PLoS ONE: Komparativna Proteomika Analiza rak želuca matičnih Cells

Sažetak pregled

Rak matične stanice (eksplozivnim dizanjem utega) su odgovorni za napredovanje raka, metastaza, i recidiva. Do danas, specifični markeri eksplozivnim dizanjem utega ostati neotkriveno. Cilj ovog istraživanja bio je utvrditi nove biomarkera želučanih eksplozivnim dizanjem utega za kliničku dijagnozu pomoću proteomici tehnologije. CSC-slične SP stanice OCUM-12 /SP stanice OCUM-2MD3 /SP stanica i njihovih roditeljskih OCUM-12 stanice i OCUM-2MD3 stanice korištene su u ovoj studiji. Proteinski lizat iz svake stanične linije su analizirani pomoću QSTAR Elite tekućinskom kromatografijom s masenom spektrometrijom, zajedno s Izobarno oznake za relativnu i apsolutnu određivanjem tehnologije. Proteini kandidati otkriven proteomika tehnologije su potvrđene od strane imunohistokemijske analize 300 želučanog karcinoma. Na temelju rezultata LC-MS /MS, osam proteina, uključujući RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA i KRT18, bili su up-regulirana u oba OCUM-12 /SP stanica i OCUM-2MD3 /SP stanice u usporedbi sa njihovim odgovarajućim roditeljskim stanicama. RT-PCR analiza pokazala je da je razina ekspresije RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1 pregled i CK18 pregled je bio visok u OCUM-12 /SP i OCUM-2MD3 /SP, u usporedbi s kontrolom matičnog OCUM-12 i OCUM-2MD3. Ovi proteini su značajno povezane s naprednim invazije dubine, limfnih čvorova metastaza, udaljenim metastazama ili naprednom fazi kliničkog ispitivanja. RBBP6, DCTPP1, HSPA4 i ALDOA izraz posebno značajno su povezane s lošom prognozom u bolesnika s karcinomom želuca 300. RBBP6 je određen da bude nezavisna prognostički čimbenik. Sposobnost pokretljivost stimulaciju od OCUM-12 /SP stanica i OCUM-2MD3 /SP stanica je inhibiran RBBP6
siRNA. Ovi rezultati bi se moglo zaključiti da su osam proteini, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA i KRT18, koristeći komparativnu proteomics analize, su smatrali da potencijalni CSC markeri raka želuca. Proteina osam kandidata RBBP6 predložena biti obećavajuća prognostičkim biomarkera i terapeutski cilj za rak želuca pregled

Izvor. Morisaki T, yashiro M Kakehashi A, Inagaki A, Kinoshita H, Fukuoka T, et al. (2014) Komparativna Proteomika Analiza rak želuca matičnih stanica. PLoS ONE 9 (11): e110736. doi: 10,1371 /journal.pone.0110736 pregled

Urednica: Anita B. Hjelmeland, Sveučilište Alabama u Birminghamu, Sjedinjene Američke Države Netlogu

Primljeno: 3. svibnja 2014; Prihvaćeno: 16. rujna 2014; Objavljeno: 7. studenoga 2014 pregled

Copyright: © 2014 Morisaki et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Data Dostupnost:. The autori potvrđuju da su svi podaci na kojima se temelji nalaze u potpunosti na raspolaganju bez ograničenja. Svi relevantni podaci u radu i njegove popratne podatke datoteke. Pristupni brojevi za podatke proteina su uključeni kao UniProt /Swiss-Prot u tablici 2. pregled

Financiranje: Ova studija je djelomično financira KAKENHI (dodjeljivanje pomoći za znanstvena istraživanja, br 22390262, 23390329 i 26293307. ), od strane National Cancer Centar za istraživanje i razvoj fonda (23-a-9), te istraživački prioritet fondu Sveučilišta Osaka City. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Rak matične stanice (eksplozivnim dizanjem utega) se definira kao jedinstvena subpopulacija u tumorima koji posjeduju sposobnost da pokrene rast tumora i održati [1] samoobnovu. Predloženo je da se oni mogu izazvati heterogenu liniju stanica raka koje tvore tumor i igraju važnu ulogu u malignim napredovanje karcinoma, kao što su udaljenim metastazama, recidiva te kemijska otpornost [2] - [4]. Eksplozivnim dizanjem utega su početno identificirana akutne mijeloične leukemije [5], a nedavno su izvijestili da postoji u širokom rasponu oblika raka, uključujući rak želuca [6]. Identifikacija CSC markera može otvoriti novu terapeutsku perspektivu na temelju selektivno ciljaju tu malu populaciju stanica [7], [8]. Nedavno je objavljeno da eksplozivnim dizanjem utega možda ne izražavaju svoje jedinstvene oznake, kao što je aldehid dehidrogenaza 1 (ALDH1) [9], CD44 [10], [11], i CD133 [12]. Međutim, mnogi od objavljenih markeri nisu jedinstveni u eksplozivnim dizanjem utega. Kvantitativna ekspresija proteina profiliranje omogućuje učinkovitu identifikaciju preciznih i ponovljivih diferencijalne ekspresije vrijednosti za proteine ​​[13]. Izobarno oznake za relativnu i apsolutnu kvantifikaciju (iTRAQ) u kombinaciji s višedimenzionalne tekućinskom kromatografijom (LC) i masenom spektrometrijom (LC-MS /MS) analiza se pojavljuje kao snažan metodologije u traženju tumora biomarkera [14]. Mi smo ranije izvijestili da su strana populacija (SP) stanice su u mogućnosti kako bi se obnovile i proizvode koji nisu SP stanice, te da su stanice raka u frakcijama SP posjeduju visok potencijal iu torn smjeru, udaljena metastaza [3] i kemijska otpornost [2]. To sugerira da SP stanice karcinoma želuca imaju rak matičnih stanica, kao što su svojstva. Stoga je cilj ovog istraživanja bio je otkriti novi CSC marker (e) od raka želuca usporedbom proteome među matičnih stanica i matičnih stanica nalik na SP stanice koje su poznate da imaju bogatu CSC stanovništva [15].

Materijali i metode pregled

staničnim kulturama

Dvije stanične linije raka želuca, OCUM-2MD3 [16] i OCUM-12 [17], a koristi se u ovom istraživanju. Ove stanične linije su dobivene iz difuzno tipa raka želuca. Stanje kulture uzgaja u Dulbeccovom modificiranom Eagle mediju (DMEM, Nikken, Kyoto, Japan) uz 10% toplinski inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma (FCS, Life Technologies, Grand Island, NY), penicilina i streptomicina, te 0.5 mM natrij piruvat, i inkubira na 37 ° C. OCUM-12 /SP i OCUM-2MD3 /SP stanične linije bile SP stanice koje su vrednovani od strane analize protočnom citometrijom pomoću Hoechst 33342 od njihovih staničnih linija roditelj, OCUM-2MD3 i OCUM-12, respektivno. Sortiranje se vrši tri puta uspostaviti stabilnu populaciju SP-obogaćena stanica. Nakon tri mjeseca inkubacije razdoblje nakon sortiranja, OCUM-12 /SP stanice (6,5%) i OCUM-2MD3 /SP stanice (12,2%) i dalje je predstavljao visoki postotak udjela SP, u odnosu na roditelja OCUM-12 (3,2% ) i OCUM-2MD3 (6,3%) stanice (Slika S1). Nakon toga, ove stanice SP-obogaćena sa stabilne populacije su stanične linije korištene za analizu, kao što je ranije opisano [18]. Pregled

ljudsko tkivo Uzorci i Uputu o

tkiva Uzorci su dobiveni od 300 pacijenata s rakom želuca dozvoljenih operacija na Sveučilištu Osaka City dijagnoze. Tablica 1 prikazuje kliničko- karakteristike pacijenata oboljelih od raka želuca 300. Bilo je 208 muških i 92 ženskih bolesnika, s medijanom dobi od 64 godina (raspon 28-85 godina) u vrijeme operacije. Se dijagnosticira su potvrđene od strane najmanje dvije osobe. Inscenacije je određena u skladu s japanskim klasifikaciji želučanog karcinoma (14 ^{th izdanje) [19]. Ova studija je odobren od strane Osaka City University etičkog povjerenstva (Osaka, Japan). Pismeni informirani pristanak od donora dobiven za korištenje ovog uzorka u istraživanju. Pregled}

Proteini Identifikacija i kvantifikacija by QSTAR Elite LC-MS /MS

stanice raka (60 ug svaki) su homogenizirani i zatim lizirane korištenjem bilo 100 jal T-pO puferu za lizu (Thermo Scientific) ili 500 uL 9 M ureje i 2% CHAPS pufera za lizu s inhibitorom proteaze. Nakon toga, stanični lizat zatim je obrađena s ultrazvukom. Nakon taloženja acetona, koncentracije proteina su mjerene BCA Protein Assay (Pierce, IL, USA). Redukcije, alkilacije, probavu, i nakon toga peptid označavanje 50 ug proteina za svaki uzorak provedena je korištenjem AB Sciex iTRAQ reagens Multi-Plex Kit (AB Sciex, Concord, ON, Canada) [20]. U iTRAQ obilježeni uzorci su stavljeni na ICAT izmjenom kationa uloška (AB Sciex). Peptidi su eluirani kao šest frakcija (1 mL otopinom KCl od 10, 50, 70, 100, 200 i 350 mm), a supernatant je svaki uparen u vakuum centrifugi. Uzorci su zatim odsoljen i koncentrirani pomoću Sep- Pak Light C18 patrone (Waters Corporation, Milford, MA), upareni u vakuum centrifugi, resuspendirane u 20 uL 0,1% (v /v) mravlje kiseline, i nakon toga nanesena na QSTAR Elite LC -MS /MS. Svaki uzorak je tijekom 150 minuta. MS /MS podaci su tražili i prema švicarskom Protein baze podataka (ljudski) pomoću ProteinPilot softvera (verzija 2.0, AB Sciex) s tripsina postavljen kao probavu enzima i metil methanethiosulfinate kao cistein izmjene. Kako bi se uklonili suvišne hitove i komparativnu kvantifikaciju, rezultati pretraživanja dobiveni su dalje obrađivati ​​ProteinPilot softvera pomoću Paragon Algoritam. To je rezultiralo minimalnim skupom opravdanih identificiranih proteina. Sve prijavljenih podataka korišten je s 95% pouzdanosti cut-off limit. Relativna kvantificiranje peptida je izračunat kao omjer dijeljenjem reporterski intenzitet iTRAQ. Omjeri peptida koji podržavaju postojanje jednog proteina je izračunat prosjek za relativnu proteina kvantifikaciju. Nakon toga, ProteinPilot analiza i domišljatosti put analiza (IPA) (domišljatosti sustava, Mountain View, CA) obavljene su. Nakon izvođenja Simple t-testa na jednoj od izračunatih prosječne omjere bjelančevina protiv 1. procijeniti valjanost izraz promjena proteina, p-vrijednost je prijavljen. omjer proteina s p-vrijednost koja je manja od 0,05 smatra se pouzdanim. Treba znati da je u 90% iTRAQ eksperimentalne cikluse ranije učinili, standardne devijacije omjerima bjelančevina, koje proizlaze iz tehničkih varijacija, su prijavili da se manje od 0,3. Prema tome, izraz mijenja veći od 1,2 puta ili manje od 0,8 puta za normalizaciju razine ekspresije se smatralo da su izvan raspona tehničke varijabilnosti. Također smo proveli neoznačenog analiza je i detektirati prisutnost proteina samo unutar OCUM-12 /SP stanica i OCUM-2MD3 /SP stanice, ali ne u roditeljskim stanicama [21]. Svaki uzorak je dvostruko. Primijenjena LC-MS /MS ispitivanje zajedno s iTRAQ tehnologije su izvijestili kao pouzdan kvantitativne metode za ekspresiju proteina, što je još osjetljiviji od western blot što ovisi o vrsti primijenjenih antitijela [22]. Pregled

IPA i odabir proteina kandidatima pregled

Baza IPA prvenstveno se koristi na području vlasničkih ontologije, koji sadrži do 300.000 bioloških videa, uključujući gena, proteina, molekularnih i staničnih procesa. Dakle, IPA je bio zaposlen za analizu proteina molekularne funkcije, lokalizacije. Osim toga, dobiven detaljne informacije o funkcijama i stanične lokacije identificiranih proteina. Temelju rezultata LC MS /MS i analize IPA, proteine ​​koji su opažene biti prekomjerno eksprimiran kod SP staničnih linija, u usporedbi s njihovim odgovarajućim učestalosti ekspresije u roditeljskih staničnih linija, su odabrani kao biomarkera kandidata za SP stanice raka želuca. Identifikacija mreže interakcije proteina, kao i funkcionalne skupine i putevi su generirani od strane IPA-e, a analiza ovisi o prethodno karakterizira udruga.

Kvantitativna realnom vremenu reverzne transkripcije-lančana reakcija polimeraze (RT-PCR ) pregled

Želučani stanice raka su kultivirane. I ukupna stanična RNK je ekstrahirana korištenjem RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Carlsbad, CA). cDNA je pripremljena iz 2 ug RNA korištenjem nasumičnih početnika (Invitrogen). Da bi se odredilo fold promjene u svakom genu, RT-PCR na ABI Prism 7000 (tnom City, CA), s izrazom testovima komercijalno dostupni gen (Applied Biosystems) za RBBP6 pregled ( retinoblastom vezujući protein 6 pregled, Hs00544663), HSPA4 pregled ( toplinskog šoka 70 kDa teški protein 4 pregled, Hs00382884), HSPA9 pregled ( toplinskog šoka 70 kDa protein 9 pregled, Hs00269818), GLG1 pregled (Golgijev glikoproteina 1; Hs00939452), DCTPP1 pregled ( dCTP Pirofosfatazu 1 pregled; Hs00225433), VPS13A
( vakuolska protein sortiranje 13 homologa
; Hs00362891), CK18 (keratin 18 pregled, Hs028277483), ALDOA (aldolaza A Netlogu; Hs00605108), CD44 pregled (Hs01075862), CD133 pregled (Hs01009250) i NANOG pregled (Hs02387400). GAPDH (SIGMA) je korišten kao interni standard za normalizaciju razine mRNA. Prag ciklusa (Ct) vrijednosti su korištene za izračunavanje relativnih omjera ekspresije između kontrolnih i tretiranih stanica. Pregled

Western blot analiza pregled

razina ekspresije RBBP6 i ALDOA u stanicama raka ispitana je kako slijedi. Stanični lizati su sakupljene nakon različitih tretmana. Nakon podesi koncentracija proteina iz svakog uzorka, elektroforeza je izvedena uz upotrebu 10% Tris /Gly gela (Life Technologies, Carlsbad, CA). Proteinske vrpce dobivene su prebačene u Immobilon P-Transfer membranu (Amersham, Aylesbury, UK). Zatim se membrana je stavljen u PBS-T otopine koja sadrži anti-RBBP6 (WH0005930M1, Sigma-Aldrich, MO, SAD), anti-ALDOA (HPA004177, Atlas) i anti-p-aktin (1:300 razrjeđivanje; Sigma Aldrich), i ostavi da reagira na sobnoj temperaturi tijekom 2 sata. Razine specifičnih proteina u svakom lizat su detektirani hemiluminiscencija korištenjem ECL Plus (Amersham), a zatim autoradiografijom. Pregled

Mali ometa RNA dizajn pregled

sekvence za RBBP6 pregled mala ometa RNA (siRNA) dizajnirani su kako slijedi: si RBBP6 pregled smisla, 5'-GAAAGAAGAAUAUACUGAUtt-3 '; Antisens, 5'-AUCAGUAUAUUCUUCUUUCgt-3 ', i nontargeting siRNA (negativni siRNA) se nabavlja od Ambion (Life Technologies, Carlsbad, CA) .OCUM-12 /SP i OCUM-2MD3 /SP stanica pripremljeni su na 60% konfluentnosti u šest jažica. Transfekcijska smjesa je pripravljena dodavanjem 150 L Opti-MEM uključujući 9 ul Lipofectamine RNA Imax Regant (Life Technologies) u 150 uL Opti-MEM uključuje 90 pmol siRNA i inkubiranjem 5 minuta na sobnoj temperaturi. Konačno, gornji Transfekcijska smjesa se doda pripremljenu šest jažica posude. Dvadeset i četiri sata nakon transfekcije, RT-PCR. Pregled

zacjeljivanja rana Test pregled

Stanice raka su uzgajane u 96 jažica (Essen instrumenti, Birmingham, Velika Britanija). Nakon što su se stanice dosegla polu-ušće, rana je nastao u staničnog s 96 i po WoundMaker (Essen biomedicine, MI, USA). Ogreban polja su odvedeni na slici svaka 3 sata i praćena je s Incucyte live-Cell Imaging sustava i softvera (Essen instrumentima). Stupanj stanične migracije je analiziran 24 sata nakon liječenja rana kao postotak rane spajanja. Srednja vrijednost od 4 polja je izračunata kao vrijednost uzorka. Pregled

Test invazije pregled

Koristili smo chemotaxicell komore (Kubota, Osaka, Japan) uz 12-um pora membranskog filtera obložene 50- J..lg Matrigel® (Collaborative Research Co, Bedford, MA). Komora (gornja komponenta) stavljen je u pločici za kulture 24 jažica (niži sastojak). Želučani stanice raka su resuspendirane do konačne koncentracije od 5 x 10 ^{3 stanica /ml. Dalje, 500-ul niže komponente. Nakon inkubacije od 48 h, stanice raka na gornjoj površini membrane su skinute brisanjem i obojeni s hematoksilinom. Stanice raka koje su izvršile invaziju kroz filter obložen Matrigel u donjoj membrani su ručno izbrojene pod mikroskopom na × 200 povećanjem. Šest nasumično odabranih polja su mjerene na svakom testu. Srednja vrijednost četiri polja je izračunata kao vrijednost uzorka. Za svaku skupinu, kultura je rade po tri puta. Pregled}

Validacija Protein Expression imunohistokemijski pregled

imunohistokemija je provedena na formalinom fixed, paraffin-embedded uzoraka tkiva koji su deparafmizirani u ksilenu i dehidrirani putem ocjenjuju etanol. Sekcije su potom zagrijava tijekom 10 minuta na 105 ° C u autoklavu na ciljani dohvat Solution (Dako). Uzorci su zatim inkubirani s 3% -tnim vodikovim peroksidom do blokiranja endogene peroksidaze. Sljedeći Antitijela su korištena u imunohistokemijske postupku: anti-RBBP6 (retinoblastom vezujući protein 6, WH0005930M1, 6:1000, Sigma-Aldrich), anti-GLG1 (Golgijev glikoprotein 1, HPA010815, 1:80, proizvođač: Atlas), anti-VPS13A (vakuolarne protein sortiranje 13 homolog A; NBP1-85642, 1:500, Novus Biologicals), anti-ALDOA (aldolaza A, fruktoza-bisfosfat; HPA004177, 1:400, proizvođač: Atlas), anti-DCTPP1 (dCTP pirofosfatazom 1; HPA002832, 1:200, ATLAS), anti-HSPA9 (toplinskog šoka 70 kDa protein 9; HPA000898, 1:200, ATLAS), anti-HSPA4 (toplinskog šoka 70 kDa teški protein 4; HPA010023, 1:200, ATLAS), i anti-KRT18 (keratin 18; ab668, 1:500; Abcam). Uzorci su inkubirani su sa svakim antitijelom preko noći na oko 4 ° C. Nakon toga, uzorci su inkubirani u predviđen imunoglobulina G tijekom 10 minuta, a nakon tri ispiranja PBS-om. Svi uzorci su zatim tretirani s streptavidin-peroksidaza reagensa i inkubiraju u PBS diaminobenzidin i 1% vodikov peroksid (vol /vol), a zatim s counterstaining Mayerovim hematoksilinom. Pregled

Imunohistokemijska evaluacija pregled

RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA i KRT18 razinama su ocijenjeni od strane intenzitet bojenja i udio obojenih stanica tumora. Intenzitet bojenja je ocijenjen na skali od 0-3 (0 = nema, 1 = blaga, 2 = umjereno, 3 = intenzivan). Bojenje omjeri se boduju na skali od 0-4 (postotak bio drugačiji sa svakog antitijela) na temelju postotka pozitivno obojenih stanica. Dakle, konačni bojenje rezultat, koji je izračunat kao višekratnik rezultat intenziteta bojanja i rezultat bojenja omjeru, bio bi na skali od 0-12. Razina ekspresije DCTPP1 smatrani su pozitivni kada je dobila ocjenu 3. razine ekspresije HSPA4 se smatra pozitivnim, kada je dobila ocjenu 6. razine ekspresije ALDOA, KRT18, VPS13A i GLG1 se smatra pozitivnim ako svaka dobila ocjenu 8. RBBP6, evaluacija koja se koristila samo bojenje udio ocjenu za izračun, smatra pozitivnim ako je dobila ocjenu 3. HSPA9, evaluacija koja je korištena samo semafor intenzitet bojanja za obračun, smatra pozitivnim ako je to dobila ocjenu 3. Sve ocjene su od strane dva promatrača koji su bili svjesni kliničkih podataka i ishod. Kada je pronađen proturječan procjena između dviju neovisnih promatrača, stakalca su rechecked i ponovno procijeniti nakon rasprave. Pregled

Statistička analiza pregled

Softverski program SPSS (SPSS Japan, Tokyo, Japan) se koristi za Analiza podataka. Statistička značajnost od povezanost između ekspresije proteina i raznih kliničkopatološkim varijabli, uključujući dob, spol, makroskopskom tipa, diferencijacije tumora, ukupan broj resected limfnih čvorova, i vrsti operacije (D1 ili D2 gastrektomije) procijenjena je korištenjem Fisher-a i Chi -squared ispitivanja. Krivulje preživljavanja izračunate su iz dana operacije kako bi se u vrijeme smrti ili do posljednjeg follow-up promatranja pomoću Kaplan-Meier metodi. Osim toga, bilo razlike između krivulja preživljavanja su ocijenjeni pomoću log-rank test. Multivarijatne analize provedene su prema Cox regresijska modela kako bi se utvrdilo povezanost između kliničkopatološkim varijabli i smrtnosti. P-vrijednosti od 0,05 smatrana je statistički značajna pregled

Rezultati pregled

stemness staničnih linija karcinoma želuca

Postotak SP stanica bila je viša u OCUM-12. /SP i OCUM-2MD3 /SP stanica nego u njihovom matičnom OCUM-12 i OCUM-2MD3 stanica (Slika S1). Rak matičnih stanica markeri SP stanica, OCUM-12 /SP i OCUM-2MD3 /SP, kao što su CD44, CD133 i NANOG, analizirani su pomoću RT-PCR. Razina ekspresije tih markera značajno je povećan u obje stanične linije SP, u usporedbi sa svojim staničnim linijama roditelja (Slika S2). Broj pakugle kolonije bila je značajno viša u obje OCUM-12 /SP i OCUM-2MD3 /SP stanica od svojih roditelja OCUM-12 i OCUM-2MD3 stanicama (podaci nisu prikazani). Pregled

Detekcija proteina kandidatima

istraživali smo da li proteini su različito ili samostalno izražena u SP stanica, au odnosu naše rezultate s onima njihovih matičnih stanica korištenjem QSTAR Elite LC-MS /MS. U analizi bioloških procesa, a uz 95% pouzdanosti cut-off limit i p < 0,05, utvrdili smo da se proteini doista su različito izražena. Rezultati ovih nalaza su prikazani na Slici 1. Većina proteina su prekomjerno ekspresivne u citoplazmi tumorskih stanica (Slika 1A). P vrijednost uključeni u analizu genijalnost je navedeno u tablici S1. Ovi proteini su određene da se odnosi na stanične procese, kao što je stanična smrt, metabolizam, staničnu organizacije, metabolizam DNA, degradacije proteina, i obradu RNA (Slika 1B). Top kanonska putevi povezani s tim ciljevima i identificirani IPA prikazani su u tablici S2. Pregled

U usporedbi s njihovim odgovarajućim matičnim stanicama, 40 proteini su up-regulirana u OCUM-12 /SP, a 35 proteini su se -regulated u OCUM-2MD3 /SP. Među tim proteinima, bilo osam doregulirani u oba OCUM-12 /SP stanica i OCUM-2MD3 /SP stanica, a takav povezanost opažena između odgovarajućih ishodnih stanica (Tablica 2 i Slika 1C). Tih osam proteina, tri proteina, RBBP6, GLG1 i VPS13A neovisno otkrivene su u obje stanične linije u SP, ali ne i u njihovim odgovarajućim roditeljskim stanicama. Pet proteini, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA i KRT18, bile su značajno više-izražen najmanje 1.2 puta u SP stanica u usporedbi s njihovim odgovarajućim matičnim stanicama. Pregled

Razina mRNA od njih 8 molekula kandidati, RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1 pregled i CK18 pregled je povećana u OCUM-12 /SP (9,15 puta, 9,36 puta, 4,14 puta, 7,80 puta, 2,08 puta, 1,46 puta, 3,44 puta, a 1,99 puta, respektivno) i OCUM-2MD3 /SP (6,15 puta, 1,71 puta, 2,33 puta 2,30 puta, 2,03 puta, 1,32 puta 1,35 puta, a 1,31 puta, redom) stanica, u usporedbi s onima iz kontrole matičnog OCUM-12 i OCUM-2MD3 stanica (Slika 1D). Western blot analiza je pokazala da je razina ekspresije RBBP6 i ALDOA bila visoka u CUM-12 /SP i OCUM-2MD3 /SP stanica, u usporedbi s onim OCUM-12 i OCUM-2MD3 stanica (Slika S3). Pregled

mreža sa slike 1E generirana IPA, a analiza ovisi o prethodno karakterizira i prijavljenih proteinskih interakcija. Tako, RBBP6 koje je utvrđeno da prekomjerno izražen u CSC nalik SP stanica OCUM-12 /SP stanice i OCUM-2MD3 /SP stanice izravnoj vezi s HSPA4 i Rb, te posredno povezane s Hsp90 i TAGLN2. HSPA4, Hsp90 i TAGLN2 su također utvrđeno da je viša u CSC-kao što su SP stanica. Pregled

Utjecaj siRBBP6 transfekcije na migraciju i invazivne sposobnosti želučanih stanica raka pregled

Slika 2A pokazuje da si RBBP6 pregled transfekcije značajno smanjen mRNA razina ekspresije obaju SP staničnih linija (OCUM-12 /SP 12%, p < 0.01, OCUM-2MD3 /SP 2,5% p. < 0,01), u usporedbi sa onaj negativni-siRNA ubacivanja. RBBP6 pregled siRNA obaranje značajno smanjila invaziju (slika 2b) i migracijsku aktivnost (Slika 2C) oba SP stanica. Pregled

Imunohistokemijska procjena proteina kandidatima i njihova povezanost s kliničkopatološka obilježja pregled

RBBP6, DCTPP1 i HSPA9 Zapaženo je da se primarno eksprimiraju u citoplazmi i jezgre želuca stanica raka. GLG1, VPS13A, HSPA9, HSPA4, ALDOA i KRT18 Zapaženo je da se primarno eksprimiraju u citoplazmi (Slika 3A). U normalnim epitelnim stanicama, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1 i HSPA9 ekspresije pronađeni su neke stanice u epitelnim žlijezde. KRT18 se eksprimiraju kod većine epitelnih stanica. HSPA4 i ALDOA izraz nije pronađen u normalnim stanicama. BBP6, DCTPP1 i HSPA9 su izraženi u citoplazmi i jezgri normalnih epitelnih stanica. GLG1, VPS13A, HSPA9 i KRT18 zabilježene su u citoplazmi epitelnih stanica (Slika 3b). Pregled

Mi smo istražili povezanost između razine ekspresije proteina osam kandidata i kliničkopatološkim značajke. Broj predmeta u svakom rezultat za osam ciljeva je prikazano u tablici S3. Ovih osam proteini su određena da bude povezan s potencijalno malignih procesa, kao što udaljenim metastazama, limfni čvor (LN) metastaza, dubina invazije, ili napredovanja u fazi (Tablica 3). Izračunate p-vrijednosti su slijedeći: RBBP6 značajno povezan s dubinom invazije (p < 0.001), LN metastaza (p < 0.001), udaljenim metastazama (p = 0,013) i klinički stadij (p < 0.001); GLG1 značajno je povezana samo s udaljenim metastazama (p = 0,045). VPS13A je značajno povezana s dubinom invazije (p = 0,005), LN metastaza (p < 0,001), te napredovanje stage (p = 0,005); DCTPP1 je značajno povezana s dubinom invazije (p < 0,001), LN metastaza (p < 0,001), udaljene metastaze (p < 0,001), i napredovanje stage (p < 0,001); HSPA9 je značajno povezana s dubinom invazije (p < 0,001), LN metastaza (p < 0,001), i napredovanje stage (p < 0,001); HSPA4 je značajno povezana s dubinom invazije (p < 0,001), LN metastaza (p < 0,001), udaljene metastaze (p = 0,007), a napredovanje stage (p < 0,001); ALDOA je značajno povezana s dubinom invazije (p = 0,034), LN metastaza (p = 0,004), a napredovanje stage (p = 0,029); i KRT18 je značajno povezana s dubinom invazije (p = 0,001), LN metastaza (p = 0,001), udaljene metastaze (p = 0,034), a napredovanje stage (p = 0,004). pregled

Prognoza pregled

Kaplan-Meier čestice sugerira da od osam prekomjerno eksprimiranih proteina RBBP6, DCTPP1, HSPA4 i ALDOA, značajno su povezani s lošim preživljavanja kod svih bolesnika (slika 4). Kumulativni pet godina ukupna stopa preživljavanja RBBP6-pozitivnih slučajeva (61%) bila je značajno manja (p = 0,002) nego u RBBP6 negativnih slučajeva (78%). Osim toga, u bolesnika s stadiju III, ukupna stopa preživljavanja RBBP6-pozitivnih slučajeva bila je značajno manja (p = 0,034) nego u RBBP6-negativnih slučajeva. Prognoza bolesnika s DCTPP1-pozitivnih tumora (63%) bio je značajno slabiji (p = 0,016) nego kod DCTPP1 negativnih tumora (75%). Petogodišnji Ukupna stopa preživljavanja HSPA4-pozitivnih slučajeva (66%) bila je značajno manja (p = 0,047) nego u HSPA4 negativnih slučajeva (75%). Petogodišnji Ukupna stopa preživljavanja ALDOA-pozitivnih tumora pokazuju prekomjernu ekspresiju (61%) bila je znatno slabija (p = 0,043) nego u ALDOA negativnih tumora (72%). Nasuprot tome, nema značajne korelacije su promatrane između drugih proteina i preživljavanje pacijenta. Nakon univarijatne analize, RBBP6, DCTPP1, HSPA4 i ALDOA razinama su značajno povezana s lošom prognozom u 300 bolesnika s rakom želuca (Tablica 4). Osim toga, makroskopski tip (tip 4), histološki tip (difuzne), T kategoriju (T2-4), invaziju plovila, prodora uzorak (INF b, c), peritonejsku metastaze, a LN metastaza su bili odlučni da se značajno povezana s loša prognoza. Multivarijatna analiza je provedena pomoću Cox proporcionalnih rizika model za sve značajne varijable u univarijantne analize. Po završetku analize, RBBP6 izrazu (p = 0,023), Borrmann tipa 4 (p < 0.001), peritoneum pozitivan (p = 0,001), LN metastaza (p = 0.003), i jetre metastaza (p = 0,001) su potvrđeni kao nezavisnih faktora korelira s preživljavanjem (Tablica 3). Od osam proteina, RBBP6 izraz lica bio je nezavisni prognostički čimbenik. Pregled

Rasprava pregled

Želučani rezultati raka u lošom prognozom zbog čestih metastatskih procesa, kao što LN metastazama i peritonejsku metastaza [23]. Eksplozivnim dizanjem utega predloženo da imaju važnu ulogu u malignim potencijalom u stanicama karcinoma, uključujući udaljenim metastazama i kemijska otpornost [4]. Mi smo jer su otkrili da SP stanice izdvojene iz želuca ispitanika s karcinomom posjeduju te CSC svojstva [3]. utvrdili smo da SP stanice korištene u istraživanju izričitim kandidat rak želuca matičnih stanica markera uključujući CD44 [24], CD133 [25], a NANOG [26] (Slika S2). Sferoidu koloniziranje aktivnost ovih SP stanica je bila veća od one matičnih stanica [18]. Također, ove CSC-poput SP stanice pokazuju kemijska otpornost na citostatike [2]. Ovi rezultati su potvrdili da OCUM-12 /SP stanice i OCUM-2MD3 /SP stanice mogu predstavljati rak matičnih stanica, kao što su svojstva. Od specifičnih markera za želučane eksplozivnim dizanjem utega nisu objavljeni kao od još, razjašnjenje od specifičnih signalnih putova i mehanizme djelovanja eksplozivnim dizanjem utega može poboljšati prognozu karcinoma želuca. U ovom istraživanju, osam eksplozivnim dizanjem utega kandidata markeri su identificirani proteomskom tehnikama korištenjem LC-MS /MS u kombinaciji s iTRAQ tehnologije. Tri proteini, RBBP6, GLG1 i VPS13A, otkriveni su tek u staničnim linijama SP, ali ne u njihovim roditelj staničnim linijama. Osim toga, pet proteina, HSPA9, ALDOA, DCTPP1, HSPA4 i KRT18, su prekomjerno ekspresivne u SP stanične linije u odnosu na njihove roditelj staničnih linija. RT-PCR analiza je također pokazala da je razina ekspresije RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1 pregled i CK18 pregled je bio visok u OCUM-12 /SP i OCUM- 2MD3 /SP, u usporedbi s kontrolom matičnog OCUM-12 i OCUM-2MD3. Ovi proteini su sumnja da novih biomarkera za želučane eksplozivnim dizanjem utega. Ova hipoteza je testirana imunohistokemijskom analizom 300 slučajeva raka želuca. Pregled

RBBP6 je nuklearna protein, koji je poznato da je povezan i potencijalno odnosi na p53 i retinoblastom vezanje Q protein 1 (RBQ-1) [ ,,,0],27]. RBBP6 interakciju s Tumor supresor p53 proteina i Rb, i igra ulogu u indukciji apoptoze, kao i za regulaciju staničnog ciklusa [28], [29]. RBBP6 veže divljeg tipa p53 proteina, ali ne i na p53 mutanata [30]. Također je pokazano kako bi se potaklo vezanje MDM2 [31] koji je E3 ubikvitin ligaze koji je usmjeren na p53 [32], te ometa njegovu sposobnost da transaktivirati ciljnih gena [33]. Doreguliranjem RBBP6 je snažno povezana s progresijom tumora kod raka jednjaka i rak vrata maternice [32]. U ovom istraživanju, RBBP6 ekspresija je povezana s rakom 't' kategorije s obzirom na invazije dubine, udaljenim metastazama, limfnih čvorova metastaza, i kliničku fazu. Štoviše, RBBP6 ekspresija bila je značajno povezana s lošim preživljavanje u bolesnika u svim fazama, posebno u fazi III, što je rezultiralo zaključkom da RBBP6 je neovisni faktor za preživljavanje. Izvršili smo RBBP6
siRNA obaranje RBBP6 pregled gena uporabom OCUM-12 /SP stanice i OCUM-2MD3 /SP stanice u ovoj studiji.

• PLoS ONE: Photoimmunotherapy karcinoma želuca peritonejsku karcinomatoza u mišjem modelu
• PloS Genetics: zametne linije Mutacije u MAP3K6 su povezane s obiteljskim želučani Cancer