PLoS One: Lyginamoji Proteomika analizė Skrandžio vėžio kamieninių Cells

Abstract

Vėžys kamieninės ląstelės (CSCS) yra atsakingas už vėžio progresavimą, metastazių ir pasikartojimo. Iki šiol, konkretūs markerius CSCS lieka neatrastų. Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti naujus biologinius žymenis skrandžio CSCS už klinikinę diagnozę, naudojant proteomiką technologiją. CSC-kaip SP ląstelės, OCUM-12 /SP ląstelės, OCUM-2MD3 /SP ląstelės, ir jų tėvų OCUM-12 ląstelių ir OCUM-2MD3 ląstelės buvo naudojamas šiame tyrime. Baltymų fragmentai iš kiekvienos ląstelių linijos buvo analizuojami naudojant QSTAR Elite skysčių chromatografija su masių spektrometrija Tandem, kartu su izobarinių tegai ir sąlyginės bei absoliučiosios kiekybinio technologija. aptiktų proteomiką technologijos kandidatės baltymai buvo patvirtintas imunohistocheminio analize 300 skrandžio vėžio. Remiantis LC-MS /MS aštuoni baltymų, įskaitant RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA ir KRT18 rezultatus, buvo iki reguliuojama abiejose OCUM-12 /SP ląstelių ir OCUM-2MD3 /SP ląstelių, palyginti su jų atitinkamų patronuojančiųjų ląsteles. AT-PGR analizė parodė, kad pasakymas lygis RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
, ir CK18
buvo didelis OCUM-12 /SP ir OCUM-2MD3 /SP ir, palyginti su pirminio OCUM-12 ir OCUM-2MD3 kontrolę. Šie baltymai buvo reikšmingai susijęs su pažangiomis invazijos gylis, limfmazgių metastazių, tolimos metastazės ar pažangius klinikinius etape. RBBP6, DCTPP1, HSPA4 ir ALDOA išraiška visų pirma buvo reikšmingai susijęs su prasta prognoze 300 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. RBBP6 buvo nustatyta, kad nepriklausomas prognozinis veiksnys. Motorikos stimuliuojančio gebėjimas OCUM-12 /SP ląstelių ir OCUM-2MD3 /SP ląstelių buvo slopinamas RBBP6 pervežimas siRNA. Šie duomenys gali pasiūlyti, kad aštuonios baltymai, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA ir KRT18, naudojant lyginamąjį proteomiką analizę, buvo manoma, kad potencialūs CSC markerius skrandžio vėžio. Iš aštuonių kandidačių baltymų, RBBP6 buvo pasiūlyta būti perspektyvus prognostinė biologinis ir terapinis taikinys skrandžio vėžio

nurodomoji dalis:. Morisaki T Yashiro, M, Kakehashi A Inagaki A Kinoshita H Fukuoka, T et Al. (2014) Lyginamoji Proteomika analizė skrandžio vėžio kamienines ląsteles. PLoS ONE 9 (11): e110736. Doi: 10,1371 /journal.pone.0110736

redaktorius: Laikinumas B. Jelmelandas, Alabamos universitetas Birmingeme, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo 3 Gegužės, 2014 m Priimta rugsėjo 16, 2014 m Paskelbta lapkričio 7 d 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Morisaki et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų prieinamumas:. autoriai patvirtina, kad visi duomenys, kuriais grindžiamos išvados visiškai prieinama be apribojimų. Visi atitinkami duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus. Stojimo numeriai baltymų duomenų yra įtraukti kaip UniProt /Swiss-Prot 2 lentelėje

Finansavimas: Šis tyrimas yra dalinai finansuojamas KAKENHI (Grant-in-pagalbos moksliniams tyrimams, Nr 22390262, 23390329 ir 26293307. ), pagal nacionalinio vėžio centro mokslinių tyrimų ir plėtros fondo (23-A-9), taip pat prioritetinių mokslinių tyrimų fondo Osaka City universitete. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Vėžys kamieninės ląstelės (CSCS) yra apibrėžiamas kaip unikalus pogrupį į navikų, kurie turi galimybę inicijuoti naviko augimą ir išlaikyti savarankiškai atnaujinti [1]. Ji buvo pasiūlyta, kad jie gali sukelti priimti skirtingų Lineage vėžinių ląstelių, kurios sudaro naviką, taip pat vaidina svarbų vaidmenį piktybinio progresavimo karcinoma, pavyzdžiui, toli metastazių, pasikartojimo, ir Atsparumas cheminėms [2] - [4]. CSCS iš pradžių buvo nustatyta ūmios mieloidinės [5] leukemija, bet neseniai buvo pranešė, kad egzistuoja įvairių vėžio, įskaitant skrandžio vėžio [6]. Iš CSC žymeklių identifikavimas gali atidaryti naują gydomąjį perspektyvą remiantis atrinktiems šį mažą gyventojų ląstelių [7] pagrindu, [8]. Neseniai buvo pranešta, kad CSCS galbūt nereikia išreikšti savo unikalų žymekliais, pavyzdžiui, aldehidų dehidrogenazės 1 (ALDH1) [9], CD44 [10], [11], ir CD133 [12]. Tačiau daugelis paskelbtų žymenų nėra unikalus CSCS. Kiekybinė išraiška baltymų profiliavimas leidžia efektyviai identifikuoti tikslūs ir atkuriami diferencinė ekspresija vertybių baltymus [13]. Izobarinių žymės santykinę ir absoliučią kiekybinio (iTRAQ) kartu su daugiamatės skysčių chromatografijos (LC) ir masių spektrometrijos tandemas (LC-MS /MS) analizė iškyla kaip galingas metodiką dėl naviko biologinių žymenų paiešką [14]. Mes anksčiau pranešė, kad pusė gyventojų (SP) ląstelės sugeba savarankiškai atnaujinti ir gaminti ne SP ląsteles, ir kad vėžinės ląstelės SP frakcijų turi didelį potencialą tumorogeniš-, tolimos metastazės [3], Atsparumas cheminėms [2]. Tai rodo, kad SP ląstelės, kilusios iš skrandžio vėžio turėti vėžio kamieninių ląstelių-kaip savybes. Todėl šio tyrimo tikslas buvo aptikti naujovišką CSC žymeklį (-us) skrandžio vėžys lyginant tarp tėvų ląstelių proteomes ir kamieninių ląstelių kaip SP ląsteles, buvo žinoma, kad turi turtingą CSC gyventojų [15].

ir medžiagos ir metodai

ląstelių kultūrų

du skrandžio vėžio ląstelių linijas, OCUM-2MD3 [16] OCUM-12 [17], buvo naudojami šiame tyrime. Šios ląstelių linijos buvo kilęs iš pasklidųjų tipo skrandžio vėžio. Kultūra sąlyga buvo auginamas Dulbecco modifikuota Eagle terpė (DMEM; niko, Kioto, Japonija) su 10% šilumos inaktyvuotas serumas iš veršiuko embriono (FCS gyvybė Technologies, Grand Island, NY) penicilino ir streptomicino ir 0,5 mM natrio piruvato, ir inkubuojamos 37 ° C temperatūroje. OCUM-12 /SP ir OCUM-2MD3 /SP ląstelių linijos buvo SP ląstelių, kurios buvo įvertintos srauto citometrijos analizę, naudojant Hoechst 33342 iš jų tėvų ląstelių linijų, OCUM-2MD3 ir OCUM-12 atitinkamai. Rūšiavimo buvo atliekamas tris kartus, siekiant nustatyti paukščių populiaciją SP-praturtintas ląstelių. Po trijų mėnesių inkubacinio periodo po rūšiavimo, OCUM-12 /SP ląstelių (6,5%) ir OCUM-2MD3 /SP ląstelių (12,2%) vis dar atstovauja didelį procentą SP frakcija, palyginti su tėvų OCUM-12 (3.2% ) ir OCUM-2MD3 (6,3%) ląstelių (S1 paveiksle). Vėliau šie SP-praturtintas ląstelės su stabilaus gyventojų buvo naudojamos ląstelių linijos analizei, kaip buvo pranešta anksčiau [18].

žmogaus audinių pavyzdžiai ir paciento Informacija

Audinių mėginiai buvo gauti iš 300 pacientams, kuriems diagnozuotas skrandžio vėžys leidžiamų operacijų Osakos miesto universitete. 1 lentelė rodo clinicopathologic charakteristikas 300 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Nebuvo 208 vyrų ir 92 pacientai moterys, su vidurine amžius 64 metų (diapazonas, 28-85 metų) ne darbo laiko. Į diagnozės buvo patvirtintos mažiausiai du žmonės. Skirstymas buvo nustatomas pagal Japonijos klasifikavimo skrandžio karcinoma (14 ^{-asis leidimas) [19]. Šis tyrimas patvirtino Osaka City universiteto etikos komiteto (Osaka, Japonija). Parašė informuotas sutikimas donoro buvo gautas naudoti šį mėginio tyrimus.}

Baltymai identifikavimas ir kiekybinis iki QSTAR Elito LC-MS /

vėžinių ląstelių (60 mikrogramų kiekvienas) buvo homogenizuotas ir tada lizuojamos naudojant vieną 100 pL T už lizės buferiniame tirpale (Thermo Scientific) arba 500 pL 9 M karbamido, ir 2% CHAPS lizės buferiniame tirpale su proteazės inhibitorius. Vėliau, ląstelių lizatas buvo po to yra veikiamas pagal ultrasonication. Po acetono kritulių, baltymų koncentracija buvo matuojama BCA Baltymų analizė (Pierce, IL, JAV). Sumažinti, alkilinimo, virškinimas, ir 50 mikrogramų baltymo kiekvienam mėginiui vėliau peptidas ženklinimas buvo atliktas naudojant AB "Sciex iTRAQ Reagentų" Multi-Plex rinkinį (AB Sciex, Concord, ON, Canada) [20]. Į iTRAQ ženklu mėginiai buvo pakraunant į ICAT katijonų mainų kasetė (AB "Sciex). Peptidai eliuojami, kaip šešių frakcijų (1 ml KCl tirpalo 10, 50, 70, 100, 200, ir 350 mm), ir kiekvieno supernatantas buvo išgarinamas per dulkių centrifuguojama. Mėginiai buvo tada gėlinta ir koncentruotą naudojant rugsėjis-PAK Šviesos C18 kasetes (vandenys CORPORATION, Milford, MA), išgarintus per dulkių centrifugos, suspenduojamos 20 pL 0,1% (v /v) skruzdžių rūgšties, ir vėliau užpurškiama ant QSTAR Elite LC -MS /MS. Kiekvienas mėginys buvo paleisti 150 min. MS /duomenys buvo ieškoma Šveicarijos baltymų duomenų baze (žmogaus), naudojant ProteinPilot programinę įrangą (versija 2.0, AB "Sciex) su tripsino nustatytas kaip virškinimo fermentų ir metilo methanethiosulfinate kaip cisteino modifikacijos. Siekiant pašalinti nereikalingus hitai ir lyginamąją kiekybinio, paieškos rezultatai, gauti buvo toliau apdorojami ProteinPilot programinės įrangos, naudojant Paragon algoritmą. Tai lėmė, kad minimalaus rinkinio pateisinamų nustatytas baltymų. Visi pateikti duomenys buvo naudojamas su 95% pasikliovimo atjungimo riba. Santykinis kiekybinę peptidų buvo apskaičiuota kaip dalijant iTRAQ reporterio intensyvumą santykis. Peptidų, santykis, kurios prisideda prie vieno baltymo buvimą buvo vidutiniškai tam, kad santykinis baltymų kiekio nustatymo. Vėliau buvo atlikta ProteinPilot analizė ir išradingumo kelias analizė (PNPP) (Išradingumas sistema, Mountain View, CA). Po to, kai atlikti paprastą t-testas ant viena iš apskaičiuotų vidurkio baltymų santykis prieš 1 iki įvertinti baltymo ekspresija pokyčių galiojimo, buvo pranešė, kad p-vertė. buvo laikoma patikima, baltymų santykis su p-vertė yra mažesnė kaip 0,05. Ji turėtų būti žinoma, kad 90% iTRAQ eksperimentinių veikia padaryta anksčiau, standartiniai nuokrypiai baltymų santykis, kuris kyla iš techninių variantų, buvo pranešta, kad mažiau nei 0,3. Todėl, išraiška keičia didesnis nei 1,2 karto arba mažiau nei 0,8 karto normalizuotų ekspresijos lygių buvo laikomas prie techninės pokyčių ribos. Mes taip pat atliko ne žymėto analizę ir nustatėme, baltymų buvimą tik per OCUM-12 /SP ląstelių ir OCUM-2MD3 /SP ląsteles, bet ne pagal tėvų ląstelių [21]. Kiekvienas mėginys buvo paleisti du kartus. Taikomas LC-MS /egzaminas kartu su iTRAQ technologija buvo pranešta kaip patikimas kiekybinis baltymų ekspresijos, yra dar jautresnis nei Vakarų dėmė, kuri priklauso nuo taikomų antikūnų tipo [22].

IPA bei atranka baltymai kandidačių

PNPP duomenų pirmiausia naudojama patentuota ontologijos srityje, kurių sudėtyje yra iki 300.000 biologinių straipsnių, įskaitant genų, baltymų, molekulinių ir ląstelinių procesų. Todėl, PNPP dirbo už baltymų molekulinės funkcijas, lokalizacijos analizė. Be to, buvo gauta išsami informacija apie funkcijas ir ląstelių vietas nustatytų baltymų. Remiantis LC MS /MS rezultatus ir PNPP analizes, baltymus, kurie buvo pastebėta, kad per išreikštas SP ląstelių linijų, palyginti su jų atitinkamo dažnio išraiškos tėvų ląstelių linijų, buvo pasirinktas kaip kandidačių biologinių žymenų, skirtų SP ląstelių skrandžio vėžio. Iš tinkluose bendrauja baltymus, taip pat funkcinių grupių ir kelius identifikavimas buvo sukurtas pagal PNPP ir analizė priklauso nuo anksčiau būdinga asociacijos.

Kiekybiniai Realaus laiko atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininė reakcija (PGR )

Skrandžio vėžio ląstelės buvo auginamos. Ir iš viso ląstelių RNR išskirta naudojant RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Karlovi Varai, CA). kDNR buvo paruoštas iš 2 mikrogramai RNR, naudojant atsitiktinius pradmenis (Invitrogen). Norėdami nustatyti lenkimo pokyčius kiekvieno geno, AT-PGR buvo atliekama ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), su komerciškai prieinamas genų ekspresijos tyrimai (taikomieji BIOSYSTEMS) už RBBP6
( Retinoblastoma surišantis baltymas 6
; Hs00544663) HSPA4
(, šilumos šokas 70kDa baltymų 4
; Hs00382884) HSPA9
(, šilumos smūgio 70 kDa baltymas 9
; Hs00269818) GLG1
(Goldžio glikoproteino 1; Hs00939452) DCTPP1
( dCTP pirofošfatazei 1
; Hs00225433) VPS13A
( vacuolar baltymų rūšiavimas 13 homologą
; Hs00362891) CK18 (keratino 18
; Hs028277483) ALDOA (aldolazės A
; Hs00605108), CD44
(Hs01075862) CD133
(Hs01009250) ir nanog
(Hs02387400). GAPDH (sigma) buvo naudojamas kaip vidinis etaloninis normalizuoti iRNR lygiui. Slenksčio ciklas (CT) vertės buvo naudojama apskaičiuoti santykinius raiškos santykį tarp kontrolės ir apdorotų ląstelių.

Vakarų dėmė analizė

išraiška lygis RBBP6 ir ALDOA į vėžinių ląstelių buvo tiriama, kaip nurodyta toliau. Mobilaus ryšio Lizatai renkami po įvairių procedūrų. Po to, kai baltymo koncentracija kiekvieno mėginio buvo pakoreguotas, elektroforezės buvo atliekami naudojant 10% Tris /Gly geliai (Life "technologijas, Carlsbad, CA). Baltymų juostos gauti buvo perkelti į Immobilon-P Transfer membranos ( "Amersham, Aylesbury, Jungtinė Karalystė). Tada membrana buvo padėtas PBS-T tirpale, kuriame yra anti-RBBP6 (WH0005930M1, Sigma-Aldrich, Misūrio valstija, JAV), anti-ALDOA (HPA004177, ATLAS), ir anti-beta-aktino (1:300 skiedimą; Sigma- Aldrich), ir leidžiama reaguoti kambario temperatūroje 2 valandas. Specifinių baltymų kiekvieno lizate koncentracija buvo aptikta po autoradiografiją glaudesnio cheminės liuminescencijos naudojant ECL plius (Amersham).

sirnr Design

dėl sekas RBBP6
mažas kištis RNR (siRNR) yra skirtos taip: SI RBBP6
jausmas, 5'-GAAAGAAGAAUAUACUGAUtt-3 "; Priešprasminis, 5'-AUCAGUAUAUUCUUCUUUCgt-3 "ir nontargeting siRNR (neigiamas-siRNR) buvo įsigytas iš Ambion (Life technologies", Carlsbad, CA) .OCUM-12 /SP ir OCUM-2MD3 /SP ląstelių buvo paruošti 60% santakoje į šešių bei patiekalai. Transfekcija mišinys paruoštas pridedant 150 įxL Opti-Mem įskaitant 9 įxL Lipofectamine RNR IMAX Regant (Life technologies ") iki 150 įxL Opti-Mem įskaitant 90 pmol siRNA ir inkubacijai 5 min kambario temperatūroje. Pagaliau, pirmiau transfekcija mišinys buvo įtraukta į paruošto šešių šulinėlių indą. Dvidešimt keturias valandas po transfekciją, AT-PGR buvo atliekama.

žaizdų gijimo Analizės

Vėžio ląstelės buvo auginamos 96-duobučių lėkštelėse (Esenas instrumentai, Birmingemas, Jungtinė Karalystė). Po ląstelės pasiekė pusiau santaką, žaizda buvo sukurta ląstelių monosluoksnio su 96-gerai WoundMaker (Esenas biologijos mokslų, MI, JAV). Subraižyti laukai buvo imtasi nuotraukoje kas 3 valandas ir buvo stebimas su Incucyte Live Mobilusis Imaging System ir programinės įrangos (Essen priemones). Ląstelių migracijos laipsnis buvo analizuojami 24 valandos po to, kai žaizdų gydymui kaip žaizdų santakoje procentais. 4 laukų vidutinis apskaičiuotas kaip mėginio vertės.

invazija Analizės

naudojo chemotaxicell kameras (Kubota, Osaka, Japonija) su 12-mikronų akučių membraninį filtrą padengtas 50- mikrogramų Matrigel (bendri moksliniai tyrimai Co Bedford, MA). Kamera (viršutinė komponentas) buvo dedamas į 24-šulinėlių auginimo plokštelės (mažesnės komponentas). Skrandžio vėžio ląstelės buvo pakartotinai sustabdyta, kad būtų kad galutinė koncentracija būtų 5 × 10 ^{3 ląstelių /ml. Be to, 500-iL mažesnės komponentai. Po inkubacijos 48 h, vėžio ląstelės ant viršutinio paviršiaus membranos buvo pašalintas nušluostydami ir nudažomi hematoksilinu. Vėžio ląstelės, kad įsiveržė pro filtrą, padengto Matrigel į apatinį membranos buvo rankiniu būdu skaičiuojami pagal mikroskopu, kurio × 200 priartinimas. Šeši atsitiktinai pasirinktose srityse buvo skaičiuojami už kiekvieną testą. Keturių srityse vidutinis buvo apskaičiuota kaip mėginio vertės. Kiekvienai grupei, kultūra buvo atliekamas tris kartus.}

įteisinimas baltymo ekspresija imunohistocheminiu

imunohistocheminis buvo atliktas formalinu fiksuotos, parafino-embedded audinių mėginių, kurie buvo deparaffinized į ksileno ir dehidratuoti per rūšiuojami etanolis. Skyriai buvo kaitinamas 10 minučių 105 ° C temperatūroje autoklave tikslinėse Retrieval tirpalas (DaKo). Mėginiai vėliau buvo inkubuojamos su 3% vandenilio peroksido blokuoti endogeninio peroksidazės aktyvumo. Šie antikūnai buvo naudojami imunohistocheminio procese: Anti-RBBP6 (Retinoblastoma privalomas baltymų 6; WH0005930M1, 6:1000; Sigma-Aldrich), anti-GLG1 (Goldžio glikoproteino 1; HPA010815, 1:80 ATLAS), anti-VPS13A (vacuolar baltymų rūšiavimas 13 homologą A; NBP1-85642, 1:500; Novus biologinių), anti-ALDOA (aldolazės A, fruktozės-bisfosfato; HPA004177, 1:400; ATLAS), anti-DCTPP1 (dCTF pirofošfatazei 1; HPA002832, 1:200; ATLAS), anti-HSPA9 (šilumos smūgio 70 kDa baltymas 9; HPA000898, 1:200; ATLAS), anti-HSPA4 (šilumos smūgio 70kDa baltymų 4; HPA010023, 1:200; ATLAS), ir anti-KRT18 (keratino 18; ab668, 1:500; Abcam). Mėginiai buvo inkubuojamos su kiekvienu antikūno per naktį maždaug 4 ° C temperatūroje. Po to, mėginiai buvo inkubuojamos taikomas imunoglobulino G 10 minučių, po to tris plovyklose su PBS. tada visi mėginiai buvo gydomi streptavidino-peroksidazės reagentu, ir inkubuojami PBS diaminobenzidinas ir 1% vandenilio peroksido (tūris /tūris), o po to counterstaining su Mayer hematoksilinu.

Imunohistocheminis įvertinimas

RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA ir KRT18 ekspresijos lygis buvo įvertintas tiek dažymo ir proporcingai tamsintas vėžinių ląstelių intensyvumo. Dažymo intensyvumas buvo įmuštas nuo 0-3 skalę (0 = ne, 1 = švelniu, 2 = vidutinio sunkumo, 3 = intensyvus). Dažymo proporcijos pelnė nuo 0-4 skalėje (procentinė skyrėsi su kiekvienu antikūnų), remiantis Teigiamai tamsintas ląstelių procentais. Todėl, galutinis dažymo rezultatas, kuri buvo apskaičiuota kaip dažymo intensyvumo balas kartotinio ir dažymo proporcingai rezultatas, būtų nuo 0-12 mastu. buvo laikomi ekspresijos lygis DCTPP1 teigiamas, kai jis gavo iš 3. Expression lygių HSPA4 rezultatas buvo laikomas teigiamu, kai ji gavo rezultatas 6. Expression lygių ALDOA, KRT18, VPS13A ir GLG1 buvo laikomas teigiamu, kai kiekvienas gavo rezultatas 8. RBBP6, vertinimo, iš kurių tik dažymo dalis rezultatas buvo naudojami skaičiuojant, buvo laikomas teigiamu, kai ji gavo rezultatas 3. HSPA9, vertinimo, iš kurių tik raiškos intensyvumas rezultatas buvo naudojami skaičiuojant, buvo laikomas teigiamu, kai ją gavo rezultatas 3. Visi vertinimų buvo du stebėtojai, kurie nežinojo klinikinių duomenų ir rezultatų. Kai buvo rastas prieštaringa vertinimas tarp dviejų nepriklausomų stebėtojų, skaidrės buvo tikrinamas ir perkainota po diskusijų.

Statistinė analizė

buvo naudojamas SPSS programa (SPSS Japonija, Tokijas, Japonija) duomenų analizė. Statistinis reikšmingumas tarp baltymų raiškos ir įvairių klinikos kintamųjų, įskaitant amžių, lytį, makroskopinis tipo, naviko diferenciacijos, skaičiaus rezekcijos limfmazgiuose, ir tipo operacijos asociacijos (D1 arba D2 skrandžio pašalinimas) buvo įvertintas naudojant Fišerio ir Či -squared testai. Išgyvenimo kreivės buvo apskaičiuotos iš operacijos dieną į mirties metu arba paskutinės tolesnių stebėjimo naudojant Kaplan-Meier metodu. Be to, bet kokie skirtumai tarp išgyvenimo kreivių buvo vertinami naudojant log-rank testą. Daugiamatė analizė buvo atlikta pagal Cox regresijos modelį, siekiant nustatyti ryšį tarp klinikos kintamųjų ir mirtingumo asociacijas. P-vertės < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas

Rezultatai

skrandžio vėžio ląstelių linijas stemness

SP ląstelių procentas buvo didesnis OCUM-12. /SP ir OCUM-2MD3 /SP ląstelių negu jų pagrindinės OCUM-12 ir OCUM-2MD3 ląstelių (S1 paveiksle). Vėžys kamieninių ląstelių žymenų SP ląstelių, OCUM-12 /SP ir OCUM-2MD3 /SP, pavyzdžiui, CD44, CD133, ir nanog, buvo analizuojami RT-PGR. Sąvoka lygis šių žymeklių buvo gerokai padidėjo tiek SP ląstelių linijų, lyginant su jų tėvų ląstelių linijas (S2 pav). Iš sferinis kolonija skaičius buvo gerokai didesnis tiek OCUM-12 /SP ir OCUM-2MD3 /SP ląstelių nei jų tėvų OCUM-12 ir OCUM-2MD3 ląstelių (duomenys neparodyti).

aptikimas Baltymai kandidačių

Mes ištirti, ar baltymai buvo skirtingai arba savarankiškai išreikšti SP ląstelių ir palyginti mūsų išvadas tiems iš jų tėvų ląstelių naudojant QSTAR Elite LC-MS /MS. Analizuojant biologinius procesus ir su 95% pasikliovimo atjungimo riba ir p < 0,05, mes nustatė, kad baltymai iš tiesų buvo skirtingai išreikšta. Šių duomenų rezultatai pateikti 1 paveiksle Dauguma baltymų buvo per-išreikšta naviko ląstelių (1A pav) citoplazmoje. P vertė įtraukta į išradingumą analizės nurodyta S1 lentelėje. Šie baltymai buvo nustatyta, kad tai susiję su korinio procesų, pavyzdžiui, ląstelių žūties, metabolizmo, ląstelių organizacijos, DNR metabolizmo, baltymų skilimo, ir perdirbimo RNR (1B pav). Į viršų kanoninės keliai, susijusios su šių tikslų ir juos nustatyti pagal PNPP rodomi S2 lentelėje.

palyginti su jų atitinkamų patronuojančiųjų ląstelių, 40 baltymai buvo iki-reguliuojami OCUM-12 /SP ir 35 baltymai buvo iki -regulated į OCUM-2MD3 /SP. Tarp šių baltymų, aštuoni buvo iki reguliuojama abiejose OCUM-12 /SP ląstelių ir OCUM-2MD3 /SP ląstelių, o ne tokios asociacijos buvo pastebėtas tarp jų atitinkamų patronuojančiųjų ląstelių (2 lentelė ir 1c pav). Iš šių aštuonių baltymų, trys baltymai, RBBP6, GLG1, ir VPS13A, buvo nepriklausomai aptikta abiejų SP ląstelių linijų, bet ne jų atitinkamų motininių ląstelių. Penki baltymai, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA ir KRT18, buvo gerokai per išreiškiamas bent 1,2 karto abiem SP ląstelių, palyginti su jų atitinkamų patronuojančiųjų ląsteles.

iRNR raiška lygis tai 8 kandidatės molekulės RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
, ir CK18
buvo padidintas OCUM-12 /SP (9,15 karto, 9.36 kartus, 4.14 kartus, 7,80 karto, 2.08 kartus, 1.46 kartus, 3,44 karto, o 1,99 karto, atitinkamai) ir OCUM-2MD3 /SP (6,15 karto, 1.71 kartus, 2.33 kartus, 2.30 kartus, 2.03 kartus, 1,32 karto, 1,35 karto, o 1,31 karto, atitinkamai) ląstelių, lyginant su tais, iš patronuojančios OCUM-12 ir OCUM-2MD3 ląstelių (1d pav) kontrolę. Vakarų dėmė analizė parodė, kad pasakymas lygis RBBP6 ir ALDOA buvo daug Cum-12 /SP ir OCUM-2MD3 /SP ląstelių, palyginti su tuo OCUM-12 ir OCUM-2MD3 ląstelių (S3 pav.)

apie pateikta 1E pav tinklas buvo sukurtas pagal PNPP ir analizė priklauso nuo anksčiau būdinga ir pranešta baltymų sąveikų. Taigi, RBBP6, kuri buvo pastebėta, kad per išreikštas CSC-kaip SP ląstelių, OCUM-12 /SP ląstelės ir OCUM-2MD3 /SP ląstelės, buvo tiesiogiai susijusi su HSPA4 ir Rb, ir netiesiogiai susijęs su Hsp90 ir TAGLN2. HSPA4, Hsp90 ir TAGLN2 taip pat buvo nustatyta, kad iki-reguliuojami CSC-kaip SP ląstelių.

poveikis siRBBP6 transfekciją dėl migracijos ir invazinių gebėjimų skrandžio vėžio ląstelių

2A paveiksle matyti, kad SI, RBBP6
transfekciją gerokai sumažėjo iRNR išraiška lygį tiek SP ląstelių linijas (OCUM-12 /SP buvo 12%, p < 0,01, OCUM-2MD3 /SP buvo 2,5% psl. < 0,01), kad, palyginti su kad neigiama-siRNA transfekciją. RBBP6
siRNA triuškinantis žymiai invazija (2b pav) ir migracijos aktyvumą (2c pav) sumažėjo tiek SP ląstelių.

Imunohistocheminis vertinimas Baltymai kandidačių ir jų asociacijos su klinikos Savybės

RBBP6, DCTPP1 ir HSPA9 buvo pastebėta, kad pirmiausia turi būti išreikštas citoplazmoje ir branduolyje skrandžio vėžio ląsteles. GLG1, VPS13A, HSPA9, HSPA4, ALDOA ir KRT18 buvo pastebėta, kad pirmiausia turi būti išreikštas citoplazmą (3a pav.) Įprastomis epitelinių ląstelių, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1 ir HSPA9 išraiška buvo rasta tam tikrų epitelio liaukos ląsteles. KRT18 buvo išreikšta daugumos epitelio ląstelių. HSPA4 ir ALDOA išraiška nerastas normalios ląstelės. BBP6, DCTPP1 ir HSPA9 buvo išreikštas citoplazmoje ir branduolyje normalios epitelio ląstelių. GLG1, VPS13A, HSPA9 ir KRT18 buvo pastebėta, kad epitelio ląstelių (3b pav) citoplazmoje.

tyrinėjo tarp ekspresijos lygio aštuonių kandidačių baltymų ir klinikos funkcijų asociacija. Bylų skaičius kiekvienam balą aštuonių tikslų buvo parodyta S3 lentelėje. Šie aštuoni baltymai buvo pasiryžę būti susijęs su potencialiai piktybiniai procesai, tokie kaip tolimos metastazės, limfmazgių (LN) metastazėmis invazija gylis, ar etapas pažangai (3 lentelė). Apskaičiuotos p-reikšmės buvo taip: RBBP6 buvo reikšmingai susijęs su invazijos gylis (p < 0,001), LN metastazių (p < 0,001), nuotoliniam metastazių (p = 0,013), ir klinikinės etape (p < 0,001); GLG1 buvo reikšmingai susijęs tik su tolimos metastazės (p = 0,045). VPS13A buvo reikšmingai susijęs su invazijos gylis (p = 0,005), LN metastazių (p < 0,001), ir stadijos paaukštinimo (p = 0,005); DCTPP1 buvo reikšmingai susijęs su invazijos gylis (p < 0,001), LN metastazių (p < 0,001), nuotoliniam metastazių (p < 0,001), ir stadijos paaukštinimo (p < 0,001); HSPA9 buvo reikšmingai susijęs su invazijos gylis (p < 0,001), LN metastazių (p < 0,001), ir stadijos paaukštinimo (p < 0,001); HSPA4 buvo reikšmingai susijęs su invazijos gylis (p < 0,001), LN metastazių (p < 0,001), nuotoliniam metastazių (p = 0,007), ir stadijos paaukštinimo (p < 0,001); ALDOA buvo reikšmingai susijęs su invazijos gylis (p = 0,034), LN metastazių (p = 0,004), ir etapo pažangos (p = 0,029); ir KRT18 buvo reikšmingai susijęs su invazijos gylis (p = 0,001), LN metastazių (p = 0,001), tolimos metastazės (p = 0,034), ir etapo pažangos (p = 0,004).

Prognozė

Kaplan-Meier sklypai pasiūlė, kad iš aštuonių per išreikštas baltymų, RBBP6, DCTPP1, HSPA4 ir ALDOA, buvo reikšmingai susijęs su prasta išlikimo visiems pacientams (4 paveikslas). Kaupiamasis penkerių metų bendras išgyvenamumas RBBP6 teigiamas atvejais (61%) buvo reikšmingai mažesnė (p = 0,002) nei RBBP6 neigiamas atvejais (78%). Be to, pacientams, kuriems yra III etape, bendras išgyvenamumas RBBP6 teigiamų atvejų buvo gerokai mažiau (p = 0,034), nei kad RBBP6 neigiami atvejais. Pacientų, sergančių DCTPP1-teigiamas navikų (63%), prognozė buvo žymiai prasčiau (p = 0,016) negu DCTPP1-neigiamas navikų (75%). Penkerių metų bendras išgyvenamumas HSPA4 teigiamas atvejais (66%) buvo reikšmingai mažesnė (p = 0,047), nei kad HSPA4 neigiamas atvejais (75%). Penkerių metų bendras išgyvenamumas ALDOA teigiamų navikų eksponuoti per išraiška (61%) buvo reikšmingai prastesnė (p = 0,043), nei kad ALDOA neigiamas navikų (72%). Priešingai, jokių reikšmingų koreliacija nustatyta tarp kitų baltymų ir paciento išlikimo. Po vieną požymį analizės, RBBP6, DCTPP1, HSPA4 ir ALDOA ekspresijos lygis buvo reikšmingai susijęs su prasta prognoze 300 skrandžio vėžiu sergančių pacientų (4 lentelė). Be to, makroskopinę tipas (4 tipas), histologinis tipas (išplitęs), T kategoriją (T2-4), laivų invazija, infiltracija modelį (INF B, C), pilvaplėvės metastazių, ir LN metastazes buvo nustatyta, kad tai reikšmingai susijęs su prasta prognozė. Daugiamatė analizė buvo atlikta naudojant Cox proporcinės rizikos modelis visų reikšmingų kintamųjų pagal vieną požymį analizė. Nuo analizės atlikimo RBBP6 išraiškos (p = 0,023), BORRMANN 4 tipo (p < 0,001), pilvaplėvės teigiamas (p = 0,001), LN metastazių (p = 0,003), ir kepenų metastazių (p = 0,001) buvo patvirtinta, nepriklausomų veiksnių koreliuoja su išlikimo (3 lentelė). Iš aštuonių baltymų, RBBP6 išraiška buvo nepriklausoma prognostinis faktorius.

Diskusijos

skrandžio vėžio rezultatai prastos prognozės dėl dažnų metastazavusiu procesų, pavyzdžiui, LN metastazių ir pilvaplėvės metastazių [23]. CSCS buvo pasiūlyta kaip turintys svarbų vaidmenį piktybinio potencialo vėžinių ląstelių, įskaitant toli metastazių ir Atsparumas cheminėms [4]. Mes nuo nustatė, kad SP ląstelių, gautų iš skrandžio vėžio dalykų turėti šiuos CSC savybes [3]. Mes patvirtino, kad SP panaudotoms ląstelėms šiame tyrime aiškiai išreikštos kandidatas skrandžio vėžio kamieninių ląstelių žymenų, įskaitant CD44 [24], CD133 [25], ir nanog [26] (S2 pav.) Sferoidas kolonija formavimas veikla iš šių SP ląstelių buvo didesnis nei motininių ląstelių [18]. Be to, šios CSC-kaip SP ląstelės rodyti Atsparumas cheminėms į antivėžiniai [2]. Šie rezultatai patvirtino, kad OCUM-12 /SP ląstelės ir OCUM-2MD3 /SP ląstelės gali atstovauti vėžio kamieninių ląstelių panašių savybių. Nuo specialūs žymekliai skrandžio CSCS nebuvo paskelbti kol kas, išaiškinimas konkrečių signalų kelius ir mechanizmų, kuriais pagrįsta CSCS veiksmus gali pagerinti skrandžio vėžio prognozę. Šiame tyrime aštuoni kandidatai CSCS žymekliai buvo identifikuojama proteominius metodus naudojant LC-MS /MS kartu su iTRAQ technologija. Trys baltymai, RBBP6, GLG1 ir VPS13A, buvo aptikta tik SP ląstelių linijas, bet ne jų atitinkamų tėvų ląstelių linijų. Be to, penki baltymai, HSPA9, ALDOA, DCTPP1, HSPA4, ir KRT18, buvo per-išreikštas abiejų SP ląstelių linijų, atsižvelgiant į jų atitinkamų patronuojanti ląstelių linijų. AT-PGR analizė taip pat parodė, kad pasakymas lygis RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
, ir CK18
buvo didelis OCUM-12 /SP ir OCUM- 2MD3 /SP ir, palyginti su pirminio OCUM-12 ir OCUM-2MD3 kontrolę. Šie baltymai buvo įtariama, kad nauji biologiniai žymenys skrandžio CSCS. Ši hipotezė buvo išbandytas imunohistocheminiu analizės 300 skrandžio vėžio atvejų.

RBBP6 yra branduolinės baltymas, kuris yra žinoma, kad būti susijęs ir gali būti susijusios su p53, ir retinoblastoma privalomas Q baltymas 1, (RBQ-1) [ ,,,0],27]. RBBP6 sąveikauja su naviko slopintuvas baltymų p53 ir Rb, ir vaidina svarbų vaidmenį apoptozės indukcija taip pat reguliuojant ląstelių ciklą [28], [29]. RBBP6 jungiasi prie laukinio tipo p53 baltymų, bet ne p53 mutantai [30]. Taip pat buvo įrodyta, kad skatinti naudoti MDM2 privalomas [31], kuri yra E3 Ubikvitino ligazės kad tikslai p53 [32], ir kištis į jo gebėjimą transactivate tikslinius genus [33]. Up-reguliavimas RBBP6 buvo stipriai koreliuoja su naviko progresavimo stemplės vėžio ir gimdos kaklelio vėžio [32]. Šiame tyrime RBBP6 išraiška buvo susijęs su "T" kategorijos vėžio Kalbant invazijos gylio, toli metastazių, limfmazgių metastazių ir klinikinės stadijos. Be to, RBBP6 išraiška buvo reikšmingai susijęs su prasta išlikimo pacientams visuose etapuose, ypač III etape, todėl daryti išvadą, kad RBBP6 buvo, kaip nepriklausomas faktorius dėl išlikimo. Mes atlikome RBBP6
siRNA triuškinantis iš RBBP6
geno naudojant OCUM-12 /SP ląsteles ir OCUM-2MD3 /SP ląsteles šiame tyrime.

• PLoS ONE: Photoimmunotherapy skrandžio vėžio peritoninės karcinomatoze pelių modelis
• PLoS Genetics: gemalo mutacijos MAP3K6 yra susiję su familiarioji skrandžio vėžio