PLoS ONE: MicroRNA-10a herunterreguliert von DNA-Methylierungs-und Funktionen als Tumorsuppressor in Magenkrebs Cells

Abstrakt

Hintergrund

MicroRNAs wirken als posttranskritionelle Regulatoren der Genexpression in vielen biologische Prozesse. Ihre Deregulierungen treten häufig bei Magenkrebs (GC). Obwohl die DNA-Methylierung ein wichtiger Mechanismus für die microRNA Deregulierung in der Krebstherapie darstellt, bleibt dieses Feld weitgehend unerforscht.

Methodik /wesentlichen Ergebnisse

Gesamt-RNA wurde aus den Geweben von 100 Patienten mit GC extrahiert und vier Magen Krebszelllinien. Die Expression von miR-10a wurden durch real-time PCR mit spezifischen TaqMan-Sonden bestimmt. Außerdem wurde eine funktionelle Analyse von miR-10a bei der Regulierung der Zellproliferation, Migration und Invasion durchgeführt. Anschließend wurde eine quantitative methylierungsspezifische PCR (QMSP) verwendet, um die DNA-Methylierungsstatus in den CpG-Inseln zu erkennen, vor miR-10a
. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass die Expression von miR-10a in GC-Zellen war niedriger als die in normalen Zellen, die dem hypermethylation der CpG Inseln aufgrund wurde stromaufwärts von miR-10a
. Wir validiert auch die etwas niedriger Expression von miR-10a in GC Gewebe als ihre benachbarten nicht-neoplastischem Gewebe in 100 GC Patienten und bestätigte die Hypermethylierung von CpG-Inseln vor miR-10a
bei einigen Patienten. Des Weiteren Wiedereinführung von miR-10a in GC-Zellen konnte die Zellproliferation, Migration und Invasion zu verhindern. Bioinformatischen und angegeben Immunoblot-Analyse, dass die Tumorsuppressor-Rollen von miR-10a in GC Zellen durch Targeting HOXA1 möglicherweise waren.

Schlussfolgerungen /Bedeutung

Unsere Daten zeigen, dass miR-10a wirkt als Tumorsuppressor in GC-Zellen und wird teilweise durch DNA-Hypermethylierung in GC zum Schweigen gebracht, was darauf hindeutet, dass miR-10a als mögliche diagnostische oder therapeutische Ziel von GC dienen kann

Citation:. Jia H, Zhang Z, Zou D, Wang B, Yan Y, M Luo, et al. (2014) MicroRNA-10a herunterreguliert von DNA-Methylierungs-und Funktionen als Tumorsuppressor in Magenkrebszellen. PLoS ONE 9 (1): e88057. doi: 10.1371 /journal.pone.0088057

Editor: Jorg Tost, CEA - Institut de Genomique, Frankreich

Received: 26. Januar 2013 beginnen; Akzeptiert: 4. Januar 2014; Veröffentlicht: 31. Januar 2014

Copyright: © 2014 Jia et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (2011, 91129716, zu JY), der Beijing Municipal Wissenschaft &unterstützt; Technologie Kommission (2010B071, bis J. Y.), Institut für Medizinische Grundlagenwissenschaften, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften (2009RC03, zu J.Y .; 2010PYB06, zu J.Y .; 2012G04, zu J. Y.). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist die zweithäufigste Todesursache durch Krebs in der Welt [1]. Bisher Suppressor wenige Tumorgenen und Tumor-verwandten Gene wurden in GC berichtet. Obwohl umfangreiche Studien durchgeführt wurden, in der Entwicklung von Krebs, einige Verbesserungen an der Früherkennung von Krebs gemacht wurden beteiligt genetischen Wege und Mechanismen zu identifizieren. MicroRNAs (miRNAs) sind endogene kleine nicht-kodierenden RNAs, die als posttranskriptionelle Regulatoren der Genexpression identifiziert. Frühere Studien haben gezeigt, dass miRNAs ihre Funktionen durch unvollkommene Basenpaarung mit der 3'-untranslatierte Region ausüben (3'UTR) des Ziel-mRNAs [2] und miRNAs wurden im Zusammenhang mit der Regulation des Zellzyklus, der Differenzierung, Entwicklung und Apoptose ausgiebig studiert [3], [4]. Gesammelte Daten zeigen, dass miRNAs bei verschiedenen Erkrankungen dereguliert, vor allem in der Krebstherapie. Zum Beispiel ist miR-216b deutlich in Nasopharynxkarzinom herunterreguliert [4]; miR-340 ist bei Brustkrebs dereguliert und kann Brustkrebszellmigration und Invasion [5] hemmen; und miR-31 wurde als ein Onkogen in Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus identifiziert [6]. Zusammengenommen wurden als potenzielle Kandidaten für neuartige diagnostische Biomarker oder therapeutische Ziele von Krebs identifiziert miRNAs.

miR-10a wurde berichtet, eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Entwicklung von einer Vielzahl von Krebserkrankungen des Menschen zu spielen. Zum Beispiel ist miR-10a in Kopf und Hals Plattenepithelkarzinome dereguliert und auch in hepatozellulären Karzinoms [7], [8]. Weiterhin in humanen Zervixkarzinom dient miR-10a als Onkogen durch CHL1 Regulieren [9]; Herunterregulation von miR-10a in chronisch-myeloischer Leukämie fördert CD34 ^{+ Zellen-Proliferation [10]. Allerdings bleiben die Funktion von miR-10a und der Mechanismus zugrunde liegenden Magen-Krebsentstehung unklar. In dieser Studie maßen wir genau die Expression von miR-10a in 100 Patienten mit Magenkrebs und untersucht die Rolle von miR-10a in Magenkrebszellen. Wir fanden, dass miR-10a wurde in GC Gewebe herunterreguliert und erzwungene Expression von miR-10a unterdrückt die Proliferation, Migration und Invasion von GC-Zellen.}

Epigenetische Modifikationen einschließlich DNA-Hypermethylierung, Histondeacetylierung und Histon-Methylierung sind eng mit Gen-Inaktivierung verbunden. Promoter hypermethylation wird angenommen, einen alternativen Mechanismus sein, um Tumor-Suppressor-Genen in menschlichen Krebsen-down regulieren [11]. MiRNAs dessen Expression durch DNA-Methylierung unterdrückt haben in einigen menschlichen Krebsarten berichtet [12] - [14]. Weiter zu untersuchen, ob die Herunterregulierung von miR-10a stammt aus der hypermethylation der genomischen Region stromaufwärts von miR-10a
wir die DNA-Methylierung der CpG-Insel in der Promotorregion von analysiert MIR- 10a
in 55 GC-Patienten und fanden heraus, dass die Herunterregulierung von miR-10a in GC Gewebe könnte in seinem Promotor auf die Hypermethylierung von CpG-Sequenzen fällig.

Materialien und Methoden

Patienten und Proben

Menschliche klinische Proben wurden aus chirurgischen Proben von 100 Patienten mit GC bei Cancer Institute and Hospital, chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften, Allgemeines Krankenhaus der Volksbefreiungsarmee und Shanxi Cancer Hospital gesammelt. Die entsprechenden benachbarten nicht-neoplastische Gewebe aus der makroskopische Tumorrand wurden als Kontrollen zugleich isoliert und verwendet. Die Tumore wurden nach dem TNM (2010) die Klassifizierungskriterien der Union für International Cancer Control (UICC) in Szene gesetzt. Alle Proben wurden in zwei Teile aufgeteilt und wurden sofort in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C bis zur RNA-Extraktion schockgefroren. Vier Magenkrebszelllinien (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 und MKN-45) waren alle in unserem Labor erhalten und in DMEM oder 1640 mit 10% FBS gehalten. Das Clinical Research Ethics Committee des Instituts für Medizinische Grundlagenwissenschaften, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften hat den Forschungsprotokollen und eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von den Teilnehmern erhalten.

RNA-Extraktion, cDNA Synthese von mRNAs und miRNAs und Real- time PCR Assays

Gesamt-RNA wurde aus Magenkrebsgewebe extrahiert und Zellen unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Invitrogen, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. RNA wurde bei 260 nm durch Absorption quantifiziert und cDNA wurde aus 2 ug Gesamt-RNA durch M-MLV Reverse Transkriptase (Invitrogen) synthetisiert. Oligo (dT) 18 wurde als RT-Primer für die reverse Transkription von mRNA verwendet. Ein Stamm-Schleifen RT-Primer wurde für die reverse Transkription von miRNA verwendet. Quantitative RT-PCR wurde in einem Bio-Rad CFX96 real-time PCR-System (Bio-Rad, CA, USA) mit SYBR Premix Ex Taq-Kit (Takara, Dalian, China) oder TaqMan-Sonden (Applied Biosystems, Foster City, CA durchgeführt USA,) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 95 ° C für 30 s, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 5 s und 60 ° C für 34 s. Für mRNAs wurden die Daten unter Verwendung der endogenen GAPDH Kontrolle normalisiert. Für miRNAs wurde U6 snRNA als endogene Kontrolle verwendet. Die relative Menge von miR-10a wurde mit dem 2 ^{-ΔΔCT Methode gemessen. Die Primersequenzen sind in Tabelle S1 dargestellt.}

DNA-Extraktion, Methylierungs-spezifische PCR (MSP) und quantitative methylierungsspezifische PCR (QMSP)

hochmolekulare genomische DNA extrahiert wurde von Magenkrebsgewebe Verwendung eines DNA Extraction Kit (biomed, BJ, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bisulfit-Modifikation wurde mit der EpiTect Bisulfit-Sequenzierung-Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß dem Protokoll. Bis zu 2 &mgr; g genomische DNA wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Normale Lymphozyten-DNA behandelt mit CpG-Methyltransferase (M.SssI) (NEB, MA, USA) wurde als eine positive Kontrolle und ein Reaktionssystem ohne Vorlage wurde als Blindkontrolle verwendet.

Das Natrium bisulfate- behandelten DNA amplifiziert wurde das Bio-Rad CFX96 Echtzeit-PCR-System (Bio-Rad) unter Verwendung KAPA SYBR® FAST qPCR Kits (Kapa Biosystems) mit den folgenden Bedingungen: 95 ° C für 5 min von 40 Zyklen von 95 ° C, gefolgt für 30 s, 54 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s und einer abschließenden Verlängerung bei 72 ° C für 10 min. GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet. QMSP Reaktionen wurden dreifach durchgeführt. Der Methylierungsgrad in einer Probe wurde als Lu L et al geschätzt. [15] beschrieben. Die Primersequenzen sind in Tabelle S1 dargestellt.

5-Aza-2'-deoxyazacytidine Behandlung

Magenkrebszellen wurden in 10 cm Schalen ausgesät (1 x 10 ^{6 Zellen pro Schale) einen Tag vor der medikamentösen Behandlung. Die Zellen wurden mit 1 &mgr; M 5-Aza-2'-deoxyazacytidine (5-AZA) (Sigma, MO, USA) alle 24 h für 3 Tage behandelt.}

Zellkultur und Oligonucleotides Transfection

Die menschlichen Magenzelllinien HGC-27, SGC-7901 und MKN-45 wurden in RPMI 1640 kultiviert, das mit 10% fetalem Rinderserum ergänzten Medium (Gibco, BRL, UK) und MGC-803 wurde in DMEM (Gibco, BRL beibehalten , UK) mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt war. Diese Zelllinien wurden bei 37 ° C in angefeuchteter Luft mit 5% CO gehalten _2.

Die miR-10a Mimik, das Gerangel Mimik, siHOXA1 siRNA und Gerangel siRNA wurden synthetisiert durch Genepharma (Shanghai, China ) und bei einer Endkonzentration von 50 nmol /L mit DharmaFECT1 Reagenz (Dharmacon, TX, USA) in die Zellen transfiziert.

Zellproliferation und Koloniebildungstest

die mimic- oder siRNA- transfizierten Zellen wurden in 96-well Platten ausgesät (5000 Zellen /Vertiefung). Zellen wurden mit 10% CCK-8 (DOJINDO, Japan) bei 37 ° C inkubiert, bis sichtbare Farbumwandlungs auftrat. Proliferationsraten wurden bei 0 bestimmt, 12, 24, 48, 72, 96 Stunden nach der Transfektion.

Die Mimik-transfizierten Zellen wurden in 1640 bei 200 Zellen pro Well in 6-Well-Platten und gepflegt trypsiniert und erneut plattiert mit 10% FBS. Die Zellen kultiviert wurden 7 Tage mit Methanol fixiert und 15 min mit 0,1% Kristallviolett in 20% Methanol gefärbt.

Zelle Apoptosis Assay

Apoptosis Assays in HGC-27 durchgeführt wurden, und MGC-803-Zelllinien, die Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences) nach dem Protokoll des Herstellers und anschließend durch Calibur Fluss-Zytometer (Becton Dickinson) analysiert.

Zellmigration und Invasion Assays

A Wundheilungstest wurde durchgeführt, Zellmigration zu bewerten. Eine künstliche Wunde wurde auf einer konfluenten Zellmonoschicht erzeugt, ohne FBS ein 200 &mgr; l-Pipettenspitze 24 Stunden nach der Transfektion verwendet wird. Zur Visualisierung Zellen und die Wundheilung der Migration wurden Bilder nach 0, 12, 24, 36, 48, 60 Stunden.

Für die Transwell-Invasionsassays, HGC-27 und MGC-803-Zellen, suspendiert in 0,2 ml RPMI 1640 oder DMEM ohne FBS wurden mit 40 ul 1 mg /ml Matrigel auf der oberen Kammer jedes Einsatzes (Millipore, MA, USA) vorbeschichtet platziert. Die untere Kammer wurde mit 600 &mgr; l RPMI 1640 oder DMEM Medium mit 10% FBS als Nahrungs Lockstoff gefüllt. 24 Stunden später die Invasion Zellen an der unteren Fläche befestigt waren mit 20% Methanol fixiert und mit May-Gruwald-Giemsa (MGG). Die Membranen wurden dann geschnitzt und unter Deckgläsern eingebettet. Zellen in drei verschiedenen Sichtfeldern gezählt wurden, und alle Assays wurden dreifach durchgeführt.

Western Blotting

Western-Blot-Analyse wurde gemäß Standardverfahren durchgeführt. Proteine ​​wurden durch 10% SDS-PAGE aufgetrennt und dann übertragen auf PVDF-Membranen (Amersham, Buckinghamshire, UK). Membranen wurden über Nacht mit 5% fettfreier Trockenmilch inkubiert und für 2 h mit einem anti-HOXA1 Antikörper (Bioworld, MN, USA) bei 1:500 Verdünnungen oder anti-GAPDH-Antikörper (Proteintech, Chicago, USA) bei 1: geblockt 50.000 Verdünnungen. Nach dem Waschen mit TBST (10 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl und 0,1% Tween 20) wurden die Membranen für 2 h mit sekundärem Antikörper (zsgb-bio, Beijing, China) inkubiert.

Statistik

Jedes Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt. Die t-Test Student (two-tailed) und die x ^{2-Tests wurden durchgeführt, und die statistische Signifikanz wurde als α = 0,05 (zweiseitig) definiert. Die Mittel ± SD sind in den Figuren dargestellt.}

Ergebnisse |

miR-10a herunterreguliert in Magenkrebszellen

Wir, die Expression von reifen miR-10a untersucht in vier menschliche Zelle Magenkrebs Linien (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 und MKN-45) und eine humane Magenepithels Zelle (GES). Das Expressionsniveau von miR-10a in GES war signifikant höher als die Konzentrationen in den zwei Magenkrebszelllinien (HGC-27 und MGC-803) und war nicht signifikant, aber beobachtbar höher als die Konzentrationen in den zwei anderen Magenkrebszelllinien (MKN-45 und SGC-7901) (Abb. 1a). Diese Daten legen nahe, dass die Herunterregulierung von miR-10a könnte auf die Entstehung und Entwicklung von GC relevant sein.

Die Expression von miR-10a in der klinischen GC Patienten und ihre Korrelation mit klinisch-pathologischen Merkmale

weiter Um die Beziehung zwischen miR-10a und GC Genese untersuchen wir die Expression von miR-10a in 100 klinischen Patienten von TaqMan-Sonde abgeleiteten real-time PCR nachgewiesen, wie oben beschrieben. Von 100 Paaren von GC-Proben wurde die Expression von miR-10a in 58 Fällen nach unten geregelt (58/100, 58%) im Vergleich zu den entsprechenden benachbarten Gewebe (Fig. 1b). Insgesamt war die Expression von miR-10a in GC Gewebe-down reguliert, verglichen mit den benachbarten Geweben, wobei die Herunterregulierung war statistisch nicht signifikant (p = 0,148, gepaarter t-Test, zweiseitig) (Fig. 1c).

, die die Korrelation zwischen der Expression von miR-10a und der klinisch-pathologischen Eigenschaften zu bewerten, wurden die Patienten in zwei Gruppen eingeteilt entsprechend der relativen Expression von miR-10a in Krebsgewebe gemäß einer früher veröffentlichten Arbeit [16] . Wie in Tabelle S2 gezeigt, wurde eine statistisch signifikante Assoziation zwischen den beiden TNM Gruppen beobachtet. Es gibt mehr Patienten, die in I mit niedriger Expression von miR-10a in ihrem GC Gewebe Stufe II in der Gruppe +. Diese Beziehung angedeutet, dass miR-10a in Krebs im Frühstadium der Karzinogenese kann wichtiger sein. Allerdings zeigten unsere Daten, dass die Expression von miR-10a hatte keine Korrelation mit dem Alter, Geschlecht, histologischen Typ, Tumor Prozentsatz, venöse Invasion, Nerven Invasion, Position, Borrmann Typisierung, pT-Stadium, pN Stadium oder pM Bühne.

miR-10a Hemmt Cell Proliferation in-vitro-

die Rolle der miR-10a in Magen-Krebsentstehung zu erforschen, wir miR-10a in die GC-Zelllinien HGC-27 nachahmen transfiziert und MGC-803, von denen beide hohe Transfektionseffizienz zeigten (Fig. 2a). Als 0 durch CCK-8 Wachstumstests zeigten, 1, 2, 3 und 4 Tage nach mimic Transfektion Überexpression von miR-10a reduziert in beiden Zelllinien Zellproliferation, während die scramble mimic keine Wirkung auf die Zellproliferation war im Vergleich zu den unbehandelten Zellen (Fig. 2b). Anschließend Assays Koloniebildung wurden ausgeführt, um die proliferative Fähigkeit mimic transfizierten HGC-27 und MGC-803-Zellen zu bewerten, und zeigte, dass die Überexpression von miR-10a in HGC-27 Zellen reduziert Koloniebildung (Fig. 2c). Jedoch keine der MGC-803-Zellen Kolonien gebildet, die durch sein könnte auf die relativ schwache Anhaftung der Zellen. Um die Wirkung von miR-10a auf Zell-Apoptose in den beiden GC-Zelllinien ansprechen, den frühen Apoptose von MGC-803 und HGC-27-Zellen wurde durch Annexin V-Färbung nach miR-10a mimic Transfektion untersucht. Wie zu erwarten, einige frühe apoptotische Zellen (20,8% in HGC-27 und 22,9% in MGC-803) wurden in den Scramble mimic behandelten Zellen nachgewiesen, während miR-10a nachahmt Behandlung den Prozentsatz der frühen apoptotischen Zellen (28,4% in HGC erhöhte -27 und 27,7% in MGC-803) (Fig. 2d). Insgesamt schlossen wir, dass miR-10a durch Induktion Zell-Apoptose das Überleben der Zellen in GC-Zellen unterdrücken konnte.

miR-10a Hemmt Zellmigration und Invasion In-vitro-

Wir weiter die Auswirkungen von miR-10a auf die Zellmigration und Invasion zu beurteilen, die die wichtigsten Determinanten der malignen Progression und Metastasierung waren. Die Migrationsfähigkeit wurde durch eine Wundheilung /Kratztest in HGC-27 und MGC-803-Zellen nachgewiesen werden. Beide Zellinien behandelt mit miR-10a mimic waren deutlich weniger als die wandernde behandelt mit dem Scramble-Steuerung oder unbehandelten Zellen bei 12, 24 und 36 Stunden nach dem Kratzen (Fig. 3a). Darüber hinaus führten wir eine Matrigel Zellinvasion Assay und die Invasion Zellen gefärbt, um die Richtungs Invasion Fähigkeiten der Zellen zu messen, nachdem ektopisch exprimieren, miR-10a in den beiden Zelllinien. Die Invasivität der Zellen mit miR-10a mimischen transfiziert wurde dramatisch mit der Scramble-Steuerung und unbehandelten Zellen sank im Vergleich (Fig. 3b). Diese Ergebnisse zeigten, dass miR-10a wichtige Rollen bei der Regulierung der Zellmigration und Invasivität in GC gespielt und schlug vor, dass die Herunterregulierung von miR-10a, um Tumormetastasierung in Magen Karzinogenese beitragen könnte.

miR-10a Targets HOXA1 in GC

MiRNAs führen biologische Funktionen durch ihre Zielgene negativ regulieren. Es wurde berichtet, dass das Onkogen HOXA1 ein direktes Ziel von miR-10a in Megakaryozytopoese und menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebs ist [17] - [19]. Wie durch PicTar vorhergesagt, war es eine komplementäre Sequenz zwischen hat-miR-10a und HOXA1 3'UTR (Fig. 4a). Es ist jedoch nicht bekannt, ob miR-10a Zellproliferation reguliert, die Migration und Invasion in GC durch HOXA1 Targeting. Ihrer regulatorischen Beziehung klären, entdeckten wir zuerst die Protein- und mRNA-Spiegel von HOXA1 in miR-10a mimic transfizierten HGC-27 und MGC-803 Zellen mit Western Blot und RT-PCR. Wir beobachteten eine deutliche Abnahme der HOXA1 Proteinebene in Anwesenheit von miR-10a-Mimetika im Vergleich mit dem Scramble-Steuerung in den beiden Zellen (Fig. 4b). Die mRNA-Ebene von HOXA1 wurde ebenfalls herunterreguliert in HGC-27-Zellen, was darauf hindeutet, dass miR-10a HOXA1 Expression durch Abbau mRNA von HOXA1 in HGC-27-Zellen hemmt. Jedoch gab es wenig Veränderung in der mRNA-Ebene von HOXA1 in MGC-803-Zellen, was darauf hindeutet, dass miR-10a könnte HOXA1 Ausdruck durch translationale Repression herunterregulieren, aber nicht-mRNA-Spaltung in MGC-803-Zellen (Fig. 4c). Darüber hinaus analysierten wir die Proteinspiegel von HOXA1 in 24 GC-Patienten. Unter diesen Proben gab es 12 Patienten, bei denen miR-10a in ihrem GC Gewebe-down-reguliert und 12 Patienten, bei denen miR-10a hochreguliert in ihrem GC Gewebe (Fig. 4d). HOXA1 wurde hochreguliert in den meisten der Patienten, bei denen miR-10a nach unten reguliert wurde, in ihre GC Geweben. In ähnlicher Weise wurde HOXA1 herunterreguliert in den meisten der Patienten, bei denen miR-10a in ihrem GC Geweben hochreguliert wurde. Ein Vergleich von miR-10a Ebenen und Proteinniveaus HOXA1 in GC zeigte eine inverse Korrelation zwischen miR-10a und HOXA1 (R ^{2 = 0,1839, P = 0,0366) (Fig. 4e). Zusammen liefern diese Ergebnisse starke Hinweise darauf, dass HOXA1 ein direktes Ziel von miR-10a in GC ist. Wir haben festgestellt auch die mRNA-Ebene von HOXA1 bei diesen Patienten und beobachtet, dass die mRNA-Ebene von HOXA1 bei mehreren Patienten nicht im Einklang mit der Protein-Ebene war die ergab, dass miR-10a die Expression seiner Ziel regelt, HOXA1, durch translationale Repression aber nicht mRNA Spaltung bei diesen Patienten (Fig. S1).}

Knock-down HOXA1 Suppressed Magenkrebs Zellwachstum und Migration in-vitro-

Als nächstes fragten wir, ob HOXA1 wichtig gespielt Rollen in Magenkrebszellen. Um die Rolle von HOXA1 in GC untersuchen, geklopft wir endogene HOXA1 in HGC-27 und MGC-803-Zelllinien nach unten, um die Wirkung auf die Zellproliferation und Zellmigration erkennen. Wir beobachteten, dass HOXA1 Unterdrückung der Zellproliferation und Migration der HGC-27 und MGC-803-Zellen hemmte, bzw. (Fig. 5a und 5b). Diese Ergebnisse legen nahe, dass miR-10a fungiert als Tumorsuppressor in GC-Zellen durch HOXA1 Ausdruck zu unterdrücken.

miR-10a ist epigenetisch in GC-Zelllinien zum Schweigen gebracht

Um herauszufinden, ob die geringe Expression von Mir- 10a in GC Gewebe ein Ergebnis von epigenetical Veränderungen war, wir behandelt HGC-27, MGC-803, SGC-7901 und MKN-45-Zellen mit einem DNA-Methylierungsinhibitor 5-Aza. Die Expression von miR-10a wurde hochreguliert in HGC-27, SGC-7901 und MKN-45-Zellen, wenn sie mit AZA behandelt wurden, was darauf hindeutet, daß die Expression von miR-10a könnte in diesen Zellen durch DNA-Methylierung (Fig drückt werden. 6a).

die Regelung der miR-10a durch DNA-Methylierung zu untersuchen, suchten wir das menschliche Genom-Datenbank auf das Vorhandensein von CpG-Inseln um miR-10a "CpG-Insel Searcher" Software und eine CpG-Insel identifiziert sich 1638 bp stromaufwärts von miR-10a
(Fig. 6b). Weiterhin entdeckten wir die DNA-Methylierungsstatus in den vier GC-Zelllinien mit QMSP und MSP. Die CpG Insel wurde in allen vier Zelllinien GC hypermethyliert, die mit der niedrigen Expression von miR-10a in dieser GC-Zelllinien übereinstimmte. Wenn die GC-Zelllinien mit 5-Aza-CdR behandelt wurden, wurde der Methylierungsgrad mit der DMSO-Gruppe verringerte sich im Vergleich (Fig. 6c).

Die Down-Regulation von miR-10a in GC Patienten war aufgrund die Hypermethylation seiner CpG Inseln

Wir untersuchten ferner den Methylierungsstatus der CpG-Insel in der GC Gewebe und dem benachbarten normalen Gewebe von 55 zufällig ausgewählten Fällen durch QMSP. Der Methylierungsgrad in den 55 GC Gewebe war höher als in den benachbarten nicht-kanzerösen Gewebe (p < 0,01), die mit der niedrigen Expression von miR-10a in GC Gewebe übereinstimmte (Figur 6d.). Außerdem wählten wir zufällig zwei Paare von Proben, auf denen die DNA-Methylierungsgrad von Bisulfat-Sequenzierung PCR (BSP) zu analysieren, um die Genauigkeit der MSP zu validieren. Die Ergebnisse der BSP waren mit der QMSP konsistent und als Figur ergänzt. S2. Darüber hinaus zeigte der Methylierungsgrad von miR-10a (M /M + U) in diesen GC Patienten eine inverse Korrelation mit der Expression von miR-10a (R ^{2 = 0,1956, P = 0,0006) (Fig. 6e). Wir haben festgestellt auch die Methylierungsgrad von miR-10a in normalen Zellen des Magens und Magenkrebs-Zelllinien. Die Ergebnisse der QMSP ergab, dass die CpG-Insel in GES Zellen teilmethylierte war aber extrem hypermethylated in den beiden Magenkrebszelllinien HGC-27 und MGC-803, die auch vorgeschlagen, dass die CpG-Insel vor miR-10a
wurde in GC-Zellen (Fig. 6f) hypermethyliert. Zusammen liefern diese Ergebnisse starke Hinweise, dass die Expression von miR-10a durch DNA-Methylierung in diesen GC Patienten geregelt wurde. Die Herunterregulation von miR-10a in GC-Patienten war aufgrund der Hyper seiner CpG-Inseln.}

Diskussion

In dieser Studie haben wir festgestellt, dass miR-10a wurde in menschlichen herunterreguliert Magenkrebs zum Teil aufgrund seiner DNA-Promotor-Hypermethylierung. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Überexpression von miR-10a unterdrückt die Zellproliferation, Migration und Invasivität in den GC-Zelllinien HGC-27 und MGC-803, möglicherweise durch das Onkogen HOXA1 Targeting.

MiRNAs berichtet verschiedenen Entwicklungs zu regulieren und zelluläre Prozesse und werden in vielen menschlichen Krankheiten, insbesondere in Krebs beteiligt. MiRNAs Unterdrückung der Genexpression von mRNAs durch die Bindung an ihren 3'-UTR-Targeting. Diese miRNAs zeigen regulatorische Rolle in der Pathogenese von Krebs und bei der Zellproliferation, Differenzierung, Apoptose, Metastasierung und Resistenz involviert [4], [20]. MiR-10a spielt eine wichtige Rolle bei verschiedenen Krebsarten, einschließlich einer hepatozellulären Krebs [9], Bauchspeicheldrüsenkrebs [17], akute myeloische Leukämie [21] und chronische myeloische Leukämie [10]. Die abnormale Expression von miR-10a ist wahrscheinlich eine entscheidende Rolle bei der malignen Transformation zu spielen und ist in Bezug auf Gewebespezifität. Die Deregulierung kann zur Entwicklung von Magen Neoplasie beitragen.

Die Validierung der Expression von miR-10a in klinischen Proben gezeigt, dass miR-10a-heruntergeregelt wurde in 58 (58/100, 58%) GC Gewebe mit den angrenzenden Geweben verglichen. Jedoch Weidong Chen et al.
Untersuchten die Expression von miR-10a in 33 Fällen GC und beobachtet, dass miR-10a-Expression war höher in GC Geweben als in den benachbarten Geweben [22]. Die Widersprüchlichkeit kann ein Ergebnis der unterschiedlichen Menge von klinischen Proben und der indistinctive Änderung von miR-10a in GC Gewebe sein. Unsere Daten sollten biologisch representive sein wegen der größeren Anzahl von klinischen Proben. Nur ein größerer Teil, aber nicht alle der GC-Patienten haben eine Herabregulation von miR-10a in ihrem GC Gewebe obwohl miR-10a wirkt als Tumorsuppressor in Magenkrebszellen. Dies kann in verschiedenen Individuen wegen der unterschiedlichen Mechanismus der Entstehung von GC sein. Es könnte einige andere wichtige Gene oder Faktoren, die für die Tumorentstehung in den GC-Patienten, in deren GC Gewebe miR-10a unverändert oder hochreguliert. Darüber hinaus zeigte die miR-10a Ausdruck keine Korrelation mit klinisch-pathologischen Eigenschaften mit Ausnahme der TNM-Stadium, was darauf hinweist, dass miR-10a eine partielle Rolle bei der Tumorentstehung spielen könnten, vor allem in den frühen Stadien.

Viele miRNAs berichtet wurden mit korrelieren tumorigenesis jedoch die zugrunde liegenden molekularen Mechanismus unklar bleibt. In unserem Bericht eine funktionelle Analyse von miR-10a, einschließlich der Zellproliferation, Migration und Invasion Assays, half uns besser den Beitrag von miR-10a zu Magen-Krebsentstehung zu verstehen. Die Transfektion von miR-10a nachahmen signifikant gehemmt Zellproliferation, Migration und Invasivität in GC-Zellen, was darauf hinweist, dass die Unterdrückung von miR-10a könnte Tumorprogression bei Magen-Krebsentstehung fördern. Zukünftige Studien sind notwendig, diesen Mechanismus aufzuklären.

Im menschlichen Genom, miR-10a
befindet sich stromaufwärts von HOXB4
. miR-10b
, ein weiteres Mitglied der miR-10 Familie, befindet sich stromaufwärts von HOXD4
. Diese beiden Elemente sind unterschiedlich voneinander in nur einer Basis ist und gleiche seed Sequenzen, was darauf hindeutet, ihre ähnlichen Funktionen. Kwoneel Kim [12] wurde berichtet, dass miR-10b eine Rolle bei der GC als Tumorsuppressor spielt. In unserer Untersuchung haben wir gezeigt, dass die Überexpression von miR-10a Tumorproliferation inhibiert, Migration und Invasivität, die mit der Funktion von miR-10b in GC ähnlich war. HOX-Gene sind hoch konservierten Transkriptionsfaktoren, die für die korrekte anterior-posterior Musterung der Körperachse Determinante sind [23]. HOXA1 hat als direktes Ziel von miR-10a in menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebs validiert [17] und Megakaryozytopoese [18]. Wir beobachteten auch, dass die Überexpression von miR-10a HOXA1 Proteinspiegel in zwei GC-Zelllinien verringert, dass HOXA1 was darauf hindeutet, ist ein direktes Ziel von miR-10a in Magenkrebs.

Epigenetische Modifikationen wurden Schlüsselmediatoren gezeigt werden, die unter der Herunterregulierung der miRNA-Expression und zeigen eine enge Korrelation mit der Karzinogenese [12] [13], [24]. Unsere Daten zeigten, dass die Hypermethylierung der CpG-Insel stromaufwärts von miR-10a
zur Herabregulierung von miR-10a in GC-Zelllinien und GC-Patienten führte. Darüber hinaus erhöhte die AZA Behandlung miR-10a in GC-Zelllinien. Auf der Grundlage unserer Erkenntnisse kann der Methylierungsstatus von miR-10a als potenzieller Biomarker in GC eingesetzt werden.

Insgesamt ist diese Studie berichtet, dass miR-10a wirkt als Tumorsuppressor in GC-Zellen und ist teilweise nach unten -regulierte durch DNA-Hypermethylierung. Forced Expression von miR-10a unterdrückt die Zellproliferation, Migration und Invasivität In-vitro-
. Der Methylierungsstatus und das Expressionsniveau von miR-10a kann als potentielle Biomarker für GC und miR-10a dienen kann potenziellen therapeutischen Wert in der Krebstherapie. Weitere Studien zur epigenetischen Regulation der miRNA-Expression notwendig sind, und die Regulierung der miRNA-Expression durch epigenetische Arzneimittel, die eine neue therapeutische Strategie für Magen-und andere Krebserkrankungen des Menschen bereitstellen.

Hintergrundinformationen
Abbildung S1.
Die mRNA-Ebene von HOXA1 in den 24 GC-Patienten durch qRT-PCR nachgewiesen wurde
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s001
(TIF)
Abbildung S2.
BSP Analyse des Status-Methylierung in zwei GC-Patienten. Gefüllt und offene Kreise stellen methylierten und nicht-methylierten CpG-Stellen bzw.
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s002
(TIF)
Tabelle S1.
Die Primer werden in diesem Artikel verwendeten
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s003
(XLSX)
Tabelle S2.
Assoziation zwischen der Expression von miR-10a mit klinisch-pathologischen Eigenschaften bei Patienten mit Magenkrebs
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s004
(XLSX)

Acknowledgments

Die Autoren danken Hualu Zhao von IBMS (Institut für Medizinische Grundlagenwissenschaften), PUMC (Peking Union Medical College) für die technische Unterstützung und Dr. Hongkai Zhang aus Jiuxianqiao Krankenhaus für ihre Hilfe in der Immunhistochemie.

• PLoS ONE: Labor Ressourcennutzung für die endoskopische Magen-Krebs-Screening in der japanischen Primary Care Einstellungen: eine Arbeit Sampling Studie
• PLoS ONE: Gen-Polymorphismen von microRNAs in Helicobacter pylori-induzierten High Risk atrophische Gastritis und Magenkrebs