PLoS ONE: MicroRNA-10a neerwaarts gereguleerd door DNA-methylatie en functies als een tumor suppressor bij maagkanker Cells

De abstracte

Achtergrond

MicroRNAs fungeren als posttranscriptionele regulatoren van genexpressie in vele biologische processen. Hun deregulering komen vaak voor bij maagkanker (GC). Hoewel DNA-methylatie een belangrijk mechanisme voor het microRNA deregulering bij kanker vormt dit veld blijft grotendeels onontgonnen.

Methodologie /voornaamste bevindingen

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit de weefsels van 100 patiënten met GC en vier maag kanker cellijnen. De expressieniveaus van miR-10a werden bepaald door real-time PCR met specifieke TaqMan probes. Bovendien is een functionele analyse van miR-10a bij het reguleren van celproliferatie, migratie en invasie werd uitgevoerd. Vervolgens kwantitatief methylatie-specifieke PCR (QMSP) werd gebruikt om het DNA methylatie status van de CpG eilanden stroomopwaarts van miR-10a
detecteren. In deze studie hebben we de expressie van miR-10a in GC-cellen was lager dan in normale cellen, die door de hypermethylering van CpG eilanden stroomopwaarts van miR-10a
was. We gevalideerd ook iets lagere expressie van miR-10a GC weefsels dan hun naburige niet-neoplastische weefsels in 100 GC patiënten bevestigde de hypermethylering van CpG eilanden stroomopwaarts van miR-10a
bij sommige patiënten. Bovendien herintroductie van miR-10a in GC-cellen kon celproliferatie, migratie en invasie remmen. Bioinformatica en immunoblot analyse gaf aan dat de tumor suppressor rol van miR-10a in GC cellen werden mogelijk door targeting HOXA1.

Conclusies /Belang

Onze gegevens tonen aan dat miR-10a fungeert als een tumor suppressor in GC cellen en is gedeeltelijk het zwijgen opgelegd door DNA hypermethylering in GC, wat suggereert dat miR-10a als een potentiële diagnostische of therapeutische doelwit van GC kan dienen

Visum:. Jia H, Zhang Z, Zou D, Wang B, yan Y, M Luo, et al. (2014) MicroRNA-10a neerwaarts gereguleerd door DNA-methylatie en functies als een tumor suppressor bij maagkanker Cells. PLoS ONE 9 (1): e88057. doi: 10.1371 /journal.pone.0088057

Editor: Jorg Tost, CEA - Institut de Genomique, Frankrijk |

Ontvangen: 26 januari 2013; Aanvaard: 4 januari 2014; Gepubliceerd: 31 januari 2014

Copyright: © 2014 Jia et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (2011, 91.129.716, tot JY), de Beijing Municipal Science & Technologie Commissie (2010B071, tot J.Y.), Institute of Basic Medische Wetenschappen, de Chinese Academie van Medische Wetenschappen (2009RC03, om J.Y .; 2010PYB06, om J.Y .; 2012G04, tot J.Y.). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is de tweede meest voorkomende doodsoorzaak door kanker ter wereld [1]. Tot nu toe zijn weinig tumorsuppressorgenen en tumor-gerelateerde genen gerapporteerd in GC. Hoewel uitgebreide studies uitgevoerd om genetische pathways en mechanismen in tumorigenese identificeren, hebben enkele verbeteringen op de vroege diagnose van kanker zijn gegeven. MicroRNA (miRNAs) zijn endogene kleine niet-coderende RNA's die zijn geïdentificeerd als posttranscriptionele regulatoren van genexpressie. Eerdere studies hebben aangetoond dat miRNAs oefenen hun functies onvolmaakte baseparing met de 3 'onvertaalde regio (3'UTR) van doelwit mRNA [2] en miRNAs zijn uitgebreid bestudeerd in de context van de celcyclus, differentiatie, ontwikkeling en apoptose [3], [4]. Geaccumuleerde gegevens blijkt dat miRNAs gedereguleerd zijn bij verschillende ziekten, met name kanker. Bijvoorbeeld, miR-216b aanmerkelijk down-gereguleerd in nasofarynxcarcinoom [4]; miR-340 is gedereguleerd bij borstkanker en kan borstkanker cel migratie en invasie te remmen [5]; en miR-31 werd geïdentificeerd als een oncogen in oesofageale plaveiselcelcarcinoom [6]. Samengevat zijn miRNAs geïdentificeerd als potentiële kandidaten voor nieuwe diagnostische biomerkers en therapeutische doelwitten van kanker.

MiR-10a is gemeld belangrijke rol spelen bij het ontstaan ​​en de ontwikkeling van een verscheidenheid aan menselijke kankers. Zo wordt miR-10a gedereguleerd in hoofd en hals plaveiselcel carcinomen alsook hepatocellulair carcinoom [7], [8]. Verder in humane baarmoederhalskanker, miR-10a dient als een oncogen door het regelen CHL1 [9]; neerwaartse regulatie van miR-10a bij chronische myeloïde leukemie CD34 bevordert ^{+ celproliferatie [10]. De functie van miR-10a en de onderliggende mechanisme maagkanker onduidelijk. In deze studie hebben we nauwkeurig gemeten van de expressie van miR-10a bij 100 patiënten met maagkanker en onderzoek gedaan naar de rol van miR-10a bij maagkanker cellen. We vonden dat miR-10a werd down-gereguleerd in GC weefsels en gehandhaafd expressie van miR-10a onderdrukt de proliferatie, migratie en invasie van GC cellen.}

Epigenetische modificaties zoals DNA Hypermethylering, histon deacetylering en histon methylatie zijn nauw geassocieerd met gen inactivatie. Promotor hypermethylatie wordt verondersteld om een ​​alternatief mechanisme voor neerwaarts reguleren van tumorsuppressorgenen in menselijke kankers [11]. MiRNAs waarvan de expressie wordt onderdrukt door DNA methylering zijn gerapporteerd in enkele humane kankers [12] - [14]. Om verder te onderzoeken of de down-regulatie van miR-10a is afkomstig uit de hypermethylering van de genomische regio stroomopwaarts van miR-10a
, analyseerden we de DNA-methylatie van CpG eiland in de promotorregio van buitenspiegels 10a
bij 55 GC patiënten vonden dat neerwaartse regulatie van miR-10a GC weefsel kan het gevolg zijn van de hypermethylering van CpG sequenties in de promoter.

Materialen en Werkwijzen

patiënten exemplaren en

Human klinische monsters werden verzameld van chirurgische monsters van 100 patiënten met GC op Cancer Institute en Ziekenhuis, de Chinese Academie van Medische Wetenschappen, General Hospital van de People's Liberation Army en Shanxi kanker ziekenhuis. De overeenkomstige naburige niet-neoplastische weefsels van de macroscopische tumor marge werden geïsoleerd op hetzelfde moment en als controle. Tumoren werden opgevoerd volgens de TNM (2010) classificatie criteria van de Union for International Cancer Control (UICC). Alle monsters werden verdeeld in twee delen en werden onmiddellijk ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C tot RNA-extractie. Vier maagkanker cellijnen (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 en MKN-45) waren allemaal bewaard laboratoriumwaarden gehandhaafd in DMEM of 1640 met 10% FBS. De Clinical Research Ethics Committee van Institute of Basic Medische Wetenschappen, de Chinese Academie van Medische Wetenschappen ingestemd met de onderzoeksprotocollen en schriftelijke toestemming is verkregen van de deelnemers.

RNA-extractie, cDNA synthese van mRNA en miRNAs, en Real- PCR Assays

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit maagkanker weefsels en cellen middels Trizol reagens (Invitrogen, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. RNA werd gekwantificeerd door absorptie bij 260 nm en cDNA werd gesynthetiseerd door M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen) van 2 ug totaal RNA. Oligo (dT) 18 werd als de RT-primers voor reverse transcriptie van mRNA. Een stam-lus RT-primer werd gebruikt voor reverse transcriptie van miRNA. Kwantitatieve RT-PCR werd uitgevoerd in een Bio-Rad CFX96 real-time PCR System (Bio-Rad, CA, USA) met behulp SYBR Premix Ex Taq kit (Takara, Dalian, China) en TaqMan probes (Applied Biosystems, Foster City, CA , USA) volgens de instructies van de fabrikant. De PCR condities waren als volgt: 95 ° C gedurende 30 s, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 5 s en 60 ° C gedurende 34 s. Voor mRNA, werden de gegevens genormaliseerd met de endogene controle GAPDH. Voor miRNAs, U6 snRNA werd gebruikt als endogene controle. De relatieve hoeveelheid van miR-10a werd gemeten met de 2 ^{-ΔΔCT methode. Primer sequenties worden in Tabel S1.}

DNA Extraction, methylatie-specifieke PCR (MSP) en kwantitatieve Methylatiespecifieke PCR (QMSP)

hoog molecuulgewicht genomisch DNA werd geëxtraheerd uit weefsels maagkanker met een DNA Extraction Kit (Biomed, BJ, China) volgens de instructies van de fabrikant. Bisulfiet modificatie werd uitgevoerd met het Epitect bisulfiet sequencing kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) volgens het protocol. Tot 2 ug genomisch DNA werd gebruikt als uitgangsmateriaal. Normale lymfocyt DNA behandeld met CpG methyltransferase (M.SssI) (NEB, MA, USA) werd gebruikt als een positieve controle en een reactiesysteem zonder template werd gebruikt als blanco controle.

De natrium- bisulfate- behandelde DNA werd geamplificeerd met behulp van de Bio-Rad CFX96 real-time PCR System (Bio-Rad) gebruikt KAPA SYBR® FAST qPCR Kits (Kapa Biosystems) onder de volgende omstandigheden: 95 ° C gedurende 5 minuten gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 30 s, 54 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 30 s en een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten. GAPDH werd gebruikt als een interne controle. QMSP reacties werden uitgevoerd in drievoud. De methylering niveau in een monster werd geschat L Lu et al. beschreven [15]. Primer sequenties worden in Tabel S1.

5-aza-2'-deoxyazacytidine Behandeling

Maagkanker cellen werden in 10 cm schalen (1 x 10 ^{6 cellen per schaal) één dag voor behandeling met geneesmiddelen. De cellen werden behandeld met 1 uM 5-aza-2'-deoxyazacytidine (5-AZA) (Sigma, MO, USA) elke 24 h gedurende 3 dagen.}

Celkweek en transfectie Oligonucleotiden

De menselijke maag cellijnen HGC-27, SGC-7901 en MKN-45 werden gekweekt in RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en MGC-803 werd in DMEM (Gibco, BRL gehandhaafd , UK) aangevuld met 10% foetaal runderserum. Deze cellijnen werden bij 37 ° C in bevochtigde lucht die 5% CO gehandhaafd _2.

De miR-10a na te bootsen werden de scramble na te bootsen, siHOXA1 siRNA en scramble siRNA gesynthetiseerd door GenePharma (Shanghai, China ) en getransfecteerd in de cellen met een uiteindelijke concentratie van 50 nmol /L behulp DharmaFECT1 Reagent (Dharmacon, TX, USA).

celproliferatie en Colony Formation Assay

de mimic- of siRNA- getransfecteerde cellen werden uitgezaaid in 96-putjes (5000 cellen /putje). Cellen werden geïncubeerd met 10% CCK-8 (DOJINDO, Japan) bij 37 ° C totdat visuele kleurconversie plaatsgevonden. Proliferatiesnelheden werden bij 0, 12, 24, 48, 72, 96 uren na transfectie.

De mimic getransfecteerde cellen werden met trypsine behandeld en opnieuw uitgeplaat bij 200 cellen per putje in 6-well platen en onderhouden met 1640 10% FBS. De cellen werden gedurende 7 dagen, gefixeerd met methanol en gekleurd met 0,1% kristalviolet in 20% methanol gedurende 15 min.

Cell Apoptosis Assay

Apoptosis werden uitgevoerd in HGC-27 en MGC-803 cellijnen met de Annexine V-FITC Apoptose Detectie kit I (BD Biosciences) volgens het protocol van de fabrikant en vervolgens geanalyseerd door Calibur flowcytometer (Becton Dickinson).

celmigratie en invasie assays

A-wondgenezende assay werd uitgevoerd om celmigratie te beoordelen. Een kunstmatige wond werd gemaakt op een confluente cel monolaag zonder FBS met behulp van een 200 pi pipettip 24 uur na transfectie. Visualiseren migrerende cellen en wondgenezing, werden beelden genomen op 0, 12, 24, 36, 48, 60 uur.

Voor de transwell invasie assays, HGC-27 en MGC-803 cellen gesuspendeerd in 0,2 ml RPMI 1640 of DMEM zonder FBS werden op de bovenste kamer van elk inzetstuk (Millipore, MA, USA) vooraf bekleed met 40 ui 1 mg /ml matrigel. De onderste kamer werd gevuld met 600 ui RPMI 1640 of DMEM medium met 10% FBS als lokstof voedingswaarde. 24 uur later, de invasie cellen bevestigd aan het onderoppervlak werden gefixeerd met 20% methanol en gekleurd met May-Gruwald-Giemsa (MGG). De membranen werden vervolgens gesneden en embedded onder dekking slips. Cellen in drie verschillende gezichtsvelden werden geteld en alle testen werden uitgevoerd in drievoud.

Western Blotting

Western blot analyse werd uitgevoerd volgens standaardwerkwijzen. Eiwitten werden gescheiden door 10% SDS-PAGE en vervolgens overgebracht op PVDF-membranen (Amersham, Buckinghamshire, UK). Membranen werden overnacht geblokkeerd met 5% magere melkpoeder en gedurende 2 uur met een anti-HOXA1 antilichaam (Bioworld, MN, VS) bij 1:500 verdunningen of anti-GAPDH antilichaam (Proteintech, Chicago, VS) bij 1: 50.000 verdunningen. Na wassen met TBST (10 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl en 0,1% Tween 20) werden de membranen gedurende 2 uur met secundair antilichaam (zsgb-bio, Beijing, China).

Statistieken

Elk experiment werd ten minste driemaal herhaald. De student t-test (tweezijdig) en de x ^{2-test werden uitgevoerd, en statistische significantie werd gedefinieerd als α = 0,05 (twee-side). De gemiddelden ± SD worden weergegeven in de figuren.}

Resultaten

miR-10a is stads geregeld bij maagkanker Cellen

We hebben gekeken naar de expressie van volwassen miR-10a in vier menselijke maagkanker cellijnen (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 en MKN-45) en een menselijke maag epitheel cellijn (GES). Het expressieniveau van miR-10a GES was significant hoger dan de niveaus van de twee maagkanker cellijnen (HGC-27 en MGC-803) en was niet-significant maar waarneembaar hoger dan het niveau in de andere twee maagkanker cellijnen (MKN-45 en SGC-7901) (fig. 1a). Deze gegevens gesuggereerd dat de down-regulatie van miR-10a tot het ontstaan ​​en de ontwikkeling van GC van belang kunnen zijn.

De expressie van miR-10a in Clinical GC Patiënten en hun correlatie met klinisch-pathologische kenmerken

Om de relatie tussen miR-10a en GC ontstaan ​​verdere studie, gedetecteerd we de expressie van miR-10a bij 100 klinische patiënten door TaqMan-probe afgeleid real-time PCR zoals hierboven beschreven. Van de 100 paren GC monsters, de expressie van miR-10a werd down-gereguleerd in 58 gevallen (58/100, 58%) in vergelijking met de overeenkomstige aangrenzende weefsels (fig. 1b). Kortom, de expressie van miR-10a werd down-gereguleerd in GC weefsels opzichte van de aangrenzende weefsels, hoewel de downregulatie was niet statistisch significant (p = 0,148, gepaarde t-test, tweezijdige) (fig. 1c).

de correlatie tussen de expressie van miR-10a en de klinische en pathologische kenmerken evalueren, de patiënten werden verdeeld in twee groepen op basis van de relatieve expressie van miR-10a in kankerweefsel volgens een eerder gepubliceerde document [16] . Zoals getoond in Tabel S2, werd een statistisch significant verband waargenomen tussen de twee groepen TNM. Er zijn meer patiënten die in I II fase in de groep + met lagere expressie van miR-10a in hun GC weefsels. Deze relatie geeft aan dat miR-10a belangrijker beginnende kanker carcinogenese kan zijn. Echter, onze data aangetoond dat de expressie van miR-10a had geen correlatie met leeftijd, geslacht, histologische type tumor percentage, veneuze invasie, zenuw invasie, positie, Borrmann typen, pT stadium, pN podium of pM podium.

miR-10a Remt Cell Proliferation in vitro

Om de rol van miR-10a in de maag carcinogenese te verkennen, we getransfecteerde miR-10a na te bootsen in de GC cellijnen HGC-27 en MGC-803, die beide vertoonden hoge transfectie efficiëntie (fig. 2a). Zoals aangetoond door CCK-8 groei assays 0, 1, 2, 3 en 4 dagen na nabootser transfectie overexpressie van miR-10a verlaagde celproliferatie in beide cellijnen, terwijl de scramble mimic geen effect op de celproliferatie vergeleken met de onbehandelde cellen had (fig. 2b). Vervolgens werden kolonievorming assays uitgevoerd om het proliferatieve vermogen van mimic getransfecteerde HGC-27 en MGC-803 cellen te evalueren en onthulde dat overexpressie van miR-10a in HGC-27 cellen verlaagde kolonievorming (fig. 2c). Geen van de MGC-803 cellen gevormde koloniën gevolg zou kunnen zijn om relatief zwakke hechting van de cellen. Om het effect van miR-10a op apoptose in de twee GC cellijnen verdere beoordeling, de vroege apoptose van MGC-803 en HGC-27-cellen werd onderzocht door Annexine V kleuring na miR-10a mimic transfectie. Zoals verwacht, enkele vroege apoptotische cellen (20,8% in HGC-27 en 22,9% in MGC-803) werden gedetecteerd in de scramble mimische-behandelde cellen, terwijl miR-10a bootst behandeling steeg het percentage van vroege apoptotische cellen (28,4% in HGC -27 en 27,7% in MGC-803) (fig. 2d). Gezamenlijk concludeerden wij dat miR-10a celoverleving kon onderdrukken in GC cellen door het induceren van apoptose.

miR-10a Remt Cell Migratie en invasie In vitro

We verder beoordeelde de effecten van miR-10a op mobiele migratie en invasie, die de belangrijkste determinanten van kwaadaardige progressie en metastase waren. De migratie mogelijkheid werd aangetoond door een wondgenezing /scratch test bij HGC-27 en MGC-803 cellen. Beide cellijnen behandeld met miR-10a mimic waren opvallend lager trekkende dan behandeld met de scramble control of onbehandelde cellen bij 12, 24 en 36 uur na krabben (fig. 3a). Verder voerden we een Matrigel cel invasie assay en bevlekt de binnengedrongen cellen aan de directionele invasie capaciteiten van de cellen te meten na ectopisch uitdrukken van miR-10a in de twee cellijnen. Het invasieve karakter van cellen die met miR-10a mimic werd drastisch afgenomen vergeleken met de scramble controle en onbehandelde cellen (fig. 3b). Deze resultaten toonden aan dat miR-10a speelden een belangrijke rol in het reguleren van de cel migratie en invasiviteit in GC en suggereerde dat de down-regulatie van miR-10a kan bijdragen aan tumor uitzaaiingen in de maag carcinogenese.

miR-10a Doelen HOXA1 in GC

MiRNAs voeren biologische functies door middel van een negatief reguleren van hun target genen. Er werd gemeld dat het oncogen HOXA1 een direct doelwit van miR-10a megakaryocytopoiese en menselijke pancreaskanker [17] - [19]. Zoals voorspeld door PicTar, was er een complementaire sequentie heeft tussen-miR-10a en HOXA1 3'UTR (fig. 4a). Het is echter niet bekend of miR-10a reguleert celproliferatie, migratie en invasie in GC doelwit HOXA1. Hun regulerende relatie verduidelijken we eerst ontdekt eiwit als mRNA niveaus van HOXA1 in miR-10a mimic getransfecteerde HGC-27 en MGC-803 cellen met Western blotting en RT-PCR. Wij namen een duidelijke afname van het HOXA1 eiwitniveau in aanwezigheid van miR-10a bootst opzichte van de scramble controle in de twee cellen (fig. 4b). Het mRNA-niveau van HOXA1 was ook down-gereguleerd in HGC-27 cellen, wat suggereert dat miR-10a remt HOXA1 expressie door vernederende mRNA van HOXA1 in HGC-27 cellen. Er was weinig verandering in het niveau van mRNA HOXA1 in MGC-803 cellen, wat suggereert dat miR-10a kan downreguleren HOXA1 expressie door middel van translationele repressie maar niet mRNA splitsing in MGC-803 cellen (fig. 4c). Verder analyseerden we de eiwitniveaus van HOXA1 bij 24 GC patiënten. Onder deze monsters waren er 12 patiënten bij wie miR-10a werd down-gereguleerd in hun GC weefsels en 12 patiënten bij wie miR-10a werd up-gereguleerd in hun GC weefsels (fig. 4d). HOXA1 werd up-gereguleerd in de meeste patiënten waarbij miR-10a werd down-gereguleerd in hun GC weefsels. Evenzo HOXA1 werd down-gereguleerd in de meeste patiënten waarbij miR-10a werd up-gereguleerd in hun GC weefsels. Een vergelijking van miR-10a niveaus en eiwitniveaus van HOXA1 met GC toonde een omgekeerde correlatie tussen miR-10a en HOXA1 (r ^{2 = 0,1839, p = 0,0366) (Fig. 4e). Tezamen zijn deze bevindingen bieden sterke aanwijzingen dat HOXA1 is een direct doelwit van miR-10a in GC. We hebben ook ontdekt het mRNA-niveau van HOXA1 bij deze patiënten en merkte op dat het mRNA niveau van HOXA1 bij verschillende patiënten niet in overeenstemming met het eiwitgehalte waaruit bleek dat miR-10a regelt de expressie van zijn doel, HOXA1, door middel van translationele repressie maar niet mRNA was splitsing bij deze patiënten (fIG. S1).}

Knock-down van HOXA1 Onderdrukte maagkanker celgroei en migratie in vitro

Vervolgens hebben we gevraagd of HOXA1 gespeeld belangrijk rollen bij maagkanker cellen. Om de rol van HOXA1 in GC onderzoeken we neergehaald endogene HOXA1 in HGC-27 en MGC-803 cellijnen om het effect op celproliferatie en migratie op te sporen. We vonden dat HOXA1 repressie remde de proliferatie en migratie van cellen HGC-27 en MGC-803 cellen, respectievelijk (Fig. 5a en 5b). Deze resultaten suggereren dat miR-10a functioneert als tumor suppressor in GC cellen door het onderdrukken van HOXA1 expressie.

miR-10a is epigenetisch Silenced in GC cellijnen

Om te helderen of de lage expressie van de buitenspiegels 10a GC weefsel was een gevolg van epigenetische veranderingen, behandelden wij HGC-27, MGC-803, SGC-7901 en MKN-45 cellen met een DNA methylatie inhibitor 5-AZA. De expressie van miR-10a werd up-gereguleerd in HGC-27, SGC-7901 en MKN-45 cellen wanneer ze werden behandeld met AZA, wat suggereert dat de expressie van miR-10a kan worden onderdrukt in deze cellen door DNA methylering (FIG. 6a).

Om de regulering van miR-10a door DNA-methylering te bestuderen, zochten we het menselijk genoom-database op de aanwezigheid van CpG eilanden rond miR-10a met behulp van "CpG Island Searcher" software en identificeerde een CpG eiland gelegen 1638 bp stroomopwaarts van miR-10a
(fig. 6b). Verder hebben we ontdekt DNA methylatiestatus behulp QMSP en MSP in de vier GC cellijnen. De CpG eiland werd gehypermethyleerd in alle vier de GC-cellijnen, die in overeenstemming zijn met de lage expressie van miR-10a in deze GC cellijnen was. Wanneer de GC cellijnen werden behandeld met 5-aza-CdR, werd de methylatie niveau verlaagd vergeleken met DMSO groep (fig. 6c).

The Down-regulatie van miR-10a GC patiënten werd door de Hypermethylering van zijn CpG eilanden

We verder onderzocht de methylatie status van het CpG eiland in de GC weefsel en de aangrenzende normale weefsel van 55 willekeurig geselecteerde gevallen door middel van QMSP. De methylatie niveau in de 55 GC weefsels was hoger dan in de naburige niet-kankerachtige weefsels (p < 0,01), die in overeenstemming met de lage expressie van miR-10a GC weefsels was (figuur 6d.). Daarnaast hebben we willekeurig gekozen twee paar monsters waarop het DNA methylatie niveau bisulfaat sequencing PCR (BSP) analyseren om de nauwkeurigheid van MSP valideren. De resultaten van BSP waren consistent met die van QMSP en werden aangevuld FIG. S2. Bovendien de methylatie niveau van miR-10a (M /M + U) in deze AV patiënten vertoonden een negatieve correlatie met de expressie van miR-10a (r ^{2 = 0,1956, p = 0,0006) (Fig. 6e). We hebben geconstateerd ook het methylatie niveau van miR-10a in normale maag cellen en maagkanker cellijnen. De resultaten van QMSP bleek dat de CpG eiland was gedeeltelijk gemethyleerd in GES cellen, maar zeer hypermethylated in de twee maagkanker cellijnen HGC-27 en MGC-803, die ook gesuggereerd dat de CpG eiland stroomopwaarts van miR-10a
gehypermethyleerd werd met GC-cellen (fig. 6f). Tezamen zijn deze bevindingen sterk bewijs dat de expressie van miR-10a werd gereguleerd door DNA methylering bij deze patiënten GC. De down-regulatie van miR-10a in GC patiënten was te wijten aan de hypermethylering van zijn CpG eilanden.}

Discussie

In deze studie hebben we vastgesteld dat miR-10a werd down-gereguleerd in het menselijk maagkanker deels te wijten aan zijn DNA promotor hypermethylering. Verdere studies toonden aan dat overexpressie van miR-10a onderdrukt celproliferatie, migratie en invasiviteit in de GC cellijnen HGC-27 en MGC-803, eventueel door targeting het oncogen HOXA1.

MiRNAs gemeld reguleren verschillende ontwikkelings- en cellulaire processen, en zijn betrokken bij vele menselijke ziekten, met name kanker. MiRNAs onderdrukken genexpressie door zich te richten mRNA door binding aan hun 3 'UTR's. Deze miRNAs vertonen regulerende rol in de pathogenese van kanker en zijn betrokken bij celproliferatie, differentiatie, apoptose, metastase en weerstand [4], [20]. MiR-10a speelt een belangrijke rol in diverse kankers, waaronder hepatocellulaire kanker [9], pancreaskanker [17], acute myeloïde leukemie [21] en chronische myeloïde leukemie [10]. De abnormale expressie van miR-10a waarschijnlijk een belangrijke rol spelen bij maligne transformatie en heeft betrekking op weefsel-specificiteit. De deregulering kan bijdragen aan de ontwikkeling van neoplasie maag.

De validatie van de expressie van miR-10a in klinische monsters toonde aan dat miR-10a werd down-gereguleerd in 58 (58/100, 58%) GC weefsels vergeleken met de aangrenzende weefsels. Echter, Chen Weidong et al.
Onderzochten de expressie van miR-10a 33 GC gevallen en merkte op dat miR-10a expressie was hoger in GC weefsels dan in de aangrenzende weefsels [22]. De inconsistentie kan een gevolg van de verschillende hoeveelheden van klinische monsters en de indistinctive verandering van miR-10a GC weefsels. Onze gegevens moeten biologisch representatieve vanwege het grote aantal klinische monsters. Maar een groot deel, maar niet alle GC patiënten een neerwaartse regulatie van miR-10a in hun GC weefsels hoewel miR-10a functioneert als een tumor suppressor bij maagkanker cellen. Dit kan zijn omdat afzonderlijke mechanisme van het ontstaan ​​van GC tussen verschillende personen. Er kunnen een aantal andere belangrijke genen of factoren die verantwoordelijk zijn voor het ontstaan ​​van tumoren in het GC patiënten in wiens GC weefsels miR-10a was onveranderd of up-gereguleerd. Bovendien, de miR-10a expressie vertoonde geen correlatie met klinisch-pathologische kenmerken behalve TNM, wat aangeeft dat miR-10a een gedeeltelijke rol in tumorvorming kunnen spelen vooral in vroege stadia.

Veel miRNAs is gemeld dat correleert met het ontstaan ​​van tumoren, maar de onderliggende moleculaire mechanisme blijft onduidelijk. In ons rapport, een functionele analyse van miR-10a, zoals mobiele proliferatie, migratie en invasie assays, heeft ons geholpen om beter te begrijpen van de bijdrage van miR-10a aan maagkanker. Transfectie van miR-10a na te bootsen remde significant celproliferatie, migratie en invasiviteit in GC cellen, wat aangeeft dat de onderdrukking van miR-10a progressie van de tumor in de maag carcinogenese kunnen bevorderen. Toekomstige studies zijn nodig om dit mechanisme te ontrafelen.

In het menselijk genoom, miR-10a
ligt stroomopwaarts van HOXB4
. MiR-10b
, een ander lid van de miR-10 familie, bevindt zich stroomopwaarts van HOXD4
. Deze twee leden zijn verschillend van elkaar in één base en vertonen identieke zaad sequenties, hun vergelijkbare functies suggereert. Kwoneel Kim [12] heeft gemeld dat miR-10b speelt een rol in GC als een tumor suppressor. In onze studie hebben we aangetoond dat de overexpressie van miR-10a geremd tumor proliferatie, migratie en invasiviteit, die vergelijkbaar zijn met de functie van miR-10b in GC was. HOX genen zijn sterk geconserveerd transcriptiefactoren die bepalend zijn voor de juiste anterieure-posterieure patroonvorming van de lichaamsas [23] zijn. HOXA1 is gevalideerd als direct doelwit van miR-10a in humane pancreatische kanker [17] en megakaryocytopoiese [18]. We hebben ook waargenomen dat overexpressie van miR-10a verlaagde HOXA1 eiwitniveaus in twee GC cellijnen, wat suggereert dat HOXA1 een direct doelwit van miR-10a bij maagkanker.

epigenetische veranderingen is aangetoond dat dit essentiële bemiddelaars grondslag liggen aan de down-regulatie van miRNA expressie en vertonen een strakke correlatie met carcinogenese [12], [13], [24]. Onze gegevens laten zien dat de Hypermethylering van het CpG eiland stroomopwaarts van miR-10a
leidde tot de down-regulatie van miR-10a in GC cellijnen en GC patiënten. Bovendien AZA behandeling verhoogde miR-10a in GC cellijnen. Op basis van onze bevindingen kan de methylatiestatus van miR-10a worden toegepast als een potentiële biomarker in GC.

Kortom, deze studie toont aan dat miR-10a fungeert als een tumor suppressor in GC cellen en gedeeltelijk op gereguleerde door DNA hypermethylering. Geforceerde expressie van miR-10a onderdrukt celproliferatie, migratie en invasiviteit In vitro
. De status methylering en het expressieniveau van miR-10a kan als potentiële biomarkers GC dienen en miR-10a kunnen mogelijke therapeutische waarde bij kankertherapie hebben. Nader onderzoek naar de epigenetische regulatie van miRNA expressie nodig zijn, en de regulering van miRNA expressie door epigenetische drugs kan een nieuwe therapeutische strategie voor de maag en andere menselijke kankers.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
De mRNA-niveau van HOXA1 in de 24 GC-patiënten werd gedetecteerd door qRT-PCR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s001
(TIF)
Figuur S2.
BSP analyse van de methylatie status van twee GC patiënten. Gevuld en open cirkels vertegenwoordigen gemethyleerd en niet-gemethyleerd CpG plaatsen respectievelijk
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s002
(TIF)
Tabel S1.
De primers worden gebruikt in dit artikel
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s003
(XLSX)
tabel S2.
associatie tussen de expressie van miR-10a met clinicopathologische functies bij patiënten met maagkanker
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s004
(XLSX)

Dankwoord

De auteurs danken Hualu Zhao uit IBMS (Institute of Basic Medische Wetenschappen), PUMC (Peking Union Medical College) voor technische bijstand en Dr. Hongkai Zhang uit Jiuxianqiao ziekenhuis voor haar hulp bij immunohistochemie.

• PLoS ONE: Labor Resource Use voor Screening Endoscopische maagkanker in de Japanse Primary Care instellingen: Werk Sampling Study
• PLoS ONE: Gene Polymorfismen van microRNA's bij Helicobacter pylori-geïnduceerde hoog risico atrofische gastritis en maagkanker