Plos ONE: MicroRNA-10a Je Dol urejeno s DNA metilacije in funkcije kot zaviralnih v želodcu raka celic

Povzetek

Ozadje

MicroRNAs deluje kot posttranscriptional regulatorji izražanja genov v številnih bioloških procesih. Njihove deregulations pojavljajo pogosteje pri raku želodca (GC). Čeprav DNA metilacija pomemben mehanizem za microRNA deregulacijo raka, na tem področju v veliki meri še vedno neraziskana.

Metodologija /Glavne ugotovitve

Total RNA je bila vzeta iz tkiva 100 bolnikov z GC in štiri želodca rakave celične linije. Stopnje izraženosti za miR-10a smo določili z PCR v realnem času s posebnimi TaqMan sondami. Poleg tega je bila izvedena funkcionalna analiza miR-10a pri urejanju proliferacije celic, migracije in invazijo. Nato kvantitativno metilacija specifični PCR (qMSP) je bila uporabljena za zaznavanje stanja DNA metilacijskega v otokih CpG gorvodno od miR-10a
. V tej študiji smo ugotovili, da je bil izraz pokoj-10a v GC celicah nižja kot v normalnih celicah, ki je bil zaradi hypermethylation otokov CpG gorvodno od miR-10a
. Prav tako potrdil nekoliko nižji izraz pokoj-10a v GC tkivih kot njihovi sosednjih ne-neoplastične tkiva pri 100 bolnikih, GC in potrdil hypermethylation za CpG otokov nabavnih za miR-10a
pri nekaterih bolnikih. Poleg tega je ponovno uvajanje pokoj-10a v GC celice lahko zavirajo proliferacije celic, migracije in invazijo. Bioinformatika in analiza imunoblot je pokazala, da so bili zaviralnih vloge pokoj-10a v GC celic morebiti s ciljanjem HOXA1.

Sklepi /Pomen

Naši podatki kažejo, da miR-10a deluje kot zaviralnih v GC celicah in je delno zatrejo hypermethylation DNK v PK, kar pomeni, da lahko miR-10a služi kot potencialno diagnostično ali terapevtsko tarčo GC

Navedba. Jia H, Zhang z, Zou D, Wang B, Yan Y, luo M, et al. Je (2014) MicroRNA-10a Dol urejeno s DNA metilacije in funkcije kot zaviralnih v želodcu rakavih celic. PLoS ONE 9 (1): e88057. doi: 10,1371 /journal.pone.0088057

Urednik: Jorg Tost, CEA - Institut de Genomique, Francija

Prejeto: 26. januarja 2013; Sprejeto: 4. januar 2014; Objavljeno: 31 januar 2014

Copyright: © 2014 Jia et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprta s sredstvi iz državnega Natural Science Foundation Kitajske (2011, 91129716, do JY), v Pekingu občinskega Science & Tehnologija Komisije (2010B071, da J.Y.), Inštitut za osnovne medicinske vede, kitajske akademije medicinskih znanosti (2009RC03, da J.Y .; 2010PYB06, da J.Y .; 2012G04, da J.Y.). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka v svetu [1]. Doslej so poročali o nekaj zaviralnih genov in s tem povezane s tumorjem geni v GC. Čeprav so bile obsežne raziskave, opravljene za ugotavljanje genetskih poti in mehanizme, ki sodelujejo pri razvoju raka, so bila malo izboljšave na zgodnje odkrivanje raka. MicroRNAs (miRNAs) so endogeni majhne RNA nekodiranih, ki so bile opredeljene kot posttranscriptional regulatorji genske ekspresije. Prejšnje študije so pokazale, da miRNAs izvajajo svoje naloge prek nepopolno osnovno-seznanjanje z 3'untranslated regiji (3'UTR) tarčnih mRNA [2] in miRNAs so obširno analizirane v okviru regulacije celičnega cikla, diferenciacijo, razvoj in apoptoze [3] [4]. Bilančni dokazi kažejo, da so miRNAs deregulacije v različnih bolezni, še posebej raka. Na primer, miR-216B je izrazito navzdol urejeno v nazofaringealnega karcinoma [4]; miR-340 je deregulirati pri raku dojke in lahko zavirajo prsi migracije rakavih celic in invazijo [5]; in miR-31 je bila opredeljena kot onkogen v požiralniku celic skvamozno [6]. Skupaj so miRNAs opredeljena kot potencialne kandidatke za nove diagnostične biomarkerjev ali terapevtskih ciljev raka.

MIR-10a, so poročali, da igrajo pomembno vlogo pri nastanku in razvoju različnih človeških rakavih obolenj. Na primer, miR-10a deregulacijo v glavi in ​​vratu ploščatoceličnega karcinomov in tudi v hepatocelularnega karcinoma [7], [8]. Poleg tega človeškega raka na materničnem vratu, miR-10a služi kot onkogen ga regulacijo CHL1 [9]; navzdol ureditev pokoj-10a v kronične mieloične levkemije spodbuja CD34 ^{+ celic orožja [10]. Vendar funkcijo miR-10a in mehanizem osnovni želodca karcinogeneze ostaja nejasno. V tej študiji smo natančno izmerili izražanje pokoj-10a pri 100 bolnikih z rakom želodca in raziskovali vloge pokoj-10a v želodčnih rakavih celic. Ugotovili smo, da je bil miR-10a navzdol urejeno v GC tkivih in uveljavlja izraz pokoj-10a zatrta proliferacije, migracije in invazije GC celic.}

epigenetske spremembe, vključno hypermethylation DNK, histon deacetiliranja in histon metilacije so tesno povezano z genskim deaktivacijo. Promotor hypermethylation je mislil, da je alternativni mehanizem za down-regulacijo zaviralnih genov v človeških raka [11]. MiRNAs katerih izraz je zatrta s metilacije DNA, so poročali v nekaj človeških raka [12] - [14]. Da bi še dodatno raziskati, ali navzdol-ureditev pokoj-10a izvira iz hypermethylation za genomske regije gorvodno od miR-10a
, smo analizirali metilacije DNA otoka CpG v promotorja regiji miR- 10a
pri 55 bolnikih, GC in ugotovili, da bi lahko zaradi hypermethylation CpG zaporedij v svoji promotorja navzdol ureditev pokoj-10a v GC tkivih.

materiali in metode

Bolniki in osebki

človekove klinični vzorci so bili zbrani iz kirurške vzorcev od 100 bolnikov z GC na Cancer Institute in bolnišnice, kitajske akademije medicinskih znanosti, Splošna bolnišnica Ljudske osvobodilne vojske in Cancer Hospital Shanxi. Ustrezne sosednje non-neoplastične tkiva iz makroskopski robu tumorja smo izolirali ob istem času in uporabimo kot kontrole. Tumorji so potekali po TNM (2010) merila za razvrščanje Unije za mednarodni nadzor raka (UICC). Vsi vzorci so bili razdeljeni v dva dela in takoj smo hitro zmrznili v tekočem dušiku in shranili pri -80 ° C, dokler ekstrakcijo RNA. Štiri želodca rakave celične linije (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 in MKN-45), so bili vsi hranijo v našem laboratoriju in vzdržujejo v DMEM ali 1640 z 10% FBS. Raziskovalni etiko Klinični Inštituta za osnovne medicinske vede, kitajske akademije medicinskih znanosti odobrila raziskovalnih protokolov in pisno privolitev so bile pridobljene od udeležencev.

RNA Pridobivanje, cDNA Sinteza mRNA in miRNAs, in v realnem čas PCR

Total RNA je bila vzeta iz želodca tkiv rakom in celic, ki uporabljajo TRIzola reagenta (Invitrogen, CA, ZDA) po navodilih proizvajalca. RNA smo kvantificirali z absorbanco pri 260 nm in cDNA sintetiziramo z M-MLV reverzne transkriptaze (Invitrogen) od 2 ug celotne RNA. Oligo (dT) 18 smo uporabili kot RT primerji za reverzno transkripcijo mRNA. Steblo-zanka RT-primer je bil uporabljen za reverzno transkripcijo miRNA. Kvantitativne RT-PCR smo izvedli v Bio-Rad CFX96 realnem času PCR sistema (Bio-Rad, CA, ZDA) z uporabo SYBR krmil Ex Taq kit (Takara, Dalian, Kitajska) ali TaqMan sond (Applied Biosystems, Foster City, CA , ZDA) po navodilih proizvajalca. Pogoji PCR so bili naslednji: 95 ° C za 30 sekund, čemur sledi 40 ciklov 95 ° C za 5 sekund in 60 ° C za 34 sekund. Za mRNA, so bili podatki normalizirali z endogeno kontrolo GAPDH. Za miRNAs je U6 snRNA uporabljen kot endogeni kontrolo. Relativna količina miR-10a je bila izmerjena z -ΔΔCT metodo 2 ^{. Primer sekvence so predstavljene v tabeli S1.}

DNK Pridobivanje, metilacije specifične PCR (MSP) in Kvantitativne metilacije specifične PCR (qMSP)

Visoka molekulska masa genomske DNA je bila vzeta iz želodca raka tkiva s pomočjo DNK ekstrakcijo Kit (Biomed, BJ, Kitajska), v skladu z navodili proizvajalca. Bisulfit sprememba je bila izvedena z uporabo Epitect bisulfit zaporedja kit (Qiagen, Hilden, Nemčija) v skladu s protokolom. Do 2 ug genomske DNA smo uporabili kot izhodni material. Normalna limfocit DNA obdelali z CpG metiltransferazo (M.SssI) (NEB, MA, ZDA) smo uporabili kot pozitivno kontrolo in reakcijski sistem brez predlogo smo uporabili kot slepe kontrole.

natrijevega bisulfate- obdelano DNA smo pomnožili z Bio-Rad CFX96 PCR v realnem času sistem (Bio-Rad) z KAPA SYBR® FAST qPCR kompleti (KAPA Biosystems) z naslednjimi pogoji: 95 ° C za 5 minut, čemur sledi 40 ciklov 95 ° C za 30 sekund, 54 ° C za 30 sekund in 72 ° C za 30 sekund in končno podaljšanje pri 72 ° C za 10 minut. GAPDH smo uporabili kot notranje kontrole. qMSP reakcije smo izvajali v treh izvodih. Raven metilacije v vzorcu je bila ocenjena kot Lu L et al. opisana [15]. Primer sekvence so predstavljene v tabeli S1.

5-aza-2'-deoxyazacytidine Zdravljenje

želodcu rakave celice smo zasejali v 10 cm posode (1 x 10 ^{6 celic na posodo) en dan pred zdravljenja odvisnosti od drog. Celice smo obdelali z 1 uM 5-aza-2'-deoxyazacytidine (5-AZA) (Sigma, MO, ZDA) vsakih 24 ur 3 dni.}

celične kulture in Oligonukleotidi Transfekcija

človeški želodca celične linije HGC-27, SGC-7901 in MKN-45 smo kultivirali v RPMI 1640 (Gibco, BRL, Velika Britanija), mediji dopolni z 10% fetalnega govejega seruma in MGC-803 se je ohranila v DMEM (Gipco, BRL , Velika Britanija), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma. Te celične linije so se ohranili pri 37 ° C v navlaženem zraku, ki vsebuje 5% CO _2.

MIR-10a posnemajo, so pehanje posnemati, siHOXA1 siRNA in Utrka siRNA sintetizirajo GenePharma (Šanghaj, Kitajska ) in transfektiramo v celice v končni koncentraciji 50 nmol /L z uporabo DharmaFECT1 Reagent (Dharmacon, TX, ZDA).

Cell orožja in Colony Formation Vsebnost

The mimic- ali siRNA- transficirane celice smo zasejali v 96-vdolbinami (5000 celic /jamico). Celice inkubiramo pri 10% CCK-8 (DOJINDO, Japonska) pri 37 ° C, dokler se pojavili vizualni barva konverzije. Stopnje širjenja smo določili pri 0, 12, 24, 48, 72, 96 ur po transfekciji.

shematični-transfektiramo celice tripsiniziramo in replated na 200 celic na jamico v 6 vdolbinami in vzdržuje leta 1640 z 10% FBS. Celice smo gojili 7 dni, določen z metanolom in obarvamo z 0,1% kristal vijoličnim v 20% metanola v teku 15 minut.

Cell apoptoza Vsebnost

apoptoze teste smo izvedli v HGC-27 in celične linije MGC-803 z uporabo aneksin v-FITC Apoptoza Detection kit I (BD Biosciences) po protokolu proizvajalca in nato analizirajo s Calibur pretočnim citometrom (Becton Dickinson).

Cell migracije in Invasion Testi

A-celjenje ran test je bil izveden za oceno migracijo celic. Umetni rana je bila ustanovljena zraščene celic enoplastni je brez FBS z uporabo 200 ul vrh pipete 24 ur po transfekciji. Za vizualizacijo selijo celice in celjenje ran, so bile slike, sprejeti na 0, 12, 24, 36, 48, 60 ur.
Celice

Za transwell invazijo testih so, HGC-27 in MGC-803 suspendiramo v 0,2 ml RPMI 1640 ali DMEM brez FBS so bili dani na zgornji komori vsak vložek (Millipore, MA, ZDA), predhodno prevlečeni z 40 ul 1 mg /ml Študiie. Spodnja komora smo napolnili s 600 ul v RPMI 1640 ali DMEM mediju z 10% FBS kot prehranskega atraktant. 24 ur kasneje so bili invasion celice vezane na spodnji površini določen z 20% metanola in obarvajo z maj-Gruwald-Giemsa (MGG). Membrane smo nato izrezljane in vgrajeni pod lažnimi zdrsi. Celice v treh različnih vidnih polj preštejemo in vse teste smo izvedli v treh izvodih.

Western blot

Western analizo blot smo izvedli po standardnih metodah. Proteine ​​smo ločili z 10% SDS-PAGE in nato prenese na PVDF membrane (Amersham, Buckinghamshire, UK). Membrane smo preko noči blokirali s 5% nemastnega mleka posušimo in inkubirali 2 uri pri anti-HOXA1 protitelesa (Bioworld, MN, USA) na 1:500 razredčitvah ali anti-GAPDH protitelesa (Proteintech, Chicago, ZDA), pri 1: 50.000 razredčitve. Po spiranju s TBST (10 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, in 0,1% Tween20), smo membrane inkubirali 2 uri s sekundarnih protiteles (zsgb-bio, Peking, Kitajska).

Statistika

Vsak poskus smo ponovili vsaj trikrat. Test študenta t (dva repa) in 2 preizkus x ^{so bile izvedene, in statistična značilnost je bila opredeljena kot alfa = 0,05 (dveh strani). Sredstva ± SD so prikazani na slikah.}

Rezultati

miR-10a Down urejeno želodčnega raka celic

pregledanih izraz zrelega pokoj-10a v štiri človeške želodčne rakave celične linije (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 in MKN-45) in humana želodca epitelija celična linija (GES). Stopnja izraz pokoj-10a v GES je pomembno višja od ravni v dveh želodčnega raka celičnih linijah (HGC-27 in MGC-803) in je bil non-bistveno vendar observably višja od ravni v drugih dveh želodčnega raka celičnih linijah (MKN-45 in GSS-7901) (sl. 1a). Ti podatki kažejo, da je lahko navzdol ureditev pokoj-10a pomembni za nastanek in razvoj GC.

Izražanje pokoj-10a v Klinični GC bolnike in njihove korelacije z Clinicopathological značilnosti

Da bi še dodatno preučiti odnos med pokoj-10a in GC geneze, smo zaznali izražanje pokoj-10a v 100 kliničnih bolnikih s TaqMan sondo izhaja PCR v realnem času, kot je opisano zgoraj. 100 parov vzorcev GC izraz miR-10a je navzdol urejeno v 58 primerih (58/100, 58%) v primerjavi z ustreznimi sosednjih tkiv (sl. 1b). Skupni izraz miR-10a bil navzdol regulirano v GC tkivih v primerjavi s sosednjimi tkivi, čeprav navzdol ureditev ni bila statistično pomembna (p = 0,148, paru t-test, dvo-tailed) (sl. 1c).

da bi ocenili povezavo med izražanjem pokoj-10a in clinicopathological značilnosti, bolniki so bili razdeljeni v dve skupini glede na relativno izražanje pokoj-10a v tumorskih tkivih po vnaprej objavljenem dokumentu [16] . Kot je prikazano v tabeli S2, so ugotovili statistično značilno povezavo med obema TNM skupin. Obstaja več bolnikov, ki so v I + II fazo v skupini z nižjo izražanje pokoj-10a v svojih GC tkivih. To razmerje je pokazala, da lahko miR-10a bolj pomembno v začetku karcinogeneze raka. Vendar pa so naši podatki pokazali, da je raven izražanja miR-10a korelacije s starostjo, spolom, histološki tip tumorja odstotek, vensko invazije, živcev invazije, položaj, BORRMANN tipkanje, stopnji PT, stopnjo PN ali fazi ure.

miR-10a zavira proliferacijo celic in vitro

Če želite raziskati vlogo pokoj-10a v želodcu rakotvornosti smo transfektirali miR-10a posnemajo v linij GC celičnih HGC-27 in MGC-803, ki sta razstavljena visoko učinkovitost transfekcije (sl. 2a). Kot je razvidno iz CCK 8-testih rast 0, 1, 2, 3 in 4 dni po posnemajo transfekciji čezmernim miR-10a zmanjšano celično proliferacijo v obeh celičnih linijah, medtem ko je imel pehanje posnema ne vpliva na proliferacijo celic v primerjavi z nezdravljenimi celicami (sl. 2b). Nato so se investicije v naselje teste izvedli za oceno proliferativni sposobnost mimičnih-transfekcije HGC-27 in MGC-803 celic in je pokazala, da prekomerno miR-10a v HGC-27 celic, zmanjšano nastajanje kolonij (sl. 2c). Vendar nobena od celic MGC-803 tvorijo kolonije, ki bi se lahko zaradi relativno šibke zavezanosti celicah. Za nadaljnjo obravnavo učinek pokoj-10a za celične apoptoze v dveh GC celičnih linij, je bil predčasno apoptoza za MGC-803 in HGC-27 celic preučila aneksin barvanjem po miR-10a posnemajo transfekciji. Kot je bilo pričakovati, malo zgodaj apoptotičnih celic (20,8% v HGC-27 in 22,9% v MGC-803) so bile odkrite v mimičnih obdelani celic pehanje, medtem miR-10a posnema zdravljenje povečala delež zgodnjih apoptotskih celic (28,4% v HGC -27 in 27,7% na MGC-803) (sl. 2d). Kolektivno, smo ugotovili, da bi lahko miR-10a zavre celično preživetje v GC celic, tako da spodbujajo apoptozo celic.

miR-10a Zavira Cell migracije in Invasion in vitro

Mi še oceniti učinke pokoj-10a na celični migraciji in invazije, ki so ključni dejavniki malignega napredovanja in metastaz. Sposobnost migracije je bila dokazana s celjenje ran /praske testu v HGC-27 in MGC-803 celic. Oba celičnih linij, ki so se zdravili z miR-10a posnemajo so izrazito manj selivke, kot so se zdravili z nadzorom žoga ali neobdelanih celic pri 12, 24 in 36 ur po praskanju (sl. 3a). Poleg tega smo izvedli Matrigel celično invazijo testa in obarvajo z vdrli celice za merjenje smernih invazijo sposobnosti celic po ectopically izražanje MIR-10a v obeh celičnih linijah. Invazivnosti celic transficiranih z miR-10a posnemajo je dramatično zmanjšala v primerjavi s kontrolo žoga in nezdravljenimi celicami (sl. 3b). Ti rezultati pokazali, da miR-10a igral pomembno vlogo pri urejanju migracije celic in invazivnosti v GC in predlagal, da bi lahko navzdol ureditev pokoj-10a prispevajo k tumorske metastaze želodčnega rakotvornost.

miR-10a cilji HOXA1 v GC

MiRNAs opravljanje bioloških funkcij z negativno urejanje svojih ciljnih genov. Ugotovljeno je bilo, da je onkogena HOXA1 neposredna tarča miR-10a v megakariocitopoeze in humanega raka pankreasa [17] - [19]. Kot napovedujejo PicTar, je bila komplementarna zaporedja med ima-pokoj-10a in HOXA1 3'UTR (sl. 4a). Vendar pa ni znano, ali miR-10a ureja celično proliferacijo, migracijo in invazijo v GC z usmerjanjem HOXA1. Da bi razjasnili regulatorni odnos, smo najprej odkrili protein in ravni mRNA HOXA1 v HGC-27 in MGC-803 celic miR-10a mimičnih-transfekcije uporabo western-blot in RT-PCR. Opazili smo očiten padec v stopnji HOXA1 proteina v prisotnosti miR-10a posnema primerjavi s kontrolo žoga v dveh celicah (sl. 4b). Raven mRNA HOXA1 je tudi navzdol urejeno v HGC-27 celic, kar kaže, da miR-10a zavira HOXA1 izražanje ponižujočega mRNA za HOXA1 v HGC-27 celic. Vendar pa je bilo malo spremembe v ravni mRNA za HOXA1 v MGC-803 celic, kar kaže, da bi miR-10a navzdol urediti HOXA1 izražanje skozi translacijskih represijo, vendar ne mRNA dekolte v MGC-803 celic (si. 4c). Poleg tega smo analizirali raven beljakovin za HOXA1 pri 24 bolnikih GC. Med temi vzorcev je bilo 12 bolnikov, pri katerih je bila miR-10a navzdol urejeni v svojih GC tkivih in 12 bolnikov, pri katerih je bila miR-10a up-urejeni v svojih GC tkivih (sl. 4d). HOXA1 je up-urejeno v večini bolnikov, pri katerih je bila miR-10a navzdol urejene v svojih GC tkivih. Podobno HOXA1 je navzdol urejeno v večini bolnikov, pri katerih je bila miR-10a up-urejena v svojih GC tkivih. Primerjava ravni miR-10a in ravni beljakovin HOXA1 v PK pokazala obratno korelacijo med pokoj-10a in HOXA1 (r ^{2 = 0,1839, P = 0,0366) (Sl. 4e). Kolektivno, te ugotovitve predloži trdne dokaze, da je HOXA1 neposreden cilj pokoj-10a v PK. Prav tako smo odkrili raven mRNA za HOXA1 pri teh bolnikih in ugotovili, da je raven mRNA HOXA1 pri več bolnikih, ki ni v skladu s stopnjo beljakovin, ki je pokazala, da miR-10a uravnava izražanje svojega cilja, HOXA1 s translacijskih represijo, vendar ne mRNA cepitev pri teh bolnikih (sl. S1).}

Knock navzdol od HOXA1 Zatrto želodca Cancer Cell rast in migracije vitro

Naprej, smo vprašali, ali HOXA1 igral pomembno vloge v želodčnih rakavih celic. Preučiti vlogo HOXA1 v PK, smo podrli endogenega HOXA1 v HGC-27 in celičnih linij MGC-803 zazna učinek na celično proliferacijo in migracijo celic. Opazili smo, da HOXA1 represija zaviral razmnoževanje celic in migracije HGC-27 in MGC-803 celic, v tem zaporedju (sl. 5a in 5b). Ti rezultati kažejo, da miR-10a deluje kot zaviralnih v GC celic z ukinitvijo HOXA1 izražanja.

miR-10a Epigenetically Tihi v GC celičnih linijah

Za pojasnitev, ali nizko izražanje miR- 10a v GC tkiva je posledica epigenetical sprememb, smo obdelan HGC-27, MGC-803, SGC-7901 in MKN 45 celic z DNA metilacije inhibitor 5-aza. Izraz miR-10a je navzgor regulirana v HGC-27, SGC-7901 in MKN-45 celice, ko so bili zdravljeni z AZA, kar kaže, da bi se izraz miR-10a zatrta teh celic z DNA metilacijo (sl. 6a).

za študij ureditev pokoj-10a, s metilacije DNA, smo iskali podatkovno bazo človeškega genoma za prisotnost CpG otokov okoli pokoj-10a uporabo "CpG Otok iskalec" programsko opremo, in opredelila otok CpG nahaja 1638 bp gorvodno od miR-10a
(sl. 6b). Poleg tega smo odkrili status DNA metilacijskega uporabo qMSP in PPN v štirih GC celičnih linijah. Otok CpG je hypermethylated v vseh štirih GC celičnih linijah, kar je skladno z nizko ekspresijo miR-10a teh GC celičnih linijah. Ko so GC celične linije zdravljenih s 5-aza-CdR, se je zmanjšala stopnja metilacije v primerjavi s skupino DMSO (sl. 6c).

navzdol, ureditev pokoj-10a v GC bolnikov je bila posledica Hypermethylation od njenih CPG otokov

smo podrobneje preučiti metilacijskega statusa otoka CpG v GC tkiva in sosednjih zdravih tkivih 55 naključno izbranih primerih skozi qMSP. Raven metilacije v 55 GC tkiva višja od tiste v sosednjih brez rakavih tkiv (p < 0,01), ki je skladna z nizko ekspresijo miR-10a v GC tkiva (slika 6D.). Poleg tega smo naključno izbrali dva para vzorcev, na katerih bi analizirali raven DNA metilacijskega s Bisulfatna zaporedja PCR (BSP), da bi preverili pravilnost PPN. Rezultati BSP so skladen z qMSP in so bili dopolnjeni, kot sl. S2. Poleg tega je stopnja metiliranje miR-10a (M /M + U) pri teh bolnikih GC razstavljen inverzno korelacijo z izražanjem miR-10a (r ^{2 = 0,1956, P = 0,0006) (Sl. 6e). Prav tako smo odkrili raven metilacijski pokoj-10a v normalnih želodčnih celic in želodčnega raka celičnih linijah. Rezultati qMSP je pokazala, da je bil otok CpG delno methylated v ges celicah, vendar zelo hypermethylated v dveh želodčnega raka celičnih linijah HGC-27 in MGC-803, ki je prav tako predlagal, da je otok CpG gorvodno od miR-10a
bil hypermethylated v GC celicah (sl. 6f). Kolektivno, te ugotovitve predloži trdne dokaze, da je bil izraz pokoj-10a urejena s metilacije DNA pri teh bolnikih GC. Navzdol-ureditev pokoj-10a pri bolnikih GC je posledica hypermethylation svojih CpG otokov.}

Pogovor

V tej študiji smo ugotovili, da je bil miR-10a navzdol urejeno v človeškem želodčni rak delno zaradi promotorja DNK hypermethylation. Nadaljnje raziskave so pokazale, da prekomerno miR-10a zatreti celično proliferacijo, migracijo in invazivnosti v vrsticah na GC celičnih HGC-27 in MGC-803, po možnosti z ciljanje onkogensko HOXA1.

, so poročali MiRNAs urediti različne razvojne in celične procese, in so vpleteni v številnih človeških bolezni, zlasti pri raku. MiRNAs zatreti izražanje genov z usmerjanjem mRNK z vezavo na svojih 3 'UTRs. Te miRNAs kažejo regulatorne vlogo v patogenezi raka in so vpleteni v celične proliferacije, diferenciacije, apoptoze, metastaze in odpornosti [4], [20]. MIR-10a igra pomembno vlogo v različnih vrst raka, vključno z rakom jetrnih [9], raka trebušne slinavke [17], akutno mieloično levkemijo [21] in kronične mieloične levkemije [10]. Nenormalno izraz pokoj-10a je verjetno, da igrajo ključno vlogo v maligno transformacijo in je glede na tkivno specifičnost. Njena deregulacija lahko prispevajo k razvoju želodčne novotvorb.

Potrditev izražanja pokoj-10a v kliničnih vzorcih pokazali, da je bila miR-10a navzdol urejeno v 58 (58/100, 58%) GC tkiv v primerjavi s sosednjimi tkivi. Vendar Weidong Chen et al.
Raziskovali izražanje pokoj-10a, v 33 primerih GC in ugotovil, da je bil miR-10a izraz v GC tkivih višja kot v sosednjih tkivih [22]. Neskladnost je lahko posledica različnih količine kliničnih vzorcev in indistinctive spremembo pokoj-10a v GC tkivih. Naši podatki bi morali biti bolj biološko zastopnik s zaradi večje število kliničnih vzorcev. Samo večji del, vendar ne vseh bolnikov GC imajo navzdol regulacijo miR-10a v svojih GC tkivih čeprav sta miR-10a deluje kot supresorski tumorja na želodcu rakavih celic. To je lahko zaradi ločenega mehanizma geneze GC v različnih posameznikov. Morda nekateri drugi pomembni geni ali faktorjev, ki so odgovorni za tumorigeneze pri bolnikih GC v katerih GC tkiva miR-10a je ostalo nespremenjeno ali reguliran. Poleg tega je izraz MIR-10a razstavljene ni povezan z clinicopathological značilnostmi, razen za stopnjo TNM, kar pomeni, da bi miR-10a igrajo delno vlogo pri tumorigeneze predvsem v zgodnjih fazah.

Veliko miRNAs ugotovljeno, da so v korelaciji z tumorigeneze, vendar pa je osnovni molekularni mehanizem, ostaja nejasno. V našem poročilu, funkcionalna analiza pokoj-10a, vključno s celično proliferacijo, migracijo in invazijo testi, nam je pomagal bolje razumeti prispevek pokoj-10a do želodca rakotvornost. Transfekciji miR-10a posnemajo proliferacije močno zaviral celic, migracije in invazivnosti v GC celicah, kar pomeni, da bi zatiranje miR-10a spodbujanje napredovanja tumorja v želodcu rakotvornost. Potrebni so Nadaljnje študije za pojasnitev tega mehanizma.

V človeškem genomu, miR-10a
se nahaja gorvodno od HOXB4
. MIR-10b
, drugemu članu družine miR-10, ki se nahaja v začetnih fazah HOXD4
. Ta dva člana sta med seboj razlikujejo le v eni bazi in imajo enake semen sekvence, kar kaže na njihove podobne funkcije. Kwoneel Kim [12] je poročal, da ima miR-10b vlogo v GC kot zaviralnih. V naši raziskavi smo pokazali, da je prekomerno miR-10a inhibira tumorsko proliferacijo, migracijo in invazivnosti, kar je podobno funkcijo miR-10b v GC. HOX geni so zelo ohranjeni transkripcijske faktorje, ki so odločilni za pravilno anterior-posterior vzorčenja od telesnih osi [23]. HOXA1 je bila potrjena kot neposredni cilj pokoj-10a v človeškega raka trebušne slinavke [17] in megakariocitopoeze [18]. Opazili smo tudi, da je prekomerno miR-10a znižane ravni HOXA1 beljakovin v dveh GC celičnih linijah, kar kaže, da HOXA1 je neposreden cilj pokoj-10a raka želodca.

so epigenetske spremembe izkazalo za ključni mediatorji temelji navzdol ureditev miRNA izražanja in kažejo tesno povezavo z rakotvornost [12], [13], [24]. Naši podatki so pokazali, da hypermethylation otoka CpG gorvodno od miR-10a
pripeljala do zmanjšanjem števila pokoj-10a v celičnih linijah GC in bolnikov GC. Poleg tega je zdravljenje AZA povečala MIR-10a v celičnih linijah GC. Na podlagi naših ugotovitev lahko status metilacija pokoj-10a zaposleni kot potencialni biomarker v PK.

Na kratko, ta študija poroča, da miR-10a deluje kot supresorski tumorja v GC celic in je deloma navzdol -regulated s hypermethylation DNK. Prisilno izraz pokoj-10a zavira celično proliferacijo, migracijo in invazivnost in vitro
. Stanje metiliranje in nivo izražanja miR-10a lahko služijo kot potencialne biomarkerje GC in miR-10a lahko potencialno terapevtsko vrednost pri zdravljenju raka. Nadaljnje študije o epigenetske ureditvi miRNA izražanja so potrebni, in ureditev miRNA izražanja epigenetske zdravil lahko zagotovi nov terapevtski strategijo za želodčne in druge človekove raka.

Podpora Informacije
Slika S1.
Raven mRNA HOXA1 pri bolnikih z GC 24 je bila odkrita s QRT-PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0088057.s001
(IOD)
Slika S2.
BSP analizi metilacijskega statusa pri dveh bolnikih GC. Napolnjena in odprti krogi predstavljajo metilira in nemetiliran strani CpG oziroma
doi:. 10,1371 /journal.pone.0088057.s002
(IOD)
Tabela S1.
Na primer uporabimo v tem članku
doi:. 10,1371 /journal.pone.0088057.s003
(XLSX)
Tabela S2.
zveza med izražanjem pokoj-10a z clinicopathological funkcij pri bolnikih z rakom želodca
DOI:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s004
(XLSX)

Priznanja

avtorji hvala Hualu Zhao iz IBMS (inštitut za osnovne medicinske vede), PUMC (Peking Union Medical College), za tehnično pomoč in dr Hongkai Zhang iz bolnišnice Jiuxianqiao za njeno pomoč pri imunohistokemiji.

• Plos ONE: Labor porabe virov za endoskopske želodca raka Screening v osnovnem Nastavitve japonskih previdno: Delo Vzorčenje Study
• Plos ONE: genski polimorfizmi v Micrornas v Helicobacter pylori, povzročena High Risk atrofični gastritis in želodca Cancer