PLOS ONE: MicroRNA-10a é regulada pelo DNA metilação e funciona como um supressor tumoral no câncer gástrico Cells

Abstract

Fundo

MicroRNAs ato como reguladores pós-transcricional da expressão gênica em muitos processos biológicos. Seus desregulamentações ocorrem comumente em câncer gástrico (GC). Embora a metilação do DNA constitui um importante mecanismo para a desregulamentação microRNA no câncer, este campo em grande parte permanece inexplorado.

Metodologia /Principais Achados

O RNA total foi extraído a partir de tecidos de 100 pacientes com GC e quatro gástrica linhas celulares de cancro. Os níveis de expressão de miR-10a foram determinadas por PCR em tempo real com sondas TaqMan específicas. Além disso, foi realizada uma análise funcional de miR-10a na regulação da proliferação celular, migração e invasão. Posteriormente, metilação específicas de PCR quantitativo (qMSP) foi utilizado para detectar o estado de metilação do DNA nas ilhas CpG montante de miR-10a
. Neste estudo, verificou-se que a expressão de miR-10a em células GC foi menor do que em células normais, o que era devido à hipermetilação das ilhas CpG montante de miR-10a
. Nós também validou a expressão ligeiramente mais baixa do miR-10a em tecidos de GC do que os seus tecidos adjacentes não neoplásicas em 100 doentes confirmou a GC e hipermetilação de ilhas CpG a montante de miR-10a
em alguns pacientes. Além disso, a re-introdução de miR-10a em células de GC foi capaz de inibir a proliferação celular, migração e invasão. Bioinformática e análise de immunoblot indicaram que os papéis supressores de tumor de miR-10a em células GC foram possivelmente através de segmentação HOXA1.

Conclusões /Significado

Nossos dados indicam que miR-10a atua como um supressor de tumor GC em células e é parcialmente silenciados por hipermetilação do ADN em GC, sugerindo que o miR-10a pode servir como um potencial alvo de diagnóstico ou terapêutico de GC

citação:. Jia H, Zhang Z, Zou D, Wang B, Yan Y, M Luo, et ai. (2014) MicroRNA-10a é regulada pelo DNA metilação e funciona como um supressor de tumor em células de câncer gástrico. PLoS ONE 9 (1): e88057. doi: 10.1371 /journal.pone.0088057

editor: Jorg Tost, CEA - Institut de Genomique, França |

Recebido: 26 Janeiro, 2013; Aceito: 04 de janeiro de 2014; Publicação: 31 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Jia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (2011, 91.129.716, a JY), o Beijing Science &Municipal; Tecnologia da Comissão (2010B071, para J.Y.), Instituto de Ciências Médicas Básicas, da Academia Chinesa de Ciências Médicas (2009RC03, para J.Y .; 2010PYB06, para J.Y .; 2012G04, para J.Y.). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (GC) é a segunda causa mais frequente de morte por câncer no mundo [1]. Até agora, alguns genes supressores de tumores e genes relacionados com o tumor foram relatados em GC. Apesar de extensos estudos foram realizados para identificar vias e mecanismos envolvidos no desenvolvimento do cancro genéticos, algumas melhorias no diagnóstico precoce de cancro tenham sido efectuadas. MicroRNAs (miRNAs) são endógenos pequenos RNAs não-codificantes que foram identificados como reguladores pós-transcricional da expressão do gene. Estudos anteriores indicaram que miARNs exercer as suas funções através de emparelhamento de bases com a região imperfeita 3'untranslated (3'UTR) de mRNAs alvo [2] e miARNs têm sido extensivamente estudados no contexto da regulação do ciclo celular, diferenciação, desenvolvimento e apoptose [3], [4]. Muitas evidências indicam que os miRNAs estão desregulados em várias doenças, especialmente no câncer. Por exemplo, o miR-216b é marcadamente regulado negativamente no carcinoma da nasofaringe [4]; miR-340 é desregulado no cancro da mama e podem inibir a migração de células do cancro da mama e invasão [5]; e miR-31 foi identificado como um oncogene em carcinoma de células escamosas do esôfago [6]. Tomados em conjunto, miARNs foram identificados como potenciais candidatos para novos biomarcadores ou alvos de diagnóstico terapêutico do cancro.

miR-10a tem sido relatada a desempenhar papéis importantes na génese e desenvolvimento de uma variedade de cancros humanos. Por exemplo, miR-10a é desregulamentado em cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas e também no carcinoma hepatocelular [7], [8]. Além disso, no cancro do colo do útero humano, o miR-10a serve como um oncogene por regulação CHL1 [9]; down-regulação do miR-10a na leucemia mielóide crónica promove CD34 ^{+ células de proliferação [10]. No entanto, a função de miR-10a e a carcinogénese gástrica mecanismo subjacente permanecem obscuros. Neste estudo, foram medidas com precisão a expressão de miR-10a em 100 doentes com cancro gástrico e investigados os papéis de miR-10a em células de cancro gástrico. Descobrimos que miR-10a foi regulada para baixo em tecidos GC e executadas expressão de miR-10a reprimiu a proliferação, migração e invasão das células GC.}

modificações epigenéticas, incluindo hipermetilação DNA, desacetilação de histonas e metilação de histonas estão intimamente associado a inativação do gene. hipermetilação promotor é pensado para ser um mecanismo alternativo para regular os genes supressores de tumores em cancros humanos [11]. MiRNAs cuja expressão é reprimida por metilação do DNA têm sido relatados em alguns cancros humanos [12] - [14]. Para investigar se a regulação de miR-10a origina a partir da hipermetilação da região genômica montante do miR-10a
, analisamos a metilação do DNA da ilha de CpG na região promotora de miR- 10a
em 55 pacientes do GC e descobriu que a regulação negativa de miR-10a em tecidos GC pode ser devido à hipermetilação das sequências CpG em seu promotor.

Materiais e Métodos

os pacientes e espécimes

amostras clínicas Humanos foram coletadas de espécimes cirúrgicos de 100 pacientes com GC no Instituto do Câncer e do Hospital da Academia chinesa de Ciências Médicas, Hospital Geral do Exército de Libertação do Povo e Hospital do Câncer Shanxi. Os correspondentes tecidos não-neoplásicas adjacentes a partir da margem do tumor macroscópico foram isolados, ao mesmo tempo e utilizados como controlos. Os tumores foram classificados de acordo com o TNM (2010) critérios de classificação da União Internacional de Controle do Câncer (UICC). Todas as amostras foram divididas em duas partes e foram imediatamente congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à extracção do ARN. Quatro linhas celulares de cancro gástrico (HGC-27, MGC-803, a SGC-7901 e MKN-45) foram todos conservados no nosso laboratório e mantidas em DMEM ou 1640 com 10% de FBS. O Comitê de Ética em Pesquisa Clínica do Instituto de Ciências Médicas Básicas, da Academia Chinesa de Ciências Médicas aprovou os protocolos de pesquisa e consentimento informado por escrito foi obtido dos participantes.

Extração de RNA, cDNA Síntese de mRNAs e miRNAs e Real- os ensaios de PCR em tempo

o ARN total foi extraído a partir de tecidos de cancro gástrico e células utilizando Trizol reagente (Invitrogen, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O ARN foi quantificado por absorvância a 260 nm e o ADNc foi sintetizado por M-MLV de transcriptase inversa (Invitrogen) a partir de 2 ug de ARN total. Oligo (dT) 18 foi utilizado como os iniciadores de RT para a transcrição reversa do ARNm. Uma estrutura haste-laçada iniciador de RT foi utilizado para a transcrição reversa de miARN. RT-PCR quantitativa foi realizada em uma coluna Bio-Rad CFX96 em tempo real, PCR System (Bio-Rad, CA, EUA) utilizando o kit de SYBR Premix Ex Taq (Takara, Dalian, China) ou TaqMan sondas (Applied Biosystems, Foster City, CA , EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As condições de PCR foram como se segue: 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 34 s. Para os mRNAs, os dados foram normalizados utilizando o controlo GAPDH endógena. Para miARNs, snRNA U6 foi utilizado como o controle endógeno. A quantidade relativa de miR-10a foi medida com o método -ΔΔCT 2 ^{. As sequências dos iniciadores são apresentadas na Tabela S1.}

extracção do ADN, PCR (qMSP)

ADN genómico de elevado peso molecular foi extraído de tecidos de cancro gástrico metilação específicas de PCR (MSP) e quantitativa metilação-específicos utilizando um kit de Extracção de DNA (biomed, BJ, China) de acordo com as instruções do fabricante. bissulfito modificação foi realizada utilizando o kit de sequenciação Epitect bissulfito (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com o protocolo. Até 2 ug de ADN genómico foi utilizado como um material de partida. ADN de linfócitos normais tratados com CpG metiltransferase (M.SssI) (NEB, MA, EUA) foi usada como um controlo positivo, e um sistema de reacção, sem qualquer modelo foi utilizado como um controlo em branco.

O sódio bisulfate- ADN tratado foi amplificado utilizando o Bio-Rad CFX96 em tempo real, PCR System (Bio-Rad) utilizando Kits de KAPA SYBR® qPCR rápida (Kapa Biosystems) com as seguintes condições: 95 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 54 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 30 s e uma extensão final a 72 ° C durante 10 min. GAPDH foi usada como um controlo interno. qMSP reacções foram realizadas em triplicado. O nível de metilação numa amostra foi estimada como Lu G et al. descrito [15]. As sequências dos iniciadores são apresentadas na Tabela S1.

5-Aza-2'-deoxyazacytidine Tratamento

células de cancro gástrico foram semeadas em placas de 10 cm (1 × 10 ^{6 células por prato) um dia antes do tratamento com drogas. As células foram tratadas com 1? M de 5-aza-2'-deoxyazacytidine (5-AZA) (Sigma, MO, EUA) a cada 24 h durante 3 dias.}

Cultura de Células e Transfecção oligonucleótidos

As linhas de células gástricas humanas HGC-27, SGC-7901 e MKN-45 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) meio suplementado com soro de bovino fetal a 10%, e MGC-803 foi mantida em DMEM (Gibco, BRL , Reino Unido) suplementada com soro bovino fetal a 10%. Estas linhas de células foram mantidas a 37 ° C em ar humidif içado contendo 5% de CO _2.

O miR-10a mímico, a precipitação imitador, siHOXA1 siRNA e mexidos siRNA foram sintetizados por GenePharma (Xangai, China ) e transfectado para as células a uma concentração final de 50 nmol /L, utilizando o Reagente DharmaFECT1 (Dharmacon, TX, EUA).

proliferação celular e Ensaio de Formação de Colónias

os mimic- ou siRNA- As células transfectadas foram semeadas em placas de 96 poços (5000 células /poço). As células foram incubadas com 10% de CCK-8 (DOJINDO, Japão) a 37 ° C até que ocorreu a conversão de cor visual. as taxas de proliferação foram determinados às 0, 12, 24, 48, 72, 96 horas após a transfecção.

As células imitam-transfectadas foram tripsinizadas e novamente plaqueadas a 200 células por poço em placas de 6 poços e mantidas em 1640 com 10% de FBS. As células foram cultivadas durante 7 dias, fixadas com metanol e coradas com 0,1% de violeta cristal em 20% de metanol durante 15 min.

celular Ensaio de Apoptose

ensaios de apoptose foram efectuados em HGC-27 e linhas de células MGC-803 usando o kit de anexina V-FITC Detection apoptose I (BD Biosciences) de acordo com o protocolo do fabricante e depois analisados ​​por Calibur Citómetro de fluxo (Becton Dickinson).

Migração e celular Invasion Ensaios

um ensaio de cicatrização da ferida foi realizada para avaliar a migração celular. Uma ferida artificial foi criado em uma monocamada de células confluentes sem FBS usando um 200 mL ponteira 24 horas após a transfecção. Para visualizar as células e cicatrização de feridas migração, as imagens foram tiradas em 0, 12, 24, 36, 48, 60 horas.

Para os ensaios transpoço invasão, GSC-27 e células MGC-803 suspenso em 0,2 ml de RPMI 1640 ou DMEM sem FBS foram colocadas no compartimento superior de cada inserto (Millipore, MA, EUA) previamente revestidas com 40 ul de 1 mg /mL de matrigel. A câmara inferior foi preenchida com 600 ul de meio RPMI 1640 ou DMEM com 10% de FBS como o atraente nutricional. 24 horas mais tarde, as células de invasão ligados à superfície inferior foram fixadas com metanol a 20% e coradas com May-Gruwald-Giemsa (MGG). As membranas foram então esculpidos e embutidos sob lamelas. As células em três campos visuais diferentes foram contadas, e todos os ensaios foram realizados em triplicado.

Western Blotting

análise de Western blot foi realizada de acordo com métodos padrão. As proteínas foram separadas por 10% SDS-PAGE e depois transferidos para membranas de PVDF (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). As membranas foram bloqueadas durante a noite com leite seco sem gordura 5% e incubadas durante 2 h com um anticorpo anti-HOXA1 (Bioworld, MN, EUA) em diluições 1:500 ou anticorpo anti-GAPDH (Proteintech, Chicago, EUA) a 1: 50.000 diluições. Após lavagem com TBST (Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM e 0,1% de Tween 20), as membranas foram incubadas durante 2 h com o anticorpo secundário (zsgb-bio, Pequim, China).

Cada experiência foi repetida pelo menos três vezes. Foram realizados teste do estudante t (de duas caudas) eo x ^{2 de teste, ea significância estatística foi definido como α = 0,05 (dois lados). As médias ± SD são exibidos nas figuras.}

Resultados

miR-10a é regulada em células de câncer gástrico

Foi examinada a expressão de miR-10a maduro em quatro linhas celulares de cancro gástrico humano (HGC-27, MGC-803, a SGC-7901 e MKN-45) e uma linha celular de epitélio gástrico humano (BEE). O nível de miR-10a em GES expressão foi significativamente maior do que os níveis em duas linhas celulares de cancro gástrico (HGC-27 e MGC-803) e foi não significativamente, mas visivelmente mais elevado do que os níveis nas outras duas linhas celulares de cancro gástrico (MKN-45 e SGC-7901) (Fig. 1a). Estes dados sugerem que a regulação de miR-10a pode ser relevante para a gênese e desenvolvimento de GC.

A expressão de miR-10a em Pacientes GC Clínica e sua correlação com as características clínicopatológicos

Para estudar ainda mais a relação entre o miR-10a e GC génese, foi detectada a expressão de miR-10a em 100 pacientes clínicos por TaqMan em tempo real derivado de sonda de PCR tal como descrito acima. De 100 pares de amostras de GC, a expressão de miR-10a foi regulada em 58 casos (58/100, 58%) em comparação com os tecidos adjacentes correspondentes (FIG. 1b). Em geral, a expressão de miR-10a foi regulada para baixo em tecidos GC em comparação com os tecidos adjacentes, embora a sub-regulação não foi estatisticamente significativa (p = 0,148, teste t emparelhado, bicaudal) (fig. 1C).

para avaliar a correlação entre a expressão de miR-10a e as características clínico-patológicas, os pacientes foram divididos em dois grupos de acordo com a expressão relativa de miR-10a em tecidos de câncer de acordo com um artigo publicado anteriormente [16] . Como mostrado na Tabela S2, foi observada uma associação estatisticamente significativa entre os dois grupos TNM. Há mais pacientes que estão em fase de I + II no grupo com menor expressão de miR-10a nos seus tecidos GC. Esta relação indicaram que miR-10a pode ser mais importante na carcinogênese do câncer precoce. No entanto, nossos dados demonstram que o nível de miR-10a expressão não teve correlação com a idade, sexo, tipo histológico, o percentual de tumor, invasão venosa, invasão do nervo, posição, Borrmann digitação, fase pT, pN estágio ou estágio pM.

miR-10a inibe a proliferação celular in vitro

Para explorar o papel de miR-10a na carcinogênese gástrica, nós transfectadas miR-10a imitar nas linhas celulares GC HGC-27 e MGC-803, ambos os quais exibiram elevada eficicia de transfeco (FIG. 2A). Como demonstrado por CCK 8-ensaios de crescimento de 0, 1, 2, 3 e 4 dias após a transfecção mímico, a sobre-expressão de miR-10a reduziu a proliferação celular em ambas as linhas celulares, ao passo que a mímica precipitação teve nenhum efeito sobre a proliferação celular em comparação com as células não tratadas (Fig. 2b). Subsequentemente, os ensaios de formação de colónias foram realizados para avaliar a capacidade proliferativa das células transfectadas imitam-HGC-27 e MGC-803 e revelaram que a sobreexpressão de miR-10a em células HGC-27 reduziu a formação de colónias (Fig. 2c). No entanto, nenhuma das células MGC-803 colónias formadas, o que pode ser devido à aderência relativamente fraca das células. Para resolver ainda mais o efeito de miR-10a sobre a apoptose de células nas duas linhas de células de GC, a apoptose precoce do MGC-803 e células HGC-27 foi examinada através de coloração de anexina V após transfecção mímico miR-10a. Como esperado, algumas células precoce apoptóticas (20,8% em HGC-27 e 22,9% em MGC-803) foram detectados nas células imitam-tratada precipitação, enquanto que o tratamento imita o miR-10a aumentou a percentagem de células apoptóticas precoces (28,4% em HGC -27 e 27,7% em MGC-803) (fig. 2d). Coletivamente, nós concluímos que o miR-10a poderia suprimir a sobrevivência das células em células GC através da indução de apoptose celular.

miR-10a inibe a migração celular e invasão in vitro

Nós ainda mais avaliaram os efeitos do miR-10a sobre a migração e invasão celular, que foram os principais determinantes da progressão maligna e metástase. A capacidade de migração foi demonstrada por um ensaio de cicatrização de feridas /zero em HGC-27 e células MGC-803. Ambas as linhas de células tratadas com o miR-10a imitador eram distintamente menos migratório do que aqueles tratados com o controlo de precipitação ou células não tratadas em 12, 24, e 36 horas após arranhão (Fig. 3a). Além disso, foi realizado um ensaio de invasão Matrigel de células coradas e as células invadidas para medir a capacidade de invasão das células de direcção depois de expressar ectopicamente o miR-10a nas duas linhas celulares. A capacidade de invasão de células transfectadas com o imitador de miR-10a foi drasticamente diminuída em comparação com o controlo de precipitação e células não tratadas (Fig. 3B). Estes resultados demonstraram que o miR-10a desempenharam papéis importantes na regulação da migração celular e invasão no GC e sugeriu que a infra-regulação de miR-10a pode contribuir para a metástase do tumor na carcinogênese gástrica.

miR-10a Alvos HOXA1 em GC

miRNAs executar funções biológicas através da regulação negativa seus genes-alvo. Tem sido relatado que o HOXA1 oncogene é um alvo directo de miR-10a em megacariocitopoiese e cancro pancreático humano [17] - [19]. Como previsto por PicTar, houve uma sequência complementar tem entre-miR-10a e HOXA1 3'UTR (Fig. 4a). No entanto, desconhece-se se o miR-10a regula a proliferação celular, migração e invasão no GC, visando HOXA1. Para clarificar a sua relação reguladora, que detectada pela primeira vez a níveis de mRNA de HOXA1 proteína e em células de miR-10a imitam-transfectadas HGC-27 e MGC-803 utilizando Western blotting e RT-PCR. Observou-se uma diminuição evidente no nível da proteína na presença de HOXA1 imita o miR-10a comparado com o controlo de precipitação nas duas células (FIG. 4b). O nível de mRNA de HOXA1 também foi regulada em células HGC-27, sugerindo que o miR-10a inibe a expressão HOXA1 degradando mRNA de HOXA1 em células HGC-27. No entanto, houve pouca alteração no nível de ARNm de HOXA1 em células MGC-803, sugerindo que o miR-10a pode regular negativamente a expressão HOXA1 através da repressão de translação mas não mRNA de clivagem em células MGC-803 (Fig. 4C). Além disso, foram analisados ​​os níveis de proteína de HOXA1 em 24 pacientes do GC. Entre estas amostras, houve 12 pacientes nos quais o miR-10a foi regulada negativamente nos seus tecidos GC e 12 pacientes nos quais o miR-10a foi regulada nos seus tecidos de GC (Fig. 4d). HOXA1 foi regulada na maioria dos doentes em que miR-10a foi regulada para baixo em seus tecidos GC. Da mesma forma, HOXA1 foi regulada para baixo na maior parte dos pacientes nos quais o miR-10a foi regulada nos seus tecidos GC. A comparação dos níveis de miR-10a e níveis de proteína de HOXA1 em GC revelou uma correlação inversa entre o miR-10a e HOXA1 (r ^{2 = 0,1839, P = 0,0366) (fig. 4-E). Colectivamente, estes resultados fornecem fortes evidências de que HOXA1 é um alvo direto de miR-10a em GC. Nós também detectado o nível de ARNm de HOXA1 nestes pacientes e observou-se que o nível de ARNm de HOXA1 em vários pacientes não foi consistente com o nível de proteína que indicou que o miR-10a regula a expressão do seu alvo, HOXA1, através da repressão de translação mas não ARNm clivagem nestes pacientes (FIG. S1).}

Knock-down de HOXA1 suprimida Câncer gástrico crescimento celular e migração in vitro

em seguida, foi perguntado se HOXA1 desempenhado importante papéis em células de cancro gástrico. Para examinar o papel do HOXA1 no GC, nós derrubado HOXA1 endógeno em HGC-27 e linhas de células MGC-803 para detectar o efeito sobre a proliferação celular e migração celular. Observou-se que a repressão HOXA1 inibiram a proliferação e migração celular de HGC-27 e MGC-803 células, respectivamente (Fig. 5a e 5b). Estes resultados sugerem que as funções de miR-10a como supressor de tumor em células GC suprimindo a expressão HOXA1.

miR-10a é epigenetically Silenciado em linhas de células GC

Para elucidar se a baixa expressão de miR- 10a no tecido GC foi resultado de alterações epigenetical, nós tratados HGC-27, MGC-803, SGC-7901 e MKN-45 células com um inibidor da metilação do DNA 5-aza. A expressão de miR-10a foi regulado para cima em HGC-27, SGC-7901 e células MKN-45 quando foram tratados com AZA, sugerindo que a expressão de miR-10a pode ser reprimidos nestas células por metilação do ADN (fig. 6a).

para estudar a regulação de miR-10a por metilação do DNA, que procurou o banco de dados do genoma humano para a presença de ilhas CpG em torno de miR-10a utilizando software "CpG ilha Searcher" e identificou uma ilha CpG localizada 1638 pb a montante do miR-10a
(FIG. 6b). Além disso, detectamos o estado de metilação do DNA usando qMSP e MSP nas quatro linhas celulares GC. A ilha CpG foi hipermetilado em todas as quatro linhas celulares de GC, o que era consistente com a baixa expressão de miR-10a nestas linhas celulares GC. Quando as linhas de células de GC foram tratadas com 5-aza-CdR, o nível de metilação foi diminuída em comparação com o grupo de DMSO (Fig. 6c).

A sub-regulação de miR-10a em GC pacientes era devido a a hipermetilação de suas ilhas CpG

Foram examinados ainda mais o estado de metilação da ilha CpG no tecido GC eo tecido normal adjacente de 55 casos selecionados aleatoriamente através qMSP. O nível de metilação nos 55 tecidos GC era mais elevada do que nos tecidos adjacentes não cancerosos (p < 0,01), o que foi consistente com a baixa expressão de miR-10a em tecidos de GC (Fig. 6d). Além disso, foram selecionados aleatoriamente dois pares de amostras em que para analisar o nível de metilação do DNA por sequenciamento bisulfate PCR (BSP) para validar a precisão do MSP. Os resultados de BSP eram consistentes com a de qMSP e foram suplementadas que a FIG. S2. Além disso, o nível de metilação do miR-10a (M /H + L) nestes doentes GC exibiu uma correlação inversa com a expressão de miR-10a (R ^{2 = 0,1956, P = 0,0006) (Fig. 6e). Nós também detectado o nível de metilação de miR-10a em células gástricas normais e linhas celulares de cancro gástrico. Os resultados de qMSP revelou que a ilha de CpG foi parcialmente metilado em células GES mas extremamente hipermetilado nas duas linhas celulares de cancro gástrico HGC-27 e MGC-803, que também sugeriu que a ilha de CpG a montante de miR-10a
foi hipermetilado em células de GC (Fig. 6f). Colectivamente, estes resultados fornecem forte evidência de que a expressão de miR-10a foi regulada por metilação do ADN nestes pacientes GC. A infra-regulação de miR-10a em pacientes GC foi devido à hipermetilação das suas ilhas CpG.}

Discussão

Neste estudo, determinou-se que o miR-10a foi regulada para baixo em humanos câncer gástrico parcialmente devido à sua hipermetilação do promotor DNA. Outros estudos demonstraram que a sobre-expressão de miR-10a suprimiu a proliferação celular, migração e invasão nas linhas celulares GC HGC-27 e MGC-803, possivelmente através da segmentação HOXA1 oncogene.

MiRNAs têm sido relatados para regular vários desenvolvimento e processos celulares, e estão implicados em muitas doenças humanas, especialmente no cancro. MiRNAs suprimir a expressão do gene, visando mRNAs através da ligação a seus "UTRs 3. Estes exibem miARNs papéis reguladores na patogénese de cancro e estão envolvidos na proliferação celular, diferenciação, apoptose, metástase e resistência [4], [20]. MiR-10a desempenha um papel importante em vários tipos de câncer, incluindo câncer hepatocelular [9], câncer pancreático [17], leucemia mielóide aguda [21] e leucemia mielóide crónica [10]. A expressão anormal de miR-10a é susceptível de desempenhar um papel crucial na transformação maligna e é relativa ao tecido-especificidade. A sua desregulação pode contribuir para o desenvolvimento de neoplasias do estômago.

A validação da expressão de miR-10a em amostras clínicas demonstraram que o miR-10a foi regulada para baixo em 58 58/100 (58%), GC tecidos em comparação com os tecidos adjacentes. No entanto, Chen Weidong et ai.
Investigada a expressão de miR-10a em 33 casos CG e observou-se que a expressão de miR-10a foi maior em tecidos de GC do que nos tecidos adjacentes [22]. A inconsistência pode ser um resultado das diferentes quantidade de amostras clínicas e a mudança indistinto de miR-10a em tecidos GC. Os nossos dados deve ser mais biologicamente representive por causa dos grandes números de amostras clínicas. Apenas uma parte maior, mas nem todos os pacientes GC tem uma sub-regulação de miR-10a nos seus tecidos GC Embora as funções de miR-10a como um supressor de tumor em células de cancro gástrico. Isso pode ser por causa do mecanismo distinto da gênese da GC em diferentes indivíduos. Pode haver alguns outros genes importantes ou fatores responsáveis ​​por tumorigênese nos pacientes GC em cujo GC tecidos miR-10a ficou inalterada ou up-regulada. Além disso, a expressão de miR-10a não exibiram correlação com características clinicopatológicas excepto para a fase de TNM, indicando que o miR-10a pode desempenhar um papel na tumorigénese parcial especialmente nas fases iniciais.

Muitos miARNs têm sido relatados para correlacionar com tumorigénese, no entanto, o mecanismo molecular subjacente permanece obscura. No nosso relatório, uma análise funcional de miR-10a, incluindo proliferação celular, ensaios de migração e invasão, ajudou-nos a compreender melhor a contribuição de miR-10a a carcinogênese gástrica. A transfecção de miR-10a imitar a proliferação celular significativamente inibida, migração e invasão de células de GC, indicando que a repressão de miR-10a pode promover a progressão do tumor na carcinogénese gástrica. Futuros estudos são necessários para elucidar este mecanismo.

No genoma humano, miR-10a
está localizado a montante do HOXB4
. miR-10b
, outro membro da família miR-10, situa-se a montante do HOXD4
. Estes dois elementos são diferentes uns dos outros em apenas uma base e apresentar sequências de sementes idênticos, sugerindo suas funções semelhantes. Kwoneel Kim [12] relataram que o miR-10b desempenha um papel na GC como um supressor de tumor. No nosso estudo, demonstrou-se que a sobre-expressão de miR-10a inibiu a proliferação do tumor, a migração e invasiva, o que foi semelhante para a função de miR-10b no GC. genes HOX são altamente conservadas factores de transcrição que são determinantes para padronização ântero-posterior correcta do eixo do corpo [23]. HOXA1 foi validado como um alvo direto de miR-10a no câncer humano pancreático [17] e megacariocitopoiese [18]. Também foi observado que a sobre-expressão de miR-10a diminuiu os níveis de proteína HOXA1 em duas linhas celulares de GC, o que sugere que HOXA1 é um alvo directo de miR-10a no cancro gástrico.

modificações ambientais têm mostrado ser os principais mediadores subjacente ao down-regulação da expressão do miRNA e apresentam uma estreita correlação com a carcinogênese [12], [13], [24]. Os nossos dados demonstraram que a hipermetilação da ilha CpG a montante de miR-10a
levou à diminuição da regulação de miR-10a em linhas celulares de GC e GC pacientes. Além disso, o tratamento AZA aumentou miR-10a em linhas de células de GC. Com base nas nossas conclusões, o estado de metilação de miR-10a pode ser utilizada como um biomarcador potencial em GC.

Em resumo, este estudo indica que o miR-10a actua como um supressor de tumor em células GC e é, em parte, para baixo -regulated por hipermetilação do ADN. A expressão forçada de miR-10a suprime a proliferação celular, migração e invasão in vitro
. O estado de metilação e o nível de expressão de miR-10a pode servir como potenciais marcadores de GC, e miR-10a pode ter valor terapêutico potencial na terapia do cancro. Outros estudos sobre a regulação epigenética da expressão miRNA são necessárias, e a regulação da expressão miRNA por drogas epigenéticas podem fornecer uma nova estratégia terapêutica para cânceres humanos gástricas e outros.

Informações de Apoio
Figura S1.
O nível de mRNA de HOXA1 nos pacientes GC 24 foi detectada por qRT-PCR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s001
(TIF)
Figura S2. análise
BSP do estado de metilação em dois pacientes do GC. locais CpG não metiladas cheio e os círculos abertos representam metilado e, respectivamente,
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s002
(TIF)
Tabela S1.
Os iniciadores são utilizados neste artigo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s003
(XLSX)
Tabela S2.
associação entre a expressão de miR-10a com características clínico-patológicas em pacientes com câncer gástrico
DOI:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s004
(XLSX)

Reconhecimentos

Os autores agradecem Hualu Zhao de IBMS (Instituto de Ciências Médicas básicas), PUMC (Peking Union Medical College) para assistência técnica e Dr. Hongkai Zhang partir Jiuxianqiao Hospital por sua ajuda na imuno-histoquímica.

• PLOS ONE: Trabalho Resource Use para rastreamento endoscópico câncer gástrico em cuidados primários configurações japoneses: um estudo de amostragem de trabalho
• PLOS ONE: Gene Polimorfismos de microRNAs na Helicobacter pylori Induzida Alto Risco atrófica gastrite e câncer gástrico