PLoS ONE: mikrornk-10A je podregulira metilacije DNA i funkcionira kao supresor tumora na rak želuca Cells

Sažetak pregled

Pozadina pregled

mikroRNA djeluju kao posttranskripcijsko regulatori ekspresije gena u mnogim bioloških procesa. Njihovi deregulations javljaju uobičajeno u raka želuca (GC). Iako DNA metilacije predstavlja važan mehanizam za mikrornk deregulacije u raka, ovo polje velikoj mjeri ostaje neistražena. Pregled

Metodologija /glavne nalaze

Ukupna RNA se ekstrahira iz tkiva od 100 pacijenata sa GC i četiri želuca stanične linije raka. Razina ekspresije Mir-10a su određene u realnom vremenu PCR s određenim TaqMan sonde. Nadalje, funkcionalna analiza Mir-10a u regulaciji stanične proliferacije, migracije i invazije je izvršena. Nakon toga, kvantitativno metilacije specifičan PCR (qMSP) se koristi za otkrivanje statusa DNA metilacije u CpG otocima uzvodno od Mir-10a Netlogu. U ovom istraživanju, otkrili smo da je ekspresija Mir-10a u GC stanicama bila je niža nego u normalnim stanicama, što je s obzirom na Hipermetilacija od CpG otoka uzvodno od Mir-10a Netlogu. Mi smo također potvrdili nešto nižu ekspresiju Mir-10a u GC tkiva od svojih susjednih ne-maligne tkiva u 100 GC bolesnika i potvrdio Hipermetilacija CpG otoka uzvodno od Mir-10a Netlogu u nekih bolesnika. Osim toga, ponovno uvođenje Mir-10a u GC stanice je mogao inhibirati proliferaciju stanica, migraciju i invaziju. Bioinformatika i imunoblot analiza je pokazala da je tumor supresorski uloge Mir-10a u GC stanicama su vjerojatno putem ciljanja HOXA1. Pregled

Zaključci /Značaj pregled

Naši podaci pokazuju da je Mir-10a djeluje kao supresor tumora u GC stanicama, a djelomično prigušuje DNA Hipermetilacija u GC, što ukazuje da miR-10a može služiti kao potencijalni dijagnostički i terapijski cilj GC pregled

Izvor. Jia H, Zhang Z, Zou D Wang B, Yan Y, Luo M, et al. (2014) mikrornk-10A je podregulira metilacije DNA i funkcionira kao supresor tumora u želudac stanica raka. PLoS ONE 9 (1): e88057. doi: 10,1371 /journal.pone.0088057 pregled

Urednik: Jorg Tost, HUP - Institut de Genomique Francuska pregled

Primljeno: 26. siječnja 2013; Prihvaćeno: 4 siječanj 2014; Objavljeno: 31 siječanj 2014 pregled

Copyright: © 2014 Jia i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo bio podržan od potpora iz Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (2011., 91129716, do JY), Općinskog Beijing Science &na; Povjerenstvo za tehnologiju (2010B071, da J.Y.), Institut temeljnih medicinskih znanosti, Kineske akademije medicinskih znanosti (2009RC03, da J.Y .; 2010PYB06, da J.Y .; 2012G04, da J.Y.). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca (GC) je drugi najčešći uzrok smrti od raka u [1] svijet. Do sada je nekoliko tumor supresorski geni i geni povezan s tumorom su iskazane u GC. Iako opsežna istraživanja su provedena za identifikaciju genetske puteve i mehanizme koji su uključeni u razvoj raka, nekoliko poboljšanja na ranoj dijagnostici raka su napravljene. MikroRNA (miRNAs) su endogeni male ne-kodiranje RNA koji su identificirani kao posttranskripcijsko regulatori ekspresije gena. Ranija su istraživanja pokazala da miRNAs vrše svoje funkcije kroz nesavršene sparivanja baza s 3 'netranslatirano područje (3'UTR) ciljnih mRNA [2] i miRNAs su opsežno studirao u kontekstu regulaciji staničnog ciklusa, diferencijacije, razvoj i apoptoze [3], [4]. Akumulirana dokazi ukazuju da su miRNAs deregulirani u raznim bolestima, posebice u liječenju raka. Na primjer, Mir-216B je izrazito lijepo regulirano u nazofarinksa karcinom [4]; Mir-340 je deregulirani u karcinom dojke, a inhibiraju migraciju stanica raka dojke i invaziju [5]; i miR-31 je identificiran kao onkogena u ezofagealni karcinom skvamoznih stanica [6]. Uzeti zajedno, miRNAs su identificirani kao potencijalni kandidati za novih dijagnostičkih biljega ili terapijskih ciljeva raka. Pregled

Mir-10a je izvijestila da igraju važnu ulogu u nastanku i razvoju raznih karcinoma u ljudi. Na primjer, Mir-10a deregulirano u glavu i vrat karcinoma pločastih stanica, a također u hepatocelularnog karcinoma [7], [8]. Osim toga, u ljudskoj raka vrata maternice, miR-10a služi kao onkogen regulirajući CHL1 [9]; down-regulacije Mir-10a u kronične mijeloične leukemije promiče CD34 ^{+ stanica proliferaciju [10]. Međutim, funkcija Mir-10a i mehanizam temeljni želuca karcinogeneze ostaju nejasni. U ovoj studiji smo izmjeriti ekspresiju Mir-10a u 100 bolesnika s karcinomom želuca i istražiti uloge Mir-10a u želučanim stanicama raka. Otkrili smo da je Mir-10a se dolje regulirano GC tkiva i provoditi ekspresiju Mir-10a potisnuti proliferaciju, migraciju i invaziju GC stanicama. pregled}

Epigenetske preinake uključujući DNA Hipermetilacija, histona deacetilacije i histona metilacije su usko povezana s gena inaktivacije. Promotor Hipermetilacija je mislio da se alternativni mehanizam za regulaciju na dolje tumor supresor gena u ljudskim tumorima [11]. MiRNAs čija je ekspresija potisnuta metilacije DNA zabilježeni su u nekoliko oblika raka kod ljudi [12] - [14]. Kako bi se dodatno istražiti da li je dolje regulacija Mir-10a potječe iz Hipermetilacija genomske regije uzvodno od Mir-10a pregled, analizirali smo DNA metilacije otoka CpG u promotorske regije miR- 10a pregled u 55 GC pacijenata i otkrili da se na regulaciju Mir-10a u GC tkivima moglo biti s obzirom na Hipermetilacija CpG sekvenci u svojoj promotora.

Materijali i metode

Pacijenti a uzorci pregled

Humani klinički uzorci su prikupljeni iz kirurških uzoraka od 100 bolesnika s GC u Cancer Institute i bolnica, kineske akademije medicinskih znanosti, Opća bolnica Narodne oslobodilačke vojske i Shanxi Cancer Hospital. Odgovarajuće susjedne non-neoplastična tkiva iz makroskopski tumora marginu izolirane su u isto vrijeme i koristi se kao kontrola. Tumori su stupili u skladu s TNM (2010) kriterija razvrstavanja Unije za međunarodnu kontrolu raka (UICC). Svi uzorci su bili podijeljeni u dva dijela, te su odmah nakon toga brzinski zamrznute u tekućem dušiku i pohranjeni na -80 ° C do ekstrakciju RNK. Četiri želučani stanične linije raka (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 i MKN-45) bili su sačuvani u našem laboratoriju i održavane u DMEM ili 1640 s 10% FBS. Klinička istraživanja Etičko povjerenstvo Instituta za osnovne medicinske znanosti, Kineske akademije medicinskih znanosti odobrio istraživačkih protokola i pismeni informirani pristanak dobiven je od sudionika. Pregled

RNA ekstrakcija, cDNA Sinteza mRNA i miRNAs i stvarnost time PCR testovi pregled

Ukupna RNA se ekstrahira iz želučanog tkiva karcinoma i stanice pomoću Trizol reagensa (Invitrogen, CA, USA) u skladu s uputama proizvođača. RNA je kvantificirana apsorbancije na 260 nm i cDNA sintetiziran M-MLV reverzne transkriptaze (Invitrogen) s 2 ug ukupne RNA. Oligo (dT) 18 je korišten kao primeri za RT reverznom transkripcijom mRNA. Matična petlje RT primer se koristi za reverznu transkripciju Mirne. Kvantitativni RT-PCR u Bio-Rad CFX96 realnom vremenu PCR sustava (Bio-Rad, CA, USA) upotrebom SYBR premiksa Ex Taq kit (Takara, Dalian, Kina) ili TaqMan sondi (tnom City, CA , USA) u skladu s uputama proizvođača. PCR uvjeti su bili kao što slijedi: 95 ° C za 30 s, a zatim 40 ciklusa od 95 ° C u trajanju od 5 sekundi i 60 ° C tijekom 34 s. Za mRNA, podaci su normalizirani korištenjem endogenog GAPDH kontrola. Za miRNAs, U6 snRNA korišten je kao endogeni kontrola. Relativna količina Mir-10a izmjerena je s 2 ^{-ΔΔCT metodom. Sekvencijama su prikazani u tablici S1.}

ekstrakcije DNK, Metilacija specifične PCR (MSP) i kvantitativna Metilacija specifične PCR (qMSP) pregled

Visoko molekularne težine genomska DNA je izvađen iz želučanog tkiva raka pomoću DNK Extraction Kit (BioMed, BJ, Kina) u skladu s uputama proizvođača. Bisulfit modifikacija je izvedena korištenjem Epitect bisulfita sekvenciranje kit (Qiagen, Hilden, Njemačka) prema protokolu. Do 2 ug genomne DNA je korištena kao početni materijal. Normalno limfocitne DNA pomiješa s CpG metiltransferaze (M.SssI) (NEB, MA, USA) je korišten kao pozitivna kontrola, a reakcijski sustav bez šablone je korišten kao negativna kontrola. Pregled

natrijeve bisulfate- pomiješa DNK umnožena pomoću bio-Rad CFX96 realnom vremenu PCR System (bio-Rad) pomoću KAPA SYBR® brzo qPCR Kits (Kapa Biosystems) sa slijedećim uvjetima: 95 ° C tijekom 5 minuta, nakon čega slijedi 40 ciklusa 95 ° C za 30 s, 54 ° C kroz 30 s i 72 ° C tijekom 30 s te završnog produženog na 72 ° C 10 min. GAPDH korištena je kao interna kontrola. qMSP reakcije izvode se u triplikatu. Razina metilacije u uzorku procjenjuje se kako je Lu L et al. opisano [15]. Nizovi primera su prikazani u tablici S1. Pregled

5-aza-2'-deoxyazacytidine liječenje pregled

želucu stanice raka su zasijane u uzgojne posude od 10 cm (1 × 10 ^{6 stanica po zdjelici) dan prije davanja lijeka. Stanice su tretirane s 1 uM 5-aza-2'-deoxyazacytidine (5-AZA) (Sigma, MO, USA) svaka 24 sata kroz 3 dana. Pregled}

Stanična kultura i Oligonukleotidi Transfekcija pregled

ljudskog želučanog stanične linije HGC-27, SGC-7901 i MKN-45 uzgajane su u RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) medij, uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma i MGC-803 se održava u DMEM (Gibco, BRL , UK) s dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma. Ove stanične linije održavane su na 37 ° C u vlažnoj zrak koji sadrži 5% CO _{2. Pregled}

Mir-10a imitacija je jagma oponašati, siHOXA1 siRNA i Scramble siRNA su sintetizirani GenePharma (Šangaj, Kina ) i transfektirani u stanice u konačnoj koncentraciji od 50 nmol /L upotrebom DharmaFECT1 reagensom (Dharmacon, TX, USA). pregled

stanične proliferacije i Colony Dobivanje test pregled

mimic- ili siRNA- stanice su nasađene u ploče s 96 jažica (5000 stanica /jažica). Stanice su inkubirane s 10% CCK-8 (DOJINDO, Japan) na 37 ° C dok nije počelo vizualni pretvorba boje. Proliferacije stope određene su pri 0, 12, 24, 48, 72, 96 sati nakon transfekcije. Pregled

oponašati transfektirane stanice su tripsinizirane i precijepljene na 200 stanica po jažici u ploče sa 6 jažica, a održava se u 1640 s 10% FBS. Stanice su kultivirane 7 dana, fiksirane sa metanolom, te oboji 0.1% kristalno ljubičastog na 20% metanola za 15 minuta. Pregled

Cell Test apoptoze

Apoptoza testovi su izvedeni u HGC-27 i stanične linije MGC-803 pomoću Annexin V-FITC Apoptoza detekciju kit i (BD Biosciences) u skladu s uputama proizvođača i zatim se analizira Calibur protočnom citometru (Becton Dickinson). pregled

Cell migracije i invazije testovi pregled

test za liječenje rana je provedena za procjenu stanične migracije. Umjetna rana je stvoren na pritoka staničnog bez FBS pomoću pipete 200 lL 24 sata nakon ubacivanja. Kako vizualizirati migraciju stanica i zarastanje rana, slike su snimljene na 0, 12, 24, 36, 48, 60 sati. Pregled

Za transjažice pokusima invazije, HGC-27 i MGC-803 stanica suspendiranih u 0,2 ml RPMI 1640 ili DMEM bez FBS, postavljen na gornjem komore svakog umetka (Millipore, MA, USA) je naneseno 40 ul 1 mg /ml Matrigel. Donja komora se napuni sa 600 ul RPMI 1640 ili DMEM mediju s 10% FBS kao prehrambene privlačenje. 24 sata kasnije, invazija stanica priključeni na donjoj površini su fiksirane s 20% metanola i obojeni May-Gruwald-Giemsa (MGG). Membrane su zatim urezana i ugrađeni pod poklopcima. Stanice u tri različite vizualnog polja su izbrojene, a svi testovi su izvedeni u triplikatu. Pregled

Western blotting pregled

Western blot analiza je provedena prema standardnim postupcima. Proteini su odvojeni s 10% SDS-PAGE i zatim preneseni na PVDF membrane (Amersham, Buckinghamshire, UK). Membrane su blokirane preko noći u 5% bezmasnim je mlijeko u prahu, te inkubirati 2 sata s anti-antitijelo HOXA1 (Bioworld, MN, USA) pri 1:500 razrjeđenja ili anti-GAPDH protutijela (Proteintech, Chicago, USA) pri 1: 50.000 razrjeđenja. Nakon ispiranja s TBST (10 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, i 0,1% Tween20), membrane su inkubirani 2 sata sa sekundarnim protutijelom (zsgb-Bio, Peking, Kina). Pregled

Statistika

Svaki pokus ponovljen je najmanje tri puta. Student-ov t-test (dvosmjerni) i x ^{2 test je, a statistička značajnost je definirano kao a = 0,05 (dva strana). Sredstva ± SD prikazani su na slikama. Pregled}

Rezultati

Mir-10a Down-regulirana u rak želuca stanicama pregled

ispitali smo ekspresiju zrele Mir-10a u četiri stanične linije humanog karcinoma želučanih (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 i MKN-45) i ljudske želučane epitel stanična linija (GES). Razina izraz Mir-10a u GES bila značajna veća od razine u dvije želučane staničnim linijama karcinoma (HGC-27 i MGC-803) i bio je ne-bitno ali observably veća od razine u druge dvije želučane staničnim linijama karcinoma (MKN-45 i SGC-7901) (sl. 1a). Ovi podaci sugerirali da je down-regulacije Mir-10a mogli biti važni za nastanak i razvoj GC. Pregled

ekspresiju Mir-10a u Klinički GC bolesnika i njihova korelacija s kliničkopatološkim Karakteristike

kako bi se dodatno proučiti odnos između Mir-10a i GC geneze, otkrili smo ekspresiju Mir-10a u 100 kliničkih pacijenata TaqMan sonda-izvedeni u realnom vremenu PCR kao što je gore opisano. Od 100 parova uzoraka GC, ekspresija Mir-10a je dolje regulirano u 58 slučajeva (58/100, 58%) u usporedbi s odgovarajućim susjedna tkiva (Sl. 1b). Sve u svemu, izraz Mir-10a je dolje regulirana u GC tkiva u usporedbi sa susjednim tkivima, iako se regulacija nije bila statistički značajna (p = 0,148, u paru t-test, dvosmjerni) (sl. 1c). pregled

da bi se procijenila korelacija između ekspresije Mir-10a i kliničkopatološkim karakteristikama, pacijenti su bili podijeljeni u dvije skupine prema relativnom izrazu Mir-10a u tkivima oboljelih od raka u skladu s ranije objavljenom radu u [16] , Kao što je prikazano u Tablici S2, statistički značajna povezanost primijećena između dvaju TNM skupine. Postoji više pacijenata koji su u I + II fazu u skupini s nižom ekspresijom Mir-10a u svojim GC tkiva. Taj odnos pokazuje da Mir-10a može biti važno u ranoj karcinogeneze raka. Međutim, naši podaci pokazuju da je razina ekspresije Mir-10a imali korelaciju s dobi, spolu, histološkom tipu, postotak tumora, venske invazije, invazija živaca, položaj, Borrmann tipkanje, PT fazi, PN fazi ili PM fazi. Pregled

Mir-10a Koči stanične proliferacije In vitro

Kako bi istražili ulogu Mir-10a u želučanom karcinogeneze, transficirane smo Mir-10a ličiti u GC staničnim linijama HGC-27 i MGC-803, koje su obje pokazao je visoku efikasnost transfekcije (sl. 2). Kako je pokazano CCK-8 pokusa rasta 0, 1, 2, 3 i 4 dana nakon imitira transfekcije hiperekspresija Mir-10a smanjene proliferacije stanica u obje stanične linije, a jagma imitacija nije imao učinka na proliferaciju stanica u usporedbi s neobrađenim stanicama (sl. 2b). Nakon toga, formiranje kolonija testovi su izvedeni za evaluaciju sposobnosti proliferativnog mimičkih transfektirane HGC-27 i MGC-803 stanicama i pokazala je da pretjerana ekspresija Mir-10a u HGC-27 stanica smanjeni formiranje kolonija (sl. 2c). Međutim, niti jedan od MGC-803 stanica nastaju kolonije, što bi moglo biti s obzirom na stanicama 'relativno slabog prianjanja. Kako bi se dodatno obratiti učinak Mir-10a na staničnu apoptozu u dva GC staničnim linijama, rano apoptoze MGC-803 i HGC-27 stanica ispitana je Aneksin V bojanja nakon Mir-10a imitira ubacivanja. Kao što se očekivalo, malo rano apoptoze stanica (20,8% u HGC-27 i 22,9% u MGC-803) su otkrivena u mimičkih tretiranih stanica otimati, dok je Mir-10a oponaša tretman povećao postotak ranih apoptotičnih stanica (28,4% u HGC -27 i 27,7% u MGC-803) (Sl. 2d). Kolektivno, zaključili smo da je Mir-10a mogao potisnuti preživljavanje stanica u GC stanicama zbog izazivanja staničnoj apoptozi. Pregled

Mir-10a Koči Cell migracije i invazije In vitro

dalje smo procjenjuje učinke Mir-10a za migracije stanice i invaziju, koja su ključna za maligne napredovanja i metastaze. Migracija Sposobnost pokazana je na zacjeljivanje rana /ogrebotine testu u HGC-27 i MGC-803 stanica. Obje stanične linije su tretirani s miR-10a mimic su izrazito manje migracijski od onih tretiranih s kontrolom jagmiti ili netretiranim stanicama na 12, 24 i 36 sati nakon grebanja (Sl. 3A). Osim toga, proveli smo invaziju u Matrigel stanica testa i obojeni su napali stanice za mjerenje smjera invazije sposobnosti stanica nakon ektopički izražavajući Mir-10a u dvije stanične linije. Invazivnosti stanica transficiranih Mir-10a ličiti dramatično je smanjen u usporedbi s kontrolom otimati i netretiranih stanica (sl. 3b). Ovi rezultati pokazuju da je Mir-10a igrao važnu ulogu u regulaciji stanične migracije i invazivnosti u GC i predložio da se dolje regulacija Mir-10a mogu doprinijeti tumorskih metastaza u želučanom karcinogeneze. Pregled

Mir-10a cilja HOXA1 u GC pregled

MiRNAs obavljanje bioloških funkcija kroz negativno reguliraju svoje ciljne gene. Ona je izvijestila da je onkogena HOXA1 je izravna meta Mir-10a u megakaryocytopoiesis i ljudskog raka gušterače [17] - [19]. Kao što je predvidio PicTar, postojala je komplementarna sekvenca između mora-Mir-10a i HOXA1 3'UTR (Sl. 4a). Međutim, to je nepoznato da li Mir-10a regulira staničnu proliferaciju, migraciju i invaziju na GC ciljajući HOXA1. Da pojasnimo svoj jamstveni odnos, prvo smo otkrili protein i razine mRNA HOXA1 u Mir-10a oponašaju transfektirane HGC-27 i MGC-803 stanica pomoću Western upijanja i RT-PCR. Uočili smo evidentan pad razine HOXA1 proteina u prisustvu Mir-10a oponaša u usporedbi s kontrolom otimati u dvije stanice (Sl. 4b). MRNK razina HOXA1 je također dolje regulirano HGC-27 stanica, što ukazuje da je Mir-10a inhibira ekspresiju HOXA1 razlažući mRNA HOXA1 u HGC-27 stanica. Međutim, bilo je malo promjena u razini mRNA za HOXA1 u MGC-803 stanica, što ukazuje da je Mir-10a može se regulirati izražavanje HOXA1 kroz translacijske represije, ali ne mRNA dekolte u MGC-803 stanica (Sl. 4c). Nadalje, analizirali smo razine proteina u HOXA1 u 24 bolesnika GC. Među tim uzorcima, bilo je 12 bolesnika u kojih Mir-10a se dolje regulirana u svojim GC tkivima i 12 bolesnika u kojih Mir-10a se regulira prema gore u svom GC tkivima (Sl. 4d). HOXA1 je viša u većine bolesnika u kojih Mir-10a se dolje regulirana u svojim GC tkiva. Isto tako, HOXA1 je dolje regulirana u većine bolesnika u kojih Mir-10a se regulira prema gore u svojim GC tkiva. Usporedba razina Mir-10a i razina proteina u HOXA1 u GC otkrila inverznu korelaciju između Mir-10a i HOXA1 (r ^{2 = 0,1839, P = 0,0366) (Sl. 4e). Zajedno, ovi rezultati pružaju snažne dokaze da HOXA1 je izravna meta Mir-10a u GC. Također smo otkrili razinu mRNA HOXA1 u tih bolesnika i primijetio da je razina mRNA od HOXA1 u nekoliko pacijenata nije bio u skladu s razinom proteina koja je pokazala da Mir-10a regulira ekspresiju svog cilja, HOXA1 kroz translacijske represije, ali ne i mRNA rascjep u tih bolesnika (sl. S1). pregled}

knock-down HOXA1 Potisnut rak želuca rast stanica i migracije in vitro

Dalje, pitali smo da li HOXA1 igrali važne uloge u želudac stanica raka. Kako bi se ispitala uloga HOXA1 u GC, ispao mi se endogene HOXA1 u HGC-27 i stanične linije MGC-803 za otkrivanje učinak na staničnu proliferaciju i migraciju stanica. Uočili smo da je HOXA1 represija inhibira proliferaciju stanica i migraciju HGC-27 i MGC-803 stanica, odnosno (Sl. 5a i 5b). Ovi rezultati ukazuju na to da Mir-10a djeluje kao tumor supresor u GC stanicama potiskivanje izraz HOXA1. Pregled

Mir-10a Epigenetically je ušutkan u GC staničnim linijama

Da se razjasni da li niskom ekspresijom miR- 10a u GC tkivo je rezultat epigenetical promjene, tretirani smo HGC-27, MGC-803, SGC-7901 i MKN-45 stanice s inhibitorom DNA metilacije 5-aza. Izraz Mir-10a je viša u HGC-27, SGC-7901 i MKN-45 stanice kada su tretirani s aza, sugerirajući da ekspresija Mir-10a može biti potisnuta u tim stanicama s DNA metilacije (SL. 6a). pregled

u studiji regulaciju Mir-10a DNA metilacije, tražili smo bazu ljudskog genoma za prisutnost CpG otocima Mir-10a pomoću »CpG Otok Searcher" softver i identificirati CpG otok koji se nalazi 1638 bp uzvodno od mir-10a pregled (Sl. 6b). Nadalje, otkrili smo status metilacije DNA pomoću qMSP i MSP u četiri GC staničnim linijama. Otok CpG je hypermethylated u sva četiri GC staničnih linija, što je u skladu s niskom ekspresijom Mir-10a u tim staničnim linijama GC. Kada su GC stanične linije su tretirane s 5-aza-CDR, razina metilacije je smanjen u usporedbi s DMSO skupine (Sl. 6c). Pregled

Smanjivanje se od Mir-10a u GC bolesnika je zbog Hipermetilacija od svojih CPG otoci

Mi dalje ispituje status metilacije CpG otoku u GC tkiva i susjednog normalnog tkiva od 55 nasumično odabranih slučajeva kroz qMSP. Razina metilacija u 55 GC tkiva bila je veća od one u susjednim ne-kancerogena tkiva (p < 0.01), što je u skladu s niskom ekspresijom Mir-10a u GC tkivima (slika 6d.). Osim toga, mi slučajno odabranih dva para uzoraka na kojima je analizirati razinu metilacije DNA po bisulfata sekvenciranja PCR (BSP) za provjeru točnosti MSP. Rezultati BSP bili su u skladu s onim qMSP i dopunjeni su kao na slici. S2. Nadalje, razina metilacije od Mir-10a (M /M + U) u tim GC bolesnika pokazala je obrnutu korelaciju s izrazom Mir-10a (r ^{2 = 0,1956, P = 0,0006) (Sl. 6e). Također detektira razinu metilacije Mir-10a u normalnim stanicama želuca i želučane staničnim linijama raka. Rezultati qMSP otkrila da je otok CpG bio djelomično metilirani u GES stanicama, ali vrlo hypermethylated u dva želuca staničnim linijama karcinoma HGC-27 i MGC-803, koji je također predložio da se otok CpG uzvodno od Mir-10a
je hypermethylated u GC stanicama (Sl. 6f). Zajedno, ovi rezultati pružaju snažne dokaze da je izraz Mir-10a je regulirano metilacije DNA u tim GC pacijenata. Smanjivanje se od Mir-10a u GC bolesnika je zbog Hipermetilacija svojih CpG otoka. Pregled}

Rasprava pregled

U ovoj studiji, utvrdili smo da je Mir-10a se regulirati na dolje u čovjeka karcinom želuca djelomično zbog svog DNK promotorske Hipermetilacija. Daljnja istraživanja pokazala su da prekomjerna ekspresija Mir-10a potisnuti proliferaciju stanica, migraciju i invazivnosti u GC staničnim linijama HGC-27 i MGC-803, možda i kroz ciljanje onkogena HOXA1. Pregled

MiRNAs su izvijestili da se reguliraju različita razvojna i stanične procese i implicirane su kod mnogih humanih bolesti, posebice u liječenju raka. MiRNAs potisnuti ekspresiju gena ciljajući mRNA kroz vezivanje na njihove 3 'UTRs. Ovi miRNAs pokazuju regulacijske uloge u patogenezi raka, a koji su uključeni u staničnu proliferaciju, diferencijaciju, apoptozu, metastazama i otpornost [4], [20]. Mir-10a igra važnu ulogu u nekoliko vrsta raka, uključujući rak jetre [9], rak gušterače [17], akutne mijeloidne leukemije [21] i kronične mijeloične leukemije [10]. Nenormalna ekspresija Mir-10a je vjerojatno da će igrati ključnu ulogu u maligne transformacije i je u odnosu na tkiva specifično. Njegova deregulacija može doprinijeti razvoju želuca neoplazije. Pregled

Validacija ekspresije Mir-10a u kliničkim uzorcima pokazali da Mir-10a se dolje regulirano u 58 (58/100, 58%) GC tkiva u usporedbi sa susjednim tkivima. Međutim, Weidong Chen i sur. Pregled, istraživali ekspresiju Mir-10a u 33 GC slučajevima i primijetio da Mir-10a izraz lica bio je veći u GC tkivima nego u susjedna tkiva [22]. Nedosljednost može biti rezultat različitih količina kliničkih uzoraka i nejasan promjene Mir-10a u GC tkiva. Naši podaci bi trebali biti više biološki representive zbog većeg broja kliničkih uzoraka. Samo veći dio, ali ne i svi pacijenti GC ima-naniže Mir-10a u svojim GC tkiva iako teoretski Mir-10a djeluje kao supresor tumora kod želučanih stanica raka. To može biti zbog različita mehanizma geneze GC u različitim pojedincima. Tu bi moglo biti neke druge važne gena ili čimbenici odgovorni za tumorigenezi u GC pacijenata u čijim GC tkiva Mir-10a ostala je nepromijenjena i regulira prema gore. Osim toga, Mir-10a izraz ne pokazuje povezanost s kliničkopatološkim karakteristikama osim TNM fazi, što znači da Mir-10a može igrati djelomičnu ulogu u nastanku tumora posebno u ranim fazama. Pregled

Mnogi miRNAs su izvijestili da korelira s tumorogeneze međutim, osnovni molekularni mehanizam ostaje nejasan. U našem izvještaju, funkcionalna analiza Mir-10a, uključujući staničnu proliferaciju, migraciju i invaziju testovima, su nam pomogli da bolje razumijemo doprinos Mir-10a do želuca karcinogeneze. Transformacija Mir-10a oponašaju značajno inhibiraju proliferaciju, migraciju i invazivnosti u GC stanicama, što ukazuje da je represija Mir-10a može promicati tumorski rast u želučanom karcinogeneze. Buduće studije su potrebne da se razjasni taj mehanizam. Pregled

U ljudskom genomu, Mir-10a pregled se nalazi uzvodno od HOXB4 Netlogu. Mir-10b pregled, još jedan član Mir-10 obitelji, nalazi uzvodno od HOXD4 pregled. Ta dva elementa su međusobno različiti samo u jednoj bazi i pokazuju identične sekvence sjemenki ukazuje njihove slične funkcije. Kwoneel Kim [12] je izvijestio da je Mir-10b ima ulogu u GC kao supresor tumora. U našem istraživanju, pokazali smo da je prekomjerna ekspresija Mir-10a inhibirana proliferacije tumora, migraciju i invazivnosti, koja je slična funkciji Mir-10b u GC. HOX geni su visoko konzervirani transkripcijskih faktora koji su odlučujući za pravilno anterior-posterior obrazaca od osi tijela [23]. HOXA1 je potvrđen kao izravna meta Mir-10a u ljudskoj raka gušterače [17] i megakaryocytopoiesis [18]. Također opaženo da prekomjerna ekspresija Mir-10a smanjena razina HOXA1 proteina u dva GC stanicama, što ukazuje da HOXA1 izravna meta Mir-10a u želuca. Pregled

Epigenetske izmjene su pokazala da se ključni posrednici podlozi-naniže Mirna izražavanja i pokazuju usku povezanost s karcinogeneze [12], [13], [24]. Naši podaci pokazuju da je Hipermetilacija otoka CpG uzvodno od Mir-10a Netlogu dovelo do down-regulacije Mir-10a u staničnim linijama GC i GC pacijenata. Štoviše, aza liječenje povećane Mir-10a u staničnim linijama GC. Na temelju naših nalaza, metilacije status Mir-10a može se upotrijebiti kao potencijalni biomarkera u GC. Pregled

Ukratko, ova studija navodi da Mir-10a djeluje kao supresor tumora u GC stanicama i dijelom prema dolje -regulated DNA Hipermetilacija. Prisilno izraz Mir-10a potiskuje proliferaciju stanica, migraciju i invazivnosti in vitro pregled. Status metilacije i razina ekspresije Mir-10a mogu poslužiti kao potencijalne biomarkera GC i Mir-10a može imati potencijalnu terapijsku vrijednost u liječenju raka. Daljnje studije o epigenetičke regulaciji Mirna izraza su potrebne, a regulacija Mirna izražavanja epigenetičkim droga može pružiti novi terapijski strategiju želuca i drugih oblika raka kod ljudi. Pregled

popratne podatke
Slika S1. pregled mRNK razina HOXA1 u bolesnika 24 GC je otkriven QRT-PCR pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0088057.s001 pregled (TIF) pregled Slika S2. pregled BSP analizu stanja metilacije u dva bolesnika GC. Ispunjen i prazni krugovi predstavljaju metilira i unmethylated CpG stranice odnosno pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0088057.s002 pregled (TIF) pregled Tablica S1. pregled Primeri se koriste u ovom članku pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0088057.s003 pregled (XLSX) pregled Tablica S2. pregled pridruživanju između ekspresije Mir-10a sa kliničkopatološkim obilježja u bolesnika s karcinomom želuca
DOI:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s004 pregled (XLSX) pregled

Priznanja pregled

autori zahvaljuju Hualu Zhao iz IBMS (Institute of temeljnih medicinskih znanosti), PUMC (Peking Union Medical College) za tehničku pomoć i dr Hongkai Zhang iz Jiuxianqiao bolnici za njezinu pomoć u imunohistokemijski. pregled

• PLoS ONE: Rad Resource Koristi se za Endoskopska rak želuca Screening u japanskom Postavke primarne zdravstvene zaštite: Studija Posao Uzorkovanje
• PLoS ONE: polimorfizama gena za mikroRNA u Helicobacter pylori izazvan visokog rizika atrofičnog gastritisa i rak želuca