maksasolusyövän [9], haimasyöpä [17], akuutti myelooinen leukemia [21] ja krooninen myelooinen leukemia [10]. Epänormaali ilmentyminen miR-10a on todennäköisesti keskeinen merkitys pahanlaatuisiksi ja on suhteessa kudosspesifisyyttä. Sen vapauttaminen voi edistää vatsan neoplasia.

validointi ilmentymisen miR-10a kliinisistä näytteistä osoitti, että miR-10a oli säädellä vähentävästi 58 (58/100, 58%) GC kudoksiin verrattuna viereisiin kudoksiin. Kuitenkin Weidong Chen et al.
Tutkittiin ilmentymistä miR-10a 33 GC tapauksissa ja totesi, että miR-10a ilmentyminen oli korkeampi GC kudoksissa kuin viereisessä kudoksissa [22]. Epäjohdonmukaisuus voi olla seurausta toinen määrä kliinisten näytteiden ja indistinctive muutos miR-10a GC kudoksissa. Meidän data pitäisi olla biologisesti kuvaava ja koska suuremman määrän kliinisistä näytteistä. Vain suurin osa, mutta eivät kaikki GC potilailla on alas-säätely miR-10a niiden GC kudoksissa, vaikka miR-10a toimii tuumorisuppressorina mahasyövän soluissa. Tämä saattaa johtua erillisiä mekanismin genesis GC eri yksilöillä. Saattaa olla joitakin muita tärkeitä geenejä tai tekijöistä tuumorigeneesiä GC potilailla, joiden GC kudoksissa miR-10a pysyi ennallaan tai jopa säädelty. Lisäksi miR-10a ilmaisu ei esiintynyt korrelaatiota kliinis ominaisuudet paitsi TNM-luokitus, joka osoittaa, että miR-10a voi olla osittainen rooli tuumorigeneesissä erityisesti alkuvaiheessa.

Monet miRNA on raportoitu korreloivan tuumorigeneesiin kuitenkin taustalla molekyylimekanismi on edelleen epäselvä. Meidän raportti, toiminnallinen analyysi miR-10a, kuten solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion määrityksissä, auttoi meitä ymmärtämään paremmin osuus miR-10a mahasyövän. Transfektio miR-10a matkivat esti merkittävästi solujen lisääntymistä, muuttoliike ja invasiivisuus GC soluissa, mikä osoittaa, että tukahduttaminen miR-10a voitaisiin edistää syövän etenemisen mahasyövän. Tulevaisuuden tutkimuksia tarvitaan Selvennän tätä mekanismia.

Ihmisen genomin, miR-10a
sijaitsee ylävirtaan HOXB4
. MiR-10b
, toisen jäsenen miR-10 perheen, sijaitsee ylävirtaan HOXD4
. Nämä kaksi jäsentä eroavat toisistaan ​​vain yksi tukiasema ja niillä on identtiset siementen sekvenssit, mikä viittaa siihen, niiden vastaavia toimintoja. Kwoneel Kim [12] on raportoitu, että miR-10b on rooli GC tuumorisuppressorina. Tutkimuksessamme osoitimme, että yli-ilmentyminen miR-10a inhiboi kasvaimen proliferaatiota, migraatiota ja invasiivisuus, joka oli samanlainen toiminta miR-10b GC. HOX-geenit ovat erittäin konservoituneita transkriptiotekijöitä, jotka ovat ratkaiseva oikea etu-taka-kuviointi kehon akselin [23]. HOXA1 on validoitu välittömänä kohteena miR-10a ihmisen haimasyövän [17] ja Megakaryosyyttien [18]. Havaitsimme myös, että yli-ilmentyminen miR-10a laski HOXA1 proteiinin tasot kaksi GC solulinjoissa, mikä viittaa siihen, että HOXA1 on välittömänä kohteena miR-10a mahasyövän.

Epigeneettiset muutoksia on osoitettu olevan keskeinen välittäjiä taustalla alas-säätely miRNA ilmaisun ja näytteille tiukka korrelaatio syövän synnyn [12], [13], [24]. Tuloksemme osoittivat, että hypermetylaatiota CpG-saarekkeen ylävirtaan miR-10a
johti alas-säätely miR-10a GC solulinjoissa ja GC potilaita. Lisäksi AZA hoito lisäsi miR-10a GC solulinjoissa. Perustuu havaintojen metylaatiostatuksen miR-10a voidaan käyttää mahdollisena biomarkkereiden GC.

Yhteenvetona, tämä tutkimus raportoi, että miR-10a toimii tuumorisuppressori GC soluissa ja on osittain alas -regulated DNA hypermetylaation. Pakko ilmentymisen miR-10a tukahduttaa solujen lisääntymistä, muuttoliike ja invasiivisuus in vitro
. Metylaatiostatuksen ja ilmentymistason miR-10a voidaan käyttää potentiaalisia biomarkkerit GC, ja miR-10a voi olla mahdollista terapeuttista arvoa syövän hoidossa. Lisätutkimukset epigeneettisenä säätely miRNA ilmaisun ovat tarpeen, ja säätelyyn miRNA ilmentymisen Epigeneettisiä lääkkeet voivat tarjota käyttöön uusi hoitostrategia maha- ja muista ihmisen syövissä.

tukeminen Information
Kuva S1.
mRNA taso HOXA1 vuonna 24 GC potilaista havaittiin qRT-PCR.
doi: 10,1371 /journal.pone.0088057.s001
(TIF) B Kuva S2.
BSP analyysi metylaatiostatus kahdella GC potilailla. Täytetty ja avoimet ympyrät esittävät metyloitu ja metyloimattoman CpG-kohtiin.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0088057.s002
(TIF) B Taulukko S1.
alukkeita käytetään tässä artikkelissa.
doi: 10,1371 /journal.pone.0088057.s003
(XLSX) B Taulukko S2.
välinen assosiaatio ilmaus miR-10a kanssa kliinis-potilailla, joilla on mahalaukun syövän.
doi: 10,1371 /journal.pone.0088057.s004
(XLSX) B

Kiitokset

kirjoittajat kiittää Hualu Zhao alkaen IBMS (Institute of Basic Medical Sciences), PUMC (Peking Union Medical College) teknisen avun ja tohtori Hongkai Zhang Jiuxianqiao Hospital hänen apua immuunihistokemiallisessa.

• PLoS ONE: Labor Resource Käytä tähystysjärjestelmien Mahalaukun syövän Japani Primary Care asetukset A Work Näytteenotto Study
• PLoS ONE: geenipolymorfismien of MikroRNA in Helicobacter pylori aiheuttama suuri riski atrofisen gastriitin ja Mahalaukun Cancer