PLOS ONE: comparatif Proteomics analyse des cellules souches du cancer gastrique

Résumé

cellules souches du cancer (CCM) sont responsables de la progression du cancer, les métastases, et la récurrence. À ce jour, les marqueurs spécifiques de CSCs restent à découvrir. Le but de cette étude était d'identifier de nouveaux biomarqueurs de CSCs gastriques pour le diagnostic clinique en utilisant la technologie de protéomique. cellules SCC comme SP, les cellules OCUM-12 /SP, les cellules OCUM-2MD3 /SP et leurs parents OCUM-12 et les cellules OCUM-2MD3 ont été utilisés dans cette étude. lysats de protéines de chaque lignée cellulaire ont été analysées à l'aide QSTAR Elite chromatographie en phase liquide avec la spectrométrie de masse en tandem, couplé avec des étiquettes isobares pour la technologie relative et absolue quantification. protéines candidates détectées par la technologie de protéomique ont été validées par une analyse immunohistochimique de 300 cancers gastriques. Sur la base des résultats de LC-MS /MS, huit protéines, y compris RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA et KRT18, étaient régulés à la hausse dans les deux-12 OCUM cellules /SP et OCUM-2MD3 /SP des cellules par rapport à leurs cellules mères correspondantes. analyse par RT-PCR a indiqué que le niveau d'expression RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
et CK18
était élevé dans OCUM-12 /SP et OCUM-2MD3 /SP, en comparaison avec le contrôle du parent OCUM-12 et OCUM-2MD3. Ces protéines ont été associés de façon significative avec la profondeur avancée d'invasion, métastase ganglionnaire, métastases à distance, ou stade clinique avancé. expression RBBP6, DCTPP1, HSPA4 et ALDOA en particulier étaient significativement associés à un mauvais pronostic dans les 300 patients atteints de cancer gastrique. RBBP6 était déterminé à être un facteur pronostique indépendant. La capacité des OCUM-12 cellules /SP et les cellules /SP OCUM-2MD3 motilité stimulant a été inhibée par RBBP6
siRNA. Ces résultats pourraient suggérer que les huit protéines, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA et KRT18, en utilisant une analyse comparative de la protéomique, ont été perçus comme des marqueurs potentiels du SCC de cancer gastrique. Parmi les protéines candidates huit, RBBP6 a été suggéré d'être un biomarqueur pronostique prometteur et une cible thérapeutique pour le cancer gastrique

Citation:. Morisaki T, Yashiro M, Kakehashi A, Inagaki A, Kinoshita H, Fukuoka T, et Al. (2014) comparative protéomique analyse des cellules souches du cancer gastrique. PLoS ONE 9 (11): e110736. doi: 10.1371 /journal.pone.0110736

Editeur: Anita B. Hjelmeland, Université d'Alabama à Birmingham, États-Unis d'Amérique

Reçu: 3 mai 2014; Accepté: 16 Septembre 2014; Publié: 7 Novembre 2014

Droit d'auteur: © 2014 Morisaki et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données:. La auteurs confirment que toutes les données sous-jacentes les résultats sont entièrement disponibles sans restriction. Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et. Les numéros d'accès pour les données de protéines sont inclus UniProt /Swiss-Prot dans le tableau 2.

Financement: Cette étude est financée en partie par KAKENHI (Grant-in-Aid pour la recherche scientifique, n ° 22390262, 23390329 et 26293307. ), par le Fonds pour la recherche et le développement national Cancer Center (23-A-9), et par le Fonds de recherche en priorité de l'Université d'Osaka City. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

cellules souches du cancer (CCM) sont définis comme une sous-population unique dans les tumeurs qui possèdent la capacité d'initier la croissance de la tumeur et de soutenir l'auto-renouvellement [1]. Il a été proposé qu'ils peuvent causer la lignée hétérogène de cellules cancéreuses qui constituent la tumeur ainsi que de jouer un rôle important dans la progression maligne du cancer, telles que les métastases à distance, la récidive et la chimiorésistance [2] - [4]. CSCs ont été initialement identifiés dans la leucémie myéloïde aiguë [5], mais ont récemment été signalés à exister dans une grande variété de cancers, y compris le cancer gastrique [6]. L'identification des marqueurs du SCC peut ouvrir une nouvelle perspective thérapeutique sur la base de cibler sélectivement cette petite population de cellules [7], [8]. Récemment, il a été rapporté que CSCs éventuellement n'expriment leurs propres marqueurs uniques, tels que l'aldéhyde déshydrogénase 1 (ALDH1) [9], CD44 [10], [11], et CD133 [12]. Cependant, un grand nombre de marqueurs publiés ne sont pas uniques à CSCs. Quantitative profilage de l'expression des protéines permet une identification efficace des valeurs d'expression différentielle précises et reproductibles pour des protéines [13]. balises isobariques pour la quantification relative et absolue (iTRAQ) combinée à la chromatographie multidimensionnelle liquide (LC) et spectrométrie de masse tandem (LC-MS /MS) analyse est en train de devenir une méthodologie puissante dans la recherche de biomarqueurs de tumeur [14]. Nous avons précédemment rapporté que les cellules population latérale (SP) sont capables d'auto-renouvellement et de produire des cellules non-SP, et que les cellules cancéreuses dans les fractions de SP possèdent un fort potentiel tumorigène, métastases à distance [3], et la chimiorésistance [2]. Ceci suggère que les cellules SP de cancer gastrique possèdent des propriétés analogues à des cellules souches cancéreuses. Par conséquent, le but de cette étude était de détecter un nouveau CSC marqueur (s) du cancer gastrique en comparant les protéomes entre les cellules mères et les cellules souches SP cellulaires comme qui ont été connus pour posséder une riche population SCC [15].

Matériel et méthodes

cultures de cellulaires

Deux lignées cellulaires de cancer gastrique, OCUM-2MD3 [16] et OCUM-12 [17], ont été utilisés dans cette étude. Ces lignées cellulaires ont été dérivées d'un cancer gastrique de type diffus. La condition de la culture a été cultivée dans un milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM; Nikken, Kyoto, Japon) avec 10% de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur (FCS; Life Technologies, Grand Island, NY), la pénicilline et de la streptomycine, et pyruvate de sodium à 0,5 mM, et on fait incuber à 37 ° C. OCUM-12 /SP et OCUM-2MD3 lignées cellulaires /SP SP étaient des cellules qui ont été évaluées par une analyse de cytométrie en flux à l'aide de Hoechst 33342 à partir de leurs lignées cellulaires mères, 2MD3 OCUM-et-OCUM 12, respectivement. Le tri a été effectué trois fois pour établir une population stable de cellules SP-enrichi. Après un trois mois la période d'incubation post-tri, OCUM-12 cellules /SP (6,5%) et les cellules /SP OCUM-2MD3 (12,2%) représentent toujours un pourcentage élevé de la fraction de SP, par rapport à la société mère OCUM-12 (3,2% ) et OCUM-2MD3 (6,3%) des cellules (Figure S1). Par la suite, ces cellules SP enrichi avec une population stable étaient les lignées cellulaires utilisées pour l'analyse, comme indiqué précédemment [18].

Spécimens de tissus humains et de l'information des patients

Les échantillons de tissus ont été obtenus à partir 300 patients diagnostiqués avec le cancer gastrique opérations autorisées à l'Université d'Osaka City. Le tableau 1 présente les caractéristiques clinico-pathologiques des 300 patients atteints d'un cancer gastrique. Il y avait 208 92 patients masculins et féminins, l'âge médian de 64 ans (extrêmes, 28-85 ans) au moment de l'opération. Les diagnostics ont été confirmés par au moins deux personnes. Staging a été déterminée en fonction de la classification japonaise du carcinome gastrique (14 ^{e édition) [19]. Cette étude a été approuvée par la Ville Comité d'éthique de l'Université d'Osaka (Osaka, Japon). Rédigé le consentement éclairé du donneur a été obtenu pour l'utilisation de cet échantillon dans la recherche.}

Identification des protéines et Quantification par /MS

Les cellules cancéreuses QSTAR Elite LC-MS (60 pg chacun) ont été homogénéisés et ensuite lysées en utilisant soit 100 pi de tampon de lyse T-PER (Thermo Scientific) ou 500 pi d'urée 9 M et un tampon de 2% de lyse CHAPS avec un inhibiteur de protéase. Ensuite, le lysat cellulaire a ensuite été traitée par ultrasons. Après précipitation à l'acétone, les concentrations de protéines ont été mesurées par BCA Protein Assay (Pierce, IL, USA). Réduction, alkylation, la digestion, et après marquage peptidique de 50 ug de protéine pour chaque échantillon ont été effectuées en utilisant le kit AB Sciex iTRAQ Réactif Multi-Plex (AB Sciex, Concord, ON, Canada) [20]. Les échantillons marqués par iTRAQ ont été chargés sur une ICAT cartouche d'échange de cations (AB Sciex). Les peptides ont été élues en six fractions (1 ml de solution de KCl de 10, 50, 70, 100, 200 et 350 mM) et le surnageant de chacun a été évaporé dans une centrifugeuse sous vide. Les échantillons ont ensuite été dessalées et concentrées en utilisant des cartouches Sep-Pak de lumière C18 (Waters Corporation, Milford, MA), on concentre dans une centrifugeuse sous vide, remis en suspension dans 20 ul de 0,1% (v /v) d'acide formique, puis appliqués sur QSTAR Elite LC -MS /MS. Chaque échantillon a été effectuée pendant 150 minutes. données MS /MS a été fouillée contre la base de données Swiss Protein (HUMAIN) en utilisant le logiciel ProteinPilot (version 2.0, AB Sciex) avec de la trypsine définie comme l'enzyme de digestion et methanethiosulfinate de méthyle comme la modification de la cystéine. Afin d'éliminer les résultats redondants et quantification comparative, les résultats de recherche obtenus ont ensuite été traitées par un logiciel ProteinPilot en utilisant l'algorithme Paragon. Cela a abouti à l'ensemble minimal de protéines identifiées justifiables. Toutes les données déclarées a été utilisé avec une limite de coupure de 95% de confiance. la quantification relative des peptides a été calculée en tant que rapport en divisant l'intensité reporteur iTRAQ. Les rapports de peptides qui supportent l'existence d'une protéine ont été moyennées pour la quantification relative de la protéine. Par la suite, l'analyse de ProteinPilot et voie Ingenuity analyse (IPA) (système Ingenuity, Mountain View, CA) ont été effectuées. Après avoir effectué un test t simple sur l'un des ratios calculés en protéines moyennes contre 1 pour évaluer la validité des changements d'expression de protéines, une p-valeur a été signalée. ratios de protéines avec une valeur p inférieure à 0,05 ont été considérées comme fiables. Il faut savoir que dans 90% des essais expérimentaux réalisés iTRAQ précédemment, les écarts types des rapports de protéines, qui découlent de variations techniques ont été rapportés comme étant inférieur à 0,3. Par conséquent, l'expression change supérieur à 1,2 fois ou moins de 0,8 fois des niveaux d'expression normalisés étaient considérés comme hors de portée de la variabilité technique. Nous avons également effectué une analyse non marqué, et détecté la présence de protéines que dans OCUM-12 cellules /SP et les cellules /SP OCUM-2MD3, mais pas dans les cellules mères [21]. Chaque échantillon a été exécuté deux fois. L'application LC-MS /MS examen couplé avec la technologie iTRAQ ont été signalés comme une méthode quantitative fiable pour l'expression des protéines, étant encore plus sensible que le western blot qui dépend du type d'anticorps appliqués [22].

IPA et sélection des protéines candidates

la base de données IPA est principalement utilisé dans le domaine de l'ontologie exclusive, contenant jusqu'à 300.000 articles biologiques, y compris les gènes, les protéines, moléculaires et des processus cellulaires. Par conséquent, l'IPA a été utilisé pour l'analyse moléculaire de la protéine fonctions de localisation. En outre, des informations détaillées sur les fonctions et les emplacements cellulaires des protéines identifiées a été obtenu. Sur la base des résultats de LC MS /MS et IPA analyse, les protéines qui ont été observées pour être surexprimé dans SP lignées cellulaires, par rapport à leur fréquence correspondante d'expression dans les parents des lignées cellulaires, ont été sélectionnés en tant que biomarqueurs candidats pour les cellules SP du cancer de l'estomac. L'identification des réseaux d'interaction des protéines, ainsi que des groupes fonctionnels et des voies a été généré par l'IPA, et l'analyse dépend des associations précédemment caractérisés.

quantitative en temps réel la transcription inverse-polymérase Chain Reaction (RT-PCR )

cellules cancéreuses gastriques ont été cultivées. Et l'ARN cellulaire total a été extrait à l'aide de mini-kit RNeasy (QIAGEN, Carlsbad, CA). L'ADNc a été préparé à partir de 2 pg d'ARN en utilisant des amorces aléatoires (Invitrogen). Pour déterminer les changements de pliage dans chaque gène, RT-PCR a été réalisée sur l'ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), avec des essais d'expression de gènes disponibles dans le commerce (Applied Biosystems) pour RBBP6
( liaison rétinoblastome protéine 6
; Hs00544663), HSPA4
( choc thermique 70kDa protein 4
; Hs00382884), HSPA9
( choc thermique 70 kDa 9
; Hs00269818), GLG1
(Golgi glycoprotéine 1; Hs00939452), DCTPP1
( dCTP pyrophosphatase 1
; Hs00225433), VPS13A
( protéine vacuolaire tri 13 homolog A
; Hs00362891), CK18 (kératine 18
; Hs028277483), ALDOA (aldolase A
; Hs00605108), CD44
(Hs01075862), CD133
(Hs01009250) et NANOG
(Hs02387400). GAPDH (SIGMA) a été utilisé comme étalon interne pour normaliser les niveaux d'ARNm. Les valeurs du cycle seuil (Ct) ont été utilisés pour calculer les ratios d'expression relatifs entre le contrôle et les cellules traitées.

Analyse par Western blot

niveau d'expression de RBBP6 et ALDOA dans les cellules cancéreuses a été examinée comme suit. Les lysats cellulaires ont été prélevés après différents traitements. Après la concentration en protéine de chaque échantillon a été ajusté, l'électrophorèse a été réalisée en utilisant 10% de gels de Tris /Gly (Life Technologies, Carlsbad, CA). Les bandes de protéines obtenues ont été transférées sur une membrane Immobilon-P Transfert (Amersham, Aylesbury, UK). Ensuite, la membrane a été placée dans une solution de PBS-T contenant anti-RBBP6 (WH0005930M1, Sigma-Aldrich, MO, USA), anti-ALDOA (HPA004177, ATLAS), et anti-β-actine (1:300 dilution; Sigma- ALDRICH), et on laisse réagir à température ambiante pendant 2 heures. Les niveaux de protéines spécifiques dans chaque lysat ont été détectés par chimioluminescence amplifiée en utilisant ECL plus (Amersham), suivie par autoradiographie.

Les séquences de petits ARN interférents conception pour RBBP6
petite ARN interférents (siRNA) sont conçus comme suit: si RBBP6
sens, 5'-GAAAGAAGAAUAUACUGAUtt-3 '; antisens, 5'AUCAGUAUAUUCUUCUUUCgt-3 ', et nontargeting siRNA (siRNA-négatif) a été acheté auprès d'Ambion (Life Technologies, Carlsbad, CA) .OCUM-12 /SP et les cellules /SP OCUM-2MD3 ont été préparées à 60% de confluence dans boîtes à six puits. Le mélange de transfection a été préparé en ajoutant 150 ul d'Opti-MEM comprenant 9 pi de Lipofectamine ARN iMAX Regant (Life Technologies) et 150 ul d'Opti-MEM comprenant 90 pmol de l'ARNsi et l'incubation pendant 5 min à température ambiante. Enfin, on a ajouté le mélange de transfection ci-dessus pour plat six bien préparé. Vingt-quatre heures après la transfection, RT-PCR a été réalisée.

Assay

Les cellules cancéreuses de cicatrisation ont été cultivées dans des plaques à 96 puits (Essen Instruments, Birmingham, Royaume-Uni). Après que les cellules ont atteint semi-confluence, une blessure a été créée dans la monocouche cellulaire avec 96 puits par WoundMaker (Essen Bioscience, MI, USA). champs rayés ont été prises en photo toutes les 3 heures et a été contrôlé avec le système Incucyte en direct-Cell Imaging et logiciels (Instruments Essen). Le degré de migration des cellules a été analysé 24 heures après le traitement des plaies sous forme de pourcentage de confluence de la plaie. La moyenne de 4 champs a été calculé comme la valeur de l'échantillon.

Invasion Assay

Nous avons utilisé les chambres de chemotaxicell (Kubota, Osaka, Japon) avec un filtre à membrane de pores de 12 um revêtu de 50- pg Matrigel (collaborative Research Co., Bedford, MA). La chambre (composant supérieur) a été placée dans une plaque de culture 24 puits (pièce inférieure). les cellules de cancer de l'estomac ont été remises en suspension à une concentration finale de 5 x 10 ^{3 cellules /ml. Ensuite, 500 ul de composants inférieurs. Après incubation pendant 48 h, les cellules cancéreuses à la surface supérieure de la membrane ont été éliminés par essuyage et colorées à l'hématoxyline. Les cellules cancéreuses qui ont envahi à travers un filtre revêtu de Matrigel dans la membrane inférieure ont été comptées manuellement au microscope à un grossissement × 200. Six champs choisis au hasard ont été comptés pour chaque essai. La moyenne des quatre domaines a été calculé comme la valeur de l'échantillon. Pour chaque groupe, la culture a été effectuée en triple.}

Validation de l'expression protéique par immunohistochimie

immunohistochimie a été réalisée sur des échantillons de tissus fixés au formol paraffine qui ont été déparaffinées dans du xylene et déshydratées par éthanol gradué. Les sections ont été chauffés pendant 10 minutes à 105 ° C par autoclave dans Target Retrieval Solution (Dako). Les échantillons ont été ensuite mis en incubation avec 3% de peroxyde d'hydrogène pour bloquer l'activité de peroxydase endogène. Les anticorps suivants ont été utilisés dans le processus immunohistochimique: (liaison rétinoblastome protéines 6; WH0005930M1, 6:1000, Sigma-Aldrich) anti-RBBP6, anti-GLG1 (Golgi glycoprotéine 1; HPA010815, 1:80; ATLAS), anti-VPS13A (protéine vacuolaire de tri 13 homolog A; NBP1-85642, 1:500, Novus Biologicals), anti-ALDOA (aldolase A, fructose-bisphosphate; HPA004177, 1:400; ATLAS), anti-DCTPP1 (dCTP pyrophosphatase 1; HPA002832, 1:200; ATLAS), anti-HSPA9 (choc thermique 70 kDa 9; HPA000898, 1:200; ATLAS), anti-HSPA4 (choc thermique 70kDa protein 4; HPA010023, 1:200; ATLAS), et anti-KRT18 (kératine 18, ab668, 1:500; Abcam). Les échantillons ont été mis en incubation avec chaque anticorps pendant une nuit à environ 4 ° C. Ensuite, les échantillons ont été incubés dans l'immunoglobuline G est approprié pendant 10 minutes, suivie par trois lavages avec du PBS. Tous les échantillons sont ensuite traités avec un réactif de streptavidine-peroxydase, et on fait incuber dans du PBS diaminobenzidine et 1% de peroxyde d'hydrogène (en volume /volume), suivie par contre-coloration à l'hématoxyline de Mayer.

immunohistochimique d'évaluation

RBBP6, les niveaux d'expression GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA et KRT18 ont été évaluées à la fois par l'intensité de la coloration et la proportion de cellules tumorales colorées. L'intensité de la coloration a été notée sur une échelle de 0-3 (0 = non, 1 = léger, 2 = modéré, 3 = intense). Coloration proportions ont été notés sur une échelle de 0-4 (le pourcentage était différent avec chaque anticorps) sur la base du pourcentage de cellules colorées positivement. Par conséquent, le score de coloration finale, qui a été calculé comme un multiple du score d'intensité de la coloration et le score de coloration de proportion, serait sur une échelle de 0-12. les niveaux de DCTPP1 d'expression ont été considérés comme positifs quand il a reçu une note de 3. Les niveaux de HSPA4 d'expression ont été considérés comme positifs quand il a reçu une note de 6. Les niveaux de ALDOA, KRT18, VPS13A et GLG1 expression ont été considérés comme positifs lorsque chacun a reçu une note de 8. RBBP6, dont l'évaluation seul le score de coloration de proportion a été utilisée pour le calcul, a été considéré comme positif quand il a reçu une note de 3. HSPA9, l'évaluation dont seul le score d'intensité de coloration a été utilisée pour le calcul, a été considéré comme positif quand il a reçu une note de 3. Toutes les évaluations ont été faites par deux observateurs qui ignoraient les données cliniques et les résultats. Quand une évaluation discordants entre les deux observateurs indépendants a été trouvé, les lames ont été revérifiés et réévaluées après discussion.

Analyse statistique

Le logiciel SPSS (SPSS Japon, Tokyo, Japon) a été utilisé pour l'analyse des données. La signification statistique des associations entre l'expression des protéines et les différentes variables clinicopathologiques, y compris l'âge, le sexe, le type macroscopique, la différenciation de la tumeur, le nombre total de ganglions lymphatiques réséqués, et le type de chirurgie (D1 ou D2 gastrectomie) a été évaluée en utilisant Fisher et Chi -squared essais. Les courbes de survie ont été calculées à partir du jour de l'intervention au moment de la mort ou de la dernière observation de suivi en utilisant la méthode de Kaplan-Meier. En outre, les différences entre les courbes de survie ont été évalués en utilisant le test du log-rank. Des analyses multivariées ont été effectuées selon le modèle de régression de Cox pour déterminer les associations entre les variables clinicopathologiques et la mortalité. P-valeurs de < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative

Résultats

Le stemness de lignées cellulaires de cancer gastrique

Les pourcentages de cellules SP étaient plus élevés dans le OCUM-12. /SP et OCUM-2MD3 /SP cellules que dans leur parent OCUM-12 et les cellules OCUM-2MD3 (Figure S1). marqueurs de cellules souches du cancer de cellules SP, OCUM-12 /SP et OCUM-2MD3 /SP, tels que CD44, CD133 et NANOG, ont été analysés par RT-PCR. Le niveau de ces marqueurs d'expression est significativement augmentée dans les deux lignées cellulaires SP, par rapport à leurs lignées de cellules parentales (figure S2). Le nombre de colonies sphéroïde était significativement plus élevée dans les cellules OCUM-12 /SP et OCUM-2MD3 /SP que leurs cellules OCUM-12 et OCUM-2MD3 parentes (données non présentées).

Détection des protéines candidates

Nous avons examiné si les protéines sont différentiellement ou indépendamment exprimés dans les cellules SP, et comparé nos résultats à ceux de leurs cellules mères utilisant QSTAR Elite LC-MS /MS. En analysant les processus biologiques, et avec une limite de 95% de confiance de coupure et de p < 0,05, nous avons constaté que les protéines ont en effet été exprimés de manière différentielle. Les résultats de ces résultats sont présentés sur la figure 1. La plupart des protéines ont été surexprimées dans le cytoplasme de cellules tumorales (figure 1A). La valeur P inclus dans l'analyse de l'ingéniosité est indiquée dans le tableau S1. Ces protéines ont été déterminées pour être liées à des processus cellulaires tels que la mort cellulaire, le métabolisme, l'organisation cellulaire, le métabolisme de l'ADN, la dégradation des protéines, et le traitement de l'ARN (figure 1B). Les voies canoniques supérieures associées à ces objectifs et identifiés par l'IPA sont présentés dans le tableau S2.

Par rapport à leurs cellules mères correspondantes, 40 protéines étaient régulés à la hausse dans OCUM-12 /SP, et 35 protéines ont augmenté régulés dans OCUM-2MD3 /SP. Parmi ces protéines, huit étaient régulés à la hausse dans les deux OCUM-12 cellules /SP et les cellules OCUM-2MD3 /SP, alors qu'une telle association n'a été observée entre les cellules mères correspondantes (tableau 2 et figure 1C). Ces huit protéines, les trois protéines, RBBP6, GLG1 et VPS13A, ont été détectés de façon indépendante dans les deux lignées cellulaires SP, mais pas dans les cellules parentales correspondantes. Les cinq protéines, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA et KRT18, étaient significativement sur-exprimé par au moins 1,2 fois dans les deux cellules SP par rapport à leurs cellules mères correspondantes.

Le niveau d'expression de l'ARNm de ces 8 molécules candidates, RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
et CK18
a été augmenté en OCUM-12 /SP (9,15 fois, 9,36 fois, 4,14 fois, 7,80 fois, 2,08 fois, 1,46 fois, 3,44 fois et 1,99 fois, respectivement) et OCUM-2MD3 /SP (6,15 fois, 1,71 fois, 2,33 fois, 2,30 fois, 2,03 fois, 1,32 fois, 1,35 fois et 1,31 fois, respectivement) des cellules, en comparaison avec celles du témoin d'un parent OCUM-12 et les cellules OCUM-2MD3 (figure 1D). analyse par Western blot a indiqué que le niveau de RBBP6 et ALDOA expression était élevée dans les cellules CUM-12 /SP et OCUM-2MD3 /SP, en comparaison avec ce que les cellules OCUM-12 et OCUM-2MD3 (Figure S3).

le réseau présenté à la figure 1E a été généré par l'IPA, et l'analyse dépend des interactions des protéines précédemment caractérisées et rapportés. Ainsi, RBBP6, qui a été observée pour être surexprimé dans les cellules SP SCC-like, cellules OCUM-12 /SP et les cellules /SP OCUM-2MD3, était directement liée à HSPA4 et Rb, et indirectement associée à Hsp90 et TAGLN2. HSPA4, Hsp90 et TAGLN2 ont également été trouvés pour être régulés à la hausse dans les cellules SP CSC-comme.

Effet de siRBBP6 transfection sur les migrations et invasives capacités des cellules de cancer gastrique

La figure 2A montre que Si RBBP6
transfection a diminué de manière significative l'ARNm niveau des deux lignées de cellules SP expression (OCUM-12 /SP était de 12%; p < 0,01, OCUM-2MD3 /SP était de 2,5% p. < 0,01), par rapport à celui de la transfection négative ARNsi. RBBP6
siRNA knockdown a diminué de manière significative l'invasion (figure 2B) et l'activité de migration (figure 2C) des deux cellules SP.

Évaluation immunohistochimique des protéines candidates et leur association avec des fonctions clinicopathologiques

RBBP6, DCTPP1, et on a observé HSPA9 être principalement exprimé dans le cytoplasme et le noyau des cellules de cancer gastrique. GLG1, VPS13A, HSPA9, HSPA4, ALDOA, et on a observé KRT18 être principalement exprimé dans le cytoplasme (figure 3A). Dans les cellules épithéliales normales, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1 et expression HSPA9 ont trouvé des cellules de la glande épithéliale. KRT18 ont été exprimés dans la plupart des cellules épithéliales. HSPA4 et d'expression ALDOA n'a pas été trouvé dans les cellules normales. BBP6, DCTPP1 et HSPA9 ont été exprimées dans le cytoplasme et le noyau des cellules épithéliales normales. GLG1, VPS13A, HSPA9 et KRT18 ont été observées dans le cytoplasme des cellules épithéliales (figure 3B).

Nous avons exploré l'association entre le niveau d'expression des protéines candidates huit et les caractéristiques clinico. Nombre de cas à chaque score pour les huit objectifs a été montré dans le tableau S3. Ces huit protéines ont été déterminées à être associée à des processus potentiellement malignes, telles que les métastases à distance, les ganglions lymphatiques (LN) métastase, la profondeur d'invasion, ou à l'avancement de l'étape (tableau 3). Les p-valeurs calculées sont les suivantes: RBBP6 était significativement associée à la profondeur de l'invasion (p < 0,001), LN métastases (p < 0,001), métastases à distance (p = 0,013), et le stade clinique (p < 0,001); GLG1 était significativement associée à des métastases seulement distant (p = 0,045). VPS13A était significativement associée à la profondeur d'invasion (p = 0,005), LN métastases (p < 0,001), et à l'avancement de l'étape (p = 0,005); DCTPP1 était significativement associée à la profondeur de l'invasion (p < 0,001), LN métastases (p < 0,001), métastases à distance (p < 0,001), et à l'avancement de l'étape (p < 0,001); HSPA9 était significativement associée à la profondeur de l'invasion (p < 0,001), LN métastases (p < 0,001), et à l'avancement de l'étape (p < 0,001); HSPA4 était significativement associée à la profondeur de l'invasion (p < 0,001), LN métastases (p < 0,001), métastases à distance (p = 0,007), et à l'avancement de l'étape (p < 0,001); ALDOA était significativement associée à la profondeur d'invasion (p = 0,034), LN métastases (p = 0,004), et à l'avancement de l'étape (p = 0,029); et KRT18 était significativement associée à la profondeur d'invasion (p = 0,001), LN métastases (p = 0,001), métastases à distance (p = 0,034), et à l'avancement de l'étape (p = 0,004).

Pronostic

les courbes de Kaplan-Meier a suggéré que des huit protéines sur-exprimés, RBBP6, DCTPP1, HSPA4 et ALDOA, ont été significativement associés à une faible survie chez tous les patients (Figure 4). Le taux de RBBP6 positif cas (61%) cumulée de cinq ans la survie globale était significativement moins (p = 0,002) que celle de RBBP6 négatif des cas (78%). De plus, chez les patients au stade III, le taux de survie globale des cas RBBP6-positifs était significativement moins (p = 0,034) que celle des cas RBBP6-négatives. Le pronostic des patients atteints de DCTPP1 positif tumeurs (63%) était significativement plus faible (p = 0,016) que celle de DCTPP1 négatif tumeurs (75%). Le taux de survie globale à cinq ans de HSPA4 positif cas (66%) était significativement inférieur (p = 0,047) que celle de HSPA4 négatif des cas (75%). Le taux de survie globale à cinq ans de tumeurs ALDOA-positives présentant sur-expression (61%) était significativement plus faible (p = 0,043) que celle de ALDOA négatif tumeurs (72%). En revanche, aucune corrélation significative n'a été observée entre les autres protéines et la survie des patients. Après analyse univariée, les niveaux d'expression RBBP6, DCTPP1, HSPA4 et ALDOA étaient significativement associés à un mauvais pronostic chez 300 patients atteints de cancer gastrique (tableau 4). En outre, le type macroscopique (type 4), le type histologique (diffus), T catégorie (T2-4), invasion du vaisseau, modèle d'infiltration (INF b, c), métastases péritonéales et LN métastase était déterminé à être significativement associée à un mauvais pronostic. L'analyse multivariée a été réalisée en utilisant le modèle des risques proportionnels de Cox pour toutes les variables significatives dans l'analyse univariée. Lors de l'analyse terminée, l'expression de RBBP6 (p = 0,023), Borrmann type 4 (p < 0,001), péritoine positive (p = 0,001), LN métastases (p = 0,003), et des métastases hépatiques (p = 0,001) ont été confirmés comme des facteurs indépendants en corrélation avec la survie (tableau 3). Sur les huit protéines, l'expression de RBBP6 était un facteur pronostique indépendant.

Discussion

Résultats de cancer gastrique dans un mauvais pronostic en raison des processus métastatiques fréquents, tels que LN métastases et métastases péritonéales [23]. CCM ont été proposés comme ayant un rôle important dans le potentiel malin des cellules cancéreuses, y compris des métastases distantes et chimiorésistance [4]. Depuis, nous avons découvert que les cellules SP provenant de sujets atteints de cancer gastrique possèdent ces propriétés SCC [3]. Nous avons confirmé que les cellules SP utilisées dans cette étude expriment des marqueurs de cellules souches de cancer de l'estomac candidat y compris CD44 [24], CD133 [25], et NANOG [26] (figure S2). L'activité de formation de colonies sphéroïde de ces cellules SP était plus élevée que celle des cellules parentales [18]. En outre, ces cellules SP CSC-comme afficher chimiorésistance aux médicaments anticancéreux [2]. Ces résultats ont confirmé que les cellules OCUM-12 /SP et les cellules /SP OCUM-2MD3 peuvent représenter des propriétés analogues à des cellules souches cancéreuses. Depuis des marqueurs spécifiques pour CSCs gastriques n'a été publiée pour le moment, l'élucidation des voies et des mécanismes sous-jacents des actions de CSCs signalisation spécifiques pourrait améliorer le pronostic du cancer gastrique. Dans cette étude, huit candidats marqueurs CCM ont été identifiés par des techniques protéomiques par LC-MS /MS associée à une technologie iTRAQ. Trois protéines, RBBP6, et GLG1 VPS13A, ont été détectés seulement dans les lignées cellulaires de SP mais non dans les lignées de cellules parentales respectives. En outre, les cinq protéines, HSPA9, ALDOA, DCTPP1, HSPA4, et KRT18, étaient surexprimés dans les deux lignées cellulaires SP par rapport à leurs lignées cellulaires d'origine respectives. analyse par RT-PCR a également indiqué que le niveau d'expression de RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
et CK18
était élevé dans OCUM-12 /SP et OCUM- 2MD3 /SP, en comparaison avec le contrôle du parent OCUM-12 et OCUM-2MD3. Ces protéines ont été suspectés d'être de nouveaux biomarqueurs pour CSCs gastriques. Cette hypothèse a été testée par analyse immunohistochimique de 300 cas de cancer de l'estomac.

RBBP6 est une protéine nucléaire qui est un connue pour être associée et pouvant être liée à la p53, le rétinoblastome et la liaison de la protéine Q 1 (RBQ-1) [ ,,,0],27]. RBBP6 interagit avec la tumeur, des protéines suppresseurs p53 et Rb, et joue un rôle dans l'induction de l'apoptose, ainsi que la régulation du cycle cellulaire [28], [29]. RBBP6 se ​​lie aux protéines p53 de type sauvage, mais pas p53 mutants [30]. Il a également été montré pour favoriser la liaison de MDM2 [31], une ubiquitine ligase E3 qui cible le gène p53 [32] et d'interférer avec sa capacité à transactiver les gènes cibles [33]. Régulation à la hausse de RBBP6 est fortement corrélée avec la progression de la tumeur dans le cancer de l'oesophage et le cancer du col [32]. Dans cette étude, l'expression RBBP6 a été associé à la catégorie du cancer en ce qui concerne la profondeur de l'invasion, métastases à distance, métastases ganglionnaires, et le stade clinique 'T'. En outre, l'expression RBBP6 était significativement associée à une faible survie chez les patients à tous les stades, en particulier au stade III, aboutissant à la conclusion que RBBP6 était un facteur indépendant pour la survie. Nous avons effectué le RBBP6
siRNA knockdown de RBBP6
gène en utilisant OCUM-12 cellules /SP et les cellules /SP OCUM-2MD3 dans cette étude. Zhang et al.

• PLOS ONE: Photoimmunotherapy de cancer gastrique carcinose péritonéale dans un Model
• PLOS Genetics: mutations germinales dans MAP3K6 sont associés à Cancer