PLoS ONE: Comparativo Proteomics Análise de câncer gástrico Stem Cells

Sumário

células-tronco cancerosas (CSCs) são responsáveis ​​pela progressão do cancro, metástase e recorrência. Até à data, os marcadores específicos de CSCs permanecem desconhecidas. O objetivo deste estudo foi identificar novos biomarcadores de CSCs gástrico para o diagnóstico clínico utilizando a tecnologia proteômica. células CSC-SP, como células OCUM-12 /SP, células OCUM-2MD3 /SP, e seus pais OCUM-12 e células OCUM-2MD3 foram usadas neste estudo. Os lisados ​​de proteína de cada linha celular foram analisados ​​utilizando Qstar Elite cromatografia líquida com espectrometria de massa em tandem, acoplado com etiquetas isobáricas para a tecnologia de quantificação relativa e absoluta. proteínas candidatas detectados pela tecnologia proteômica foram validados por análise imuno-histoquímica de 300 cancros gástricos. Com base nos resultados de LC-MS /MS, oito proteínas, incluindo RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, e KRT18, foram regulados positivamente em ambos os-12 OCUM células /SP e OCUM-2MD3 /SP células quando comparadas com as suas células-mãe correspondentes. análise de RT-PCR indicaram que o nível de expressão RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
, e CK18
foi alta em OCUM-12 /SP e OCUM-2MD3 /SP, em comparação com o controlo de OCUM-12 pai e OCUM-2MD3. Estas proteínas foram significativamente associados com a profundidade avançada invasão, metástase linfonodal, metástases à distância, ou estágio clínico avançado. expressão RBBP6, DCTPP1, HSPA4 e ALDOA em particular foram significativamente associados com um prognóstico pobre nos 300 pacientes com câncer gástrico. RBBP6 estava determinado a ser um fator prognóstico independente. A capacidade de estimulação de motilidade de OCUM-12 células /SP e células /SP OCUM-2MD3 foi inibida pela RBBP6
siRNA. Esses achados podem sugerir que as oito proteínas, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA e KRT18, utilizando análise proteômica comparativa, eram percebidos como potenciais marcadores CSC de câncer gástrico. Das proteínas candidatas oito, RBBP6 foi sugerido para ser um biomarcador de prognóstico promissor e um alvo terapêutico para câncer gástrico

Citation:. Morisaki T, Yashiro M, Kakehashi A, Inagaki A, Kinoshita H, Fukuoka T, et ai. (2014) Comparativo Proteomics Análise de Células Estaminais câncer gástrico. PLoS ONE 9 (11): e110736. doi: 10.1371 /journal.pone.0110736

editor: Anita B. Hjelmeland, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de maio de 2014; Aceito: 16 de setembro de 2014; Publicação: 07 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Morisaki et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. números de acesso para dados de proteínas estão incluídos como UniProt /Swiss-Prot na Tabela 2.

Financiamento: Este estudo é parcialmente financiado pelo KAKENHI (Grant-in-Aid para a Investigação Científica, nºs 22390262, 23390329 e 26293307. ), pelo Fundo de Pesquisa e Desenvolvimento do Centro Nacional de Câncer (23-a-9), e por Priority Fund Research da Universidade de Osaka City. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro de células estaminais (CSCs) são definidos como uma subpopulação único em tumores que possuem a capacidade de iniciar o crescimento do tumor e manter a auto-renovação [1]. Tem sido proposto que eles podem causar a linhagem heterogénea de células cancerosas que constituem o tumor, bem como desempenham um papel importante na progressão maligna de carcinoma, tais como metástases distantes, recorrência, e quimiorresistência [2] - [4]. CSCs foram inicialmente identificados na leucemia mielóide aguda [5], mas foram recentemente relatada a existência de uma grande variedade de cancros, incluindo o cancro [6] gástrico. A identificação de marcadores CSC pode abrir um novo ponto de vista terapêutico com base na segmentação selectivamente essa população pequena de células [7], [8]. Recentemente, foi relatado que os CSCs possivelmente fazer exprimir os seus próprios marcadores únicos, tais como aldeído desidrogenase 1 (ALDH1) [9], CD44 [10], [11], e CD133 [12]. No entanto, muitos dos marcadores publicados não são exclusivos de CSCs. Quantitativa perfil de expressão de proteínas permite a identificação eficiente de valores de expressão diferenciais precisas e reprodutíveis de proteínas [13]. etiquetas isobáricas de quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) combinada com cromatografia multidimensional líquida (CL) e análise de espectrometria de massa tandem (LC-MS /MS) está a emergir como uma poderosa metodologia na busca de marcadores tumorais [14]. Nós relatado anteriormente que as células população lateral (SP) são capazes de se auto-renovar e produzir as células não-SP, e que as células cancerosas em frações SP possuem alto potencial de tumorigenicidade, metástases à distância [3], e chemoresistance [2]. Isto sugere que as células de SP do câncer gástrico possuem propriedades semelhantes a células-tronco do câncer. Portanto, o objetivo deste estudo foi detectar um romance CSC marcador (s) de câncer gástrico, comparando os proteomas entre as células-mãe e as células-tronco SP semelhantes a células que têm sido conhecidos por possuir uma população CSC rica [15].

Materiais e Métodos

culturas de células

Duas linhas celulares de cancro gástrico, OCUM-2MD3 [16] e OCUM-12 [17], foram utilizados neste estudo. Estas linhas celulares foram derivadas de cancro gástrico do tipo difuso. A condição da cultura foi cultivada em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Nikken, Quioto, Japão) com 10% de soro fetal de vitelo inactivado pelo calor (FCS; Life Technologies, Grand Island, NY), penicilina e estreptomicina e piruvato de sódio 0,5 mM, e incubou-se a 37 ° C. linhas celulares /SP OCUM-12 /SP e OCUM-2MD3 eram células SP que foram avaliados através de uma análise de citometria de fluxo utilizando a Hoechst 33342 a partir de suas linhas de células-mãe, e OCUM-2MD3 OCUM-12, respectivamente. Triagem foi realizado três vezes para estabelecer uma população estável de células enriquecida em SP. Após a três meses período de incubação pós-triagem, OCUM-12 células /SP (6,5%) e células /SP OCUM-2MD3 (12,2%) ainda representava uma percentagem elevada da fração SP, em comparação com pai OCUM-12 (3,2% ) e OCUM-2MD3 (6,3%), as células (Figura S1). Subsequentemente, estas células enriquecida-SP com uma população estável, foram as linhas celulares utilizadas para a análise, conforme relatado anteriormente [18].

espécimes de tecidos humanos e de informações do paciente

As amostras de tecido foram obtidas a partir de 300 pacientes diagnosticados com operações permitidas câncer gástrico em Osaka University City. A Tabela 1 mostra as características clínico-patológicas dos 300 pacientes com câncer gástrico. Havia 208 do sexo masculino e 92 do sexo feminino, com a idade média de 64 anos (variação, 28-85 anos) no momento da operação. Os diagnósticos foram confirmadas por pelo menos duas pessoas. O estadiamento foi determinado de acordo com a classificação japonesa de carcinoma gástrico (14 ^{th edition) [19]. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Osaka City University Ética (Osaka, Japão). consentimento informado por escrito do doador foi obtido para o uso desta amostra em investigação.}

identificação de proteínas e quantificação por /MS

As células cancerosas Qstar Elite LC-MS (60 mg cada) foram homogeneizadas e, em seguida, lisadas usando 100 ul de tampão T-PER de lise (Thermo Scientific) ou 500 ul da 9 M de ureia, 2% e tampão de lise CHAPS com um inibidor de protease. Subsequentemente, o lisado celular foi, em seguida, tratada por ultra-sons. Após precipitação com acetona, as concentrações de proteína foram medidas pelo BCA Protein Assay (Pierce, IL, EUA). Redução, alquilação, a digestão, e subsequente etiquetagem péptido de 50 ug de proteína em cada amostra foram realizadas utilizando o kit de AB Sciex iTRAQ Reagente multi-Plex (AB Sciex, Concord, ON, Canadá) [20]. As amostras marcadas foram iTRAQ-carregado num cartucho de permuta catiónica ICAT (AB Sciex). Os péptidos foram eluídos como seis fracções (1 ml de solução de KCL 10, 50, 70, 100, 200, e 350 mM), e o sobrenadante de cada uma foi evaporada dentro de uma centrífuga de vácuo. As amostras foram então dessalinizado e concentrado utilizando cartuchos Sep-Pak Luz C18 (Waters Corporation, Milford, MA), evaporadas a uma centrífuga de vácuo, ressuspenderam-se em 20 ul de 0,1% (v /v) de ácido fórmico, e subsequentemente aplicada sobre Qstar Elite LC -MS /MS. Cada amostra foi executado durante 150 minutos. Os dados de MS /MS foi pesquisada contra a base de dados Swiss Protein (humano) utilizando o software ProteinPilot (versão 2.0, AB Sciex) com tripsina definido como o enzima de digestão e methanethiosulfinate metilo como a modificação de cisteína. A fim de remover visitas redundantes e quantificação comparativo, os resultados da pesquisa obtidos foram ainda processados ​​por um software ProteinPilot utilizando o algoritmo Paragon. Isto resultou no conjunto mínimo de proteínas identificadas justificáveis. Todos os dados relatados foi usada com um limite de corte de 95% de confiança. quantificação relativa dos peptídeos foi calculada como o quociente dividindo a intensidade iTRAQ repórter. Os rácios de péptidos que suportam a existência de uma proteína se a média para a quantificação relativa de proteína. Posteriormente, foi realizada a análise de análise ProteinPilot e Ingenuity via (IPA) (Ingenuity sistema, Mountain View, CA). Após a realização de um teste t simples de um dos rácios de proteína em média calculada em relação a 1 para avaliar a validade das alterações de expressão de proteínas, um valor de p foi relatada. rácios de proteína com um valor de p inferior a 0,05 foi considerado de confiança. Deve ser conhecido que em 90% das corridas experimentais iTRAQ feito anteriormente, os desvios padrão das proporções de proteína, que resultam de variações técnicas, foram registadas como sendo inferiores a 0,3. Portanto, a expressão muda maior do que 1,2 vezes ou menos de 0,8 vezes dos níveis de expressão normalizados foram considerados como estando fora do intervalo de variabilidade técnica. Também foi realizada uma análise não-rotulados, e detectou a presença de proteínas apenas dentro OCUM-12 células /SP e células /SP OCUM-2MD3, mas não no interior das células-mãe [21]. Cada amostra foi executado duas vezes. O aplicada LC-MS /MS análise juntamente com a tecnologia iTRAQ ter sido classificado como um método quantitativo para a expressão da proteína de confiança, sendo ainda mais sensível do que o Western blot que depende do tipo de anticorpos aplicados [22].

IPA e selecção de proteínas candidatas

o banco de dados do IPA é utilizado principalmente no domínio da ontologia proprietária, contendo até 300.000 artigos biológicos, incluindo genes, proteínas moleculares e processos celulares. Portanto, o IPA foi empregue para a análise de proteínas funções molecular, localização. Além disso, obteve-se informação pormenorizada sobre as funções e localizações celulares das proteínas identificadas. Com base nos resultados de LC MS /MS e as análises do IPA, proteínas que foram observadas a ser sobre-expresso em linhas de células de SP, quando comparado com a sua frequência correspondente de expressão em linhas de células-mãe, foram seleccionados como candidatos a biomarcadores para células SP de câncer gástrico. A identificação de proteínas que interagem de redes, bem como grupos funcionais e vias foi gerado pelo IPA, e a análise depende das associações previamente caracterizados.

quantitativo em tempo real Transcrição Reversa-Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR )

células cancerosas gástricas foram cultivadas. E o ARN celular total foi extraído utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Carlsbad, CA). O ADNc foi preparado a partir de 2 ug de ARN utilizando iniciadores aleatórios (Invitrogen). Para determinar as mudanças de dobragem em cada gene, RT-PCR foi realizada no ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), com ensaios de expressão de genes disponíveis comercialmente (Applied Biosystems) para RBBP6
( vinculativo retinoblastoma proteína 6
; Hs00544663), HSPA4
( proteína de choque térmico 70 kDa 4
; Hs00382884), HSPA9
( proteína de choque térmico de 70 kDa 9
; Hs00269818), GLG1
(Golgi glicoproteína 1; Hs00939452), DCTPP1
( dCTP pirofosfatásica 1 |; Hs00225433), VPS13A
( proteína vacuolar triagem 13 homólogo A
; Hs00362891), CK18 (queratina 18
; Hs028277483), ALDOA (aldolase A
; Hs00605108), CD44
(Hs01075862), CD133
(Hs01009250) e NANOG
(Hs02387400). GAPDH (SIGMA) foi utilizado como um padrão interno para normalizar os níveis de mRNA. Os valores do ciclo limiar (Ct) foram utilizados para calcular os rácios de expressão relativa entre o controle e as células tratadas.

análise de Western blot

O nível de expressão de RBBP6 e ALDOA em células cancerosas foi analisada como se segue. Os lisados ​​celulares foram recolhidos após diferentes tratamentos. Após a concentração de proteína de cada amostra foi ajustado, a electroforese foi realizada utilizando 10% de géis de Tris /Gly (Life Technologies, Carlsbad, CA). As bandas de proteínas obtidas foram transferidas para uma membrana Immobilon-P de transferência (Amersham, Aylesbury, Reino Unido). Em seguida, a membrana foi colocada em solução de PBS-T contendo anti-RBBP6 (WH0005930M1, Sigma-Aldrich, MO, EUA), anti-ALDOA (HPA004177, Atlas), e anti-β-actina (diluição 1:300; Sigma- Aldrich), e deixou-se reagir à temperatura ambiente durante 2 horas. Os níveis de proteínas específicas em cada lisado foram detectados por quimioluminescência aumentada utilizando ECL mais (Amersham) seguido por autorradiografia.

pequeno ARN interferente Design by

As sequências para RBBP6
pequeno ARN interferente (siRNA) são concebidos como se segue: Si RBBP6
sentido, 5'-GAAAGAAGAAUAUACUGAUtt-3 '; anti-sentido, 5'-AUCAGUAUAUUCUUCUUUCgt-3 ', e nontargeting siARN (siARN-negativo) foi adquirido a partir da Ambion (Life Technologies, Carlsbad, CA) .OCUM-12 /SP e células /SP OCUM-2MD3 foram preparadas em 60% de confluência em de seis poços pratos. A mistura de transfecção foi preparado por adição de 150 uL de Opti-MEM incluindo 9 ul de Lipofectamina ARN Imax Regant (Life Technologies) a 150 uL de Opti-MEM incluindo 90 pmol de siRNA e incubando durante 5 minutos à temperatura ambiente. Finalmente, a mistura de transfecção acima foi adicionado ao prato de seis bem preparada. Vinte e quatro horas após a transfecção, RT-PCR foi realizada.

Ensaio

As células cancerosas de cicatrização foram cultivadas em placas de 96 poços (Essen Instruments, Birmingham, UK). Após as células atingiram semi-confluência, uma ferida foi criada na monocamada de células com 96 poços por WoundMaker (Essen Bioscience, MI, EUA). campos riscados foram tomadas na foto a cada 3 horas e foi monitorizada com Sistema Incucyte Vivo-Cell Imaging and software (Essen Instruments). O grau de migração de células foram analisadas 24 horas após o tratamento de feridas como uma percentagem de confluência de feridas. A média de 4 campos foi calculado como o valor da amostra.

Invasion Ensaio

Nós usamos as câmaras chemotaxicell (Kubota, Osaka, Japão) com um filtro de membrana de poros de 12 mm revestidas com 50- ug Matrigel (Collaborative Research Co., Bedford, MA). A câmara (componente superior) foi colocada numa placa de cultura de 24 poços (componente menor). células de cancro gástrico foram re-suspensa para uma concentração final de 5 x 10 3 ^{células /mL. Em seguida, 500 ul componentes menores. Após incubação durante 48 h, as células cancerosas na superfície superior da membrana foram removidos por limpeza e coradas com hematoxilina. As células cancerosas que invadiram através de um filtro revestido com Matrigel na membrana inferior foram contadas manualmente ao microscópio a uma ampliação de 200 x. Seis campos escolhidos aleatoriamente foram contados para cada ensaio. A média de quatro campos foi calculado como o valor de amostra. Para cada grupo, a cultura foi feita em triplicado.}

Validação da expressão da proteína por imuno-histoquímica

A imuno-histoquímica foi realizada em amostras de tecido fixadas em formalina, embebidos em parafina que foram desparafinados em xileno e desidratadas através etanol graduado. As seções foram aquecidas durante 10 minutos a 105 ° C por autoclave em alvo Retrieval Solution (Dako). As amostras foram subsequentemente incubadas com peróxido de hidrogénio a 3% para bloquear a actividade da peroxidase endógena. Os anticorpos seguintes foram usadas no processo de imuno-histoquímica: (retinoblastoma proteína de ligação 6; WH0005930M1, 6:1000; Sigma-Aldrich) anti-RBBP6, anti-GLG1 (Golgi glicoproteína 1; HPA010815, 1:80; Atlas), anti-VPS13A (proteína vacuolar triagem 13 Um homólogo; NBP1-85642, 1:500; Novus Biologicals), anti-ALDOA (aldolase A, fructose-bisphosphate; HPA004177, 1:400; Atlas), anti-DCTPP1 (dCTP pirofosfatase 1; HPA002832, 1:200; ATLAS), anti-HSPA9 (choque térmico de 70 kDa proteína 9; HPA000898, 1:200; ATLAS), anti-HSPA4 (proteína de choque térmico 70 kDa 4; HPA010023, 1:200; ATLAS), e anti-KRT18 (queratina 18; ab668, 1:500; Abcam). As amostras foram incubadas com cada um dos anticorpos durante a noite a cerca de 4 ° C. Em seguida, as amostras foram incubadas em imunoglobulina G apropriado durante 10 minutos, seguido por três lavagens com PBS. Todas as amostras foram, em seguida, tratada com o reagente estreptavidina-peroxidase, e incubados em PBS diaminobenzidina e 1% de peróxido de hidrogénio (vol /vol), seguido pela contra-coradas com hematoxilina de Mayer.

Avaliação imuno-histoquímica

RBBP6, Os níveis de expressão GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA e KRT18 foram avaliados por ambos intensidade de coloração e proporção de células tumorais coradas. A intensidade da coloração foi pontuada numa escala de 0-3 (0 = nenhuma, 1 = ligeira, 2 = moderada, 3 = forte). proporções de coloração foram pontuadas numa escala de 0-4 (a percentagem era diferente com cada anticorpo) com base na percentagem de células coradas positivamente. Portanto, a pontuação coloração final, que foi calculada como um múltiplo da pontuação intensidade de coloração ea pontuação coloração proporção, seria em uma escala de 0-12. Os níveis de expressão de DCTPP1 foram considerados positivos quando recebeu uma pontuação de 3. Os níveis de expressão de HSPA4 foram considerados positivos quando recebeu uma pontuação de 6. Os níveis de expressão de ALDOA, KRT18, VPS13A e GLG1 foram considerados positivos quando cada um recebeu uma pontuação de 8. RBBP6, a avaliação dos quais apenas a pontuação coloração proporção foi utilizado para o cálculo, foi considerado positivo quando recebeu uma pontuação de 3. HSPA9, a avaliação dos quais apenas a pontuação intensidade da coloração foi utilizado para o cálculo, foi considerado positivo quando se recebeu uma pontuação de 3. Todas as avaliações foram realizadas por dois observadores que desconheciam os dados clínicos e resultados. Quando foi encontrada uma avaliação discrepantes entre os dois observadores independentes, as lâminas foram reexaminados e reavaliados após discussão.

Análise Estatística

Foi utilizado o programa SPSS (SPSS Japão, Tóquio, Japão) para análise de dados. A significância estatística das associações entre a expressão de proteínas e as diversas variáveis ​​clínico-patológicas, incluindo idade, sexo, tipo macroscópico, a diferenciação do tumor, número total de linfonodo ressecado, e do tipo de cirurgia (D1 ou D2 gastrectomia) foi avaliada por meio de Fisher e Chi testes -squared. As curvas de sobrevida foram calculados a partir do dia da cirurgia para a hora da morte ou para a última observação de acompanhamento utilizando o método de Kaplan-Meier. Além disso, as diferenças entre as curvas de sobrevida foram avaliados através do teste log-rank. multivariadas foram realizadas de acordo com o modelo de regressão de Cox para determinar as associações entre as variáveis ​​clínicas e mortalidade. Os valores de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

O stemness de linhas celulares de cancro gástrico

As percentagens de células SP foram maiores no OCUM-12. /células SP e OCUM-2MD3 /SP do que em suas celas OCUM-2MD3 (Figura S1) OCUM-12 pai e. marcadores de células-tronco do câncer de células SP, OCUM-12 /SP e OCUM-2MD3 /SP, como o CD44, CD133 e NANOG, foram analisadas por RT-PCR. O nível destes marcadores de expressão foi significativamente aumentada em ambas as linhas de células de SP, em comparação com as linhas celulares parentais (Figura S2). O número de colónias esferóide foi significativamente superior em ambas as células OCUM-12 /SP e OCUM-2MD3 /SP do que as suas células OCUM-12 e OCUM 2MD3-mãe (dados não mostrados).

A detecção de proteínas candidatas

Nós investigamos se as proteínas foram diferencialmente ou de forma independente expressa em células de SP, e comparou os nossos resultados aos de suas células-mãe usando Qstar Elite LC-MS /MS. Ao analisar os processos biológicos, e com um limite de corte de 95% de confiança e p < 0,05, identificamos que as proteínas estavam realmente diferencialmente expressos. Os resultados destes resultados são apresentados na Figura 1. A maior parte das proteínas foram sobre-expressos no citoplasma de células de tumor (Figura 1A). O valor de P incluídos na análise engenho está indicado na Tabela S1. Estas proteínas foram determinadas para ser relacionada com processos celulares, tais como a morte celular, o metabolismo, a organização celular, metabolismo de ADN, degradação da proteína, e o processamento de ARN (Figura 1B). As vias canônicas principais associados a essas metas e identificadas pelo IPA são apresentados na Tabela S2.

Quando comparado com as suas células-mãe correspondentes, 40 proteínas foram regulados positivamente em OCUM-12 /SP, e 35 proteínas aumentaram -regulated em OCUM-2MD3 /SP. Entre estas proteínas, oito foram regulados positivamente em ambos os OCUM-12 células /SP e células OCUM-2MD3 /SP, ao passo que não se observou tal associação entre as células parentais correspondentes (Tabela 2 e Figura 1C). Destas oito proteínas, as três proteínas, RBBP6, GLG1, e VPS13A, foram detectadas de forma independente, em ambas as linhas de células de SP, mas não nas suas células parentais correspondentes. Os cinco proteínas, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, e KRT18, foram significativamente sobre-expressos em pelo menos 1,2 vezes em ambas as células SP quando em comparação com as suas células parentais correspondentes.

O nível de expressão de ARNm de estes 8 moléculas candidatas, RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
, e CK18
foi aumentado em OCUM-12 /SP (9,15 vezes, 9,36 vezes, 4,14 vezes, 7,80 vezes, 2,08 vezes, 1,46 vezes, 3,44 vezes, e 1,99 vezes, respectivamente) e OCUM-2MD3 /SP (6,15 vezes, 1,71 vezes, 2,33 vezes, 2,30 vezes, 2,03 vezes, 1,32 vezes, de 1,35 vezes, e 1,31 vezes, respectivamente), as células, em comparação com os do controlo de células OCUM-2MD3 (Figura 1D) OCUM-12 e pai. A análise por Western blot indicou que o nível de expressão RBBP6 e ALDOA foi elevada em células cum-12 /SP e OCUM-2MD3 /SP, em comparação com o que as células OCUM-12 e OCUM-2MD3 (Figura S3).

a rede apresentada na Figura 1E foi gerado pelo IPA, e a análise depende das interacções entre proteínas anteriormente caracterizadas e relatados. Assim, RBBP6, que foi observada a ser sobre-expressos em células SP CSC-like, as células OCUM-12 /SP e células /SP OCUM-2MD3, estava diretamente relacionado com HSPA4 e Rb, e indiretamente associada a Hsp90 e TAGLN2. HSPA4, Hsp90 e TAGLN2 também foram encontrados para ser sobre-regulada em células SP CSC-like.

Efeito da siRBBP6 transfecção sobre a migração e invasivos habilidades de células cancerosas gástricas

Figura 2A mostra que Si RBBP6
transfecção diminuição significativa do nível de expressão de ARNm de ambas as linhas de células SP (OCUM-12 /SP foi de 12%, p < 0,01, OCUM-2MD3 /SP, foi de 2,5% p. < 0,01), em comparação com que de transfecção negativa siRNA. RBBP6
siRNA knockdown diminuiu significativamente a invasão (Figura 2B) e atividade de migração (Figura 2C) de ambas as células SP.

imuno-histoquímica de Avaliação de proteínas candidatas e sua associação com características clínicopatológicos

RBBP6, DCTPP1, e HSPA9 foram observados para ser expresso principalmente no citoplasma e núcleo de células de cancro gástrico. GLG1, VPS13A, HSPA9, HSPA4, ALDOA, KRT18 e foram observados a ser expresso principalmente no citoplasma (Figura 3A). Nas células epiteliais normais, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, e expressão HSPA9 foram encontradas algumas células na glândula epitelial. KRT18 foram expressos na maioria das células epiteliais. HSPA4 e expressão ALDOA não foi encontrado em células normais. BBP6, DCTPP1, e HSPA9 foram expressas no citoplasma e núcleo das células epiteliais normais. GLG1, VPS13A, HSPA9, KRT18 e foram observados no citoplasma de células epiteliais (Figura 3B).

Nós exploramos a associação entre o nível de expressão das proteínas candidatas oito e as características clinicopatológicas. Número de casos para cada pontuação para os oito metas foi mostrado na Tabela S3. Estes oito proteínas foram determinadas para ser associado com os processos potencialmente malignas, tais como metástases distantes, metástase de nódulo linfático (LN), a profundidade de invasão ou progressão fase (Tabela 3). Os valores de p calculados eram como se segue: RBBP6 foi significativamente associado com a profundidade invasão (p < 0,001), LN metástases (p < 0,001), metástase distante (p = 0,013), e fase clínica (p < 0,001); GLG1 foi significativamente associada com metástase única distante (p = 0,045). VPS13A foi significativamente associada com profundidade de invasão (p = 0,005), LN metástase (p < 0,001), e avanço fase (p = 0,005); DCTPP1 foi significativamente associada com profundidade de invasão (p < 0,001), LN metástase (p < 0,001), metástases à distância (p < 0,001), e avanço fase (p < 0,001); HSPA9 foi significativamente associada com profundidade de invasão (p < 0,001), LN metástase (p < 0,001), e avanço fase (p < 0,001); HSPA4 foi significativamente associada com profundidade de invasão (p < 0,001), LN metástase (p < 0,001), metástases à distância (p = 0,007), e avanço fase (p < 0,001); ALDOA foi significativamente associada com profundidade de invasão (p = 0,034), LN metástases (p = 0,004), e avanço fase (p = 0,029); e KRT18 foi significativamente associada com profundidade de invasão (p = 0,001), LN metástases (p = 0,001), metástases à distância (p = 0,034), e avanço fase (p = 0,004).

Prognosis

as parcelas de Kaplan-Meier sugeriu que dos oito proteínas sobre-expressos, RBBP6, DCTPP1, HSPA4 e ALDOA, foram significativamente associados com pior sobrevida em todos os pacientes (Figura 4). A taxa de sobrevivência cumulativa global em cinco anos de RBBP6-positivo casos (61%) era significativamente menor (p = 0,002) do que a de RBBP6-negativo casos (78%). Além disso, em pacientes na fase III, a taxa de sobrevida global de casos RBBP6-positivos foi significativamente menor (p = 0,034) do que a dos casos RBBP6-negativos. O prognóstico de pacientes com tumores DCTPP1-positiva (63%) foi significativamente pior (p = 0,016) do que a de DCTPP1-negativo tumores (75%). A taxa de sobrevivência global em cinco anos de HSPA4-positivo casos (66%) era significativamente menor (p = 0,047) do que a de HSPA4-negativo casos (75%). A taxa de sobrevivência global em cinco anos de tumores ALDOA-positivos que exibem sobre-expressão (61%) foi significativamente pior (p = 0,043) do que a de ALDOA-negativo tumores (72%). Em contraste, não foram observadas correlações significativas entre outras proteínas e sobrevida do paciente. Após a análise univariada, níveis de expressão RBBP6, DCTPP1, HSPA4 e ALDOA foram significativamente associados com mau prognóstico em 300 pacientes com câncer gástrico (Tabela 4). Além disso, o tipo macroscópica (tipo 4), tipo histológico (difuso), categoria T (T2-4), invasão de vasos, padrão de infiltração (INF b, c), metástase peritoneal e LN metástase estava determinada a ser significativamente associada com um Prognóstico pobre. A análise multivariada foi realizada utilizando o Riscos Modelo Cox proporcional para todas as variáveis ​​significativas na análise univariada. Após a conclusão análise, expressão RBBP6 (p = 0,023), Borrmann tipo 4 (p < 0,001), positivo peritoneu (p = 0,001), LN metástases (p = 0,003), e metástases hepáticas (p = 0,001) foram confirmados como factores independentes correlacionado com a sobrevivência (Tabela 3). Dos oito proteínas, expressão RBBP6 foi um fator prognóstico independente.

Discussão

resultados câncer gástrico em um prognóstico pobre por causa de processos metastáticos frequentes, tais como LN metástase e metástase peritoneal [23]. CSCs têm sido propostos como tendo um papel importante no potencial maligno de células de cancro, incluindo metástase distante e quimiorresistência [4]. Temos desde descobriram que as células SP obtidas de indivíduos com câncer gástrico possuem essas propriedades CSC [3]. Nós confirmamos que as células SP utilizada neste estudo marcadores de células tronco de câncer gástrico candidato expressas, incluindo CD44 [24], CD133 [25], e NANOG [26] (Figura S2). A actividade de formação de colónias esferóide destas células SP foi maior do que a das células progenitoras [18]. Além disso, essas células SP CSC-como exibir chemoresistance de drogas anticâncer [2]. Esses achados confirmam que as células OCUM-12 /SP e células /SP OCUM-2MD3 pode representar propriedades semelhantes a células-tronco do câncer. Desde marcadores específicos para CSCs gástricas não foram publicados até o momento, a elucidação das vias e mecanismos subjacentes às ações de CSCs de sinalização específicas pode melhorar o prognóstico do câncer gástrico. Neste estudo, oito CSCs marcadores candidatos foram identificados por técnicas proteomic utilizando LC-MS /MS acoplada com a tecnologia iTRAQ. Três proteínas, RBBP6, GLG1 e VPS13A, foram detectados apenas nas linhas de células SP mas não nas suas respectivas linhas de células-mãe. Além disso, os cinco proteínas, HSPA9, ALDOA, DCTPP1, HSPA4, KRT18, e foram sobre-expresso em linhas celulares de SP em relação às suas respectivas linhas de células-mãe. análise de RT-PCR também indicou que o nível de expressão RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
, e CK18
foi alta em OCUM-12 /SP e OCUM- 2MD3 /SP, em comparação com o controlo de OCUM-12 pai e OCUM-2MD3. Estas proteínas foram suspeitos de serem novos biomarcadores para CSCs gástricas. Esta hipótese foi testada por análise de imuno-histoquímica de 300 casos de câncer gástrico.

RBBP6 é uma proteína nuclear, que é um conhecido para ser associado e potencialmente relacionado a p53 e retinoblastoma ligação às proteínas Q 1 (RBQ-1) [ ,,,0],27]. RBBP6 interage com o tumor proteínas supressoras de p53 e Rb, e desempenha um papel na indução de apoptose bem como a regulação do ciclo celular [28], [29]. RBBP6 se ​​liga a proteínas p53 de fenótipo natural, mas não à p53 mutantes [30]. Também tem sido mostrado para promover a ligação de MDM2 [31], uma ubiquitina ligase E3 que tem como alvo a p53 [32], e para interferir com a sua capacidade para transactivar os genes-alvo [33]. -Regulação de RBBP6 foi fortemente correlacionada com a progressão do tumor em câncer de esôfago e câncer cervical [32]. Neste estudo, a expressão RBBP6 foi associada com câncer categoria 'T' com relação à profundidade de invasão, metástase, linfonodo metástases e estadiamento clínico. Além disso, a expressão RBBP6 foi significativamente associada a menor sobrevida em pacientes em todas as fases, sobretudo na fase III, resultando na conclusão de que RBBP6 era um fator independente para a sobrevivência. Realizamos a RBBP6
siRNA knockdown de RBBP6
gene usando OCUM-12 células /SP e células /SP OCUM-2MD3 neste estudo. Zhang et al.

• PLOS ONE: Photoimmunotherapy de câncer gástrico Peritoneal Carcinomatose em um modelo do rato
• PLoS Genetics: mutações germinativas em MAP3K6 estão associados com Familial Câncer Gástrico