PLoS ONE: Porovnávacia analýza proteomiky žalúdočné nádorových kmeňových Cells

Abstraktné

Rakovina kmeňové bunky (CSCS) sú zodpovedné za progresiu rakoviny, metastáz, a opakovanie. K dnešnému dňu, špecifické markery SKSK zostanú bez povšimnutia. Cieľom tejto štúdie bolo zistiť nových biomarkerov žalúdočných CSCS pre klinickú diagnostiku pomocou proteomiky technológie. CSC-SP, ako bunky, OCUM-12 /SP bunky, OCUM-2MD3 /SP bunky a ich materské OCUM 12-bunky a OCUM-2MD3 bunky boli použité v tejto štúdii. Proteínové lyzáty z každej bunkovej línie boli analyzované za použitia QSTAR Elitná kvapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostnou spektrometriou, spojený s izobarických značiek pre relatívne a absolútne techniky kvantifikácie. Kandidátnej proteíny detekovanej proteomiky technológie boli overené imunohistochemické analýzou 300 karcinómov žalúdka. Na základe výsledkov LC-MS /MS, osem proteíny, vrátane RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, Aldo a KRT18 základe boli up-regulované v oboch OCUM-12 /SP buniek a OCUM-2MD3 /SP bunky v porovnaní s ich zodpovedajúcimi rodičovských buniek. RT-PCR analýza ukazuje, že hladina expresie RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, Aldo, GLG1 stroje a CK18
bola vysoká v OCUM-12 /SP a OCUM-2MD3 /SP, v porovnaní s kontrolou materskej OCUM-12 a OCUM-2MD3. Tieto proteíny boli významne spojené s pokročilým hĺbkou invázie, lymfatických uzlín, vzdialených metastáz alebo pokročilých klinickej fáze. RBBP6, DCTPP1, HSPA4 a Aldo expresie najmä boli významne spojené so zlou prognózou u pacientov s rakovinou žalúdka 300. RBBP6 bola stanovená ako nezávislý prognostický faktor. Pohyblivosť stimulujúce schopnosť OCUM-12 /SP buniek a /SP buniek OCUM-2MD3 bola inhibovaná RBBP6
siRNA. Tieto zistenia by sa mohlo zdať, že osem proteíny, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, Aldo a KRT18 s využitím porovnávacie analýzy proteomiky, boli vnímané ako potenciálny CSC markery rakoviny žalúdka. Z ôsmich kandidátskych proteínov, RBBP6 bolo navrhnuté ako sľubná prognostický biomarker a terapeutickým cieľom pre rakovinu žalúdka

Citácia :. Morisaki T, M Yashiro, Kakehashi A, Inagaki A, Kinoshita H, Fukuoka T, et al. (2014) Porovnávacia analýza proteomiky rakovina žalúdka kmeňových buniek. PLoS ONE 9 (11): e110736. doi: 10,1371 /journal.pone.0110736

Editor: Anita B. Hjelmeland, University of Alabama v Birminghame, Spojené štáty |

prijatá: 03.05.2014; Prijaté: 16.září 2014; Uverejnené: 07.11.2014

Copyright: © 2014 Morisaki et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Dostupné dát: Text. autori potvrdzujú, že všetky údaje súvisiace závery sú plne k dispozícii bez obmedzenia. Všetky relevantné údaje sú v papiera a jeho podporné informácie súbory. Prístupové čísla údajov o bielkoviny sú zahrnuté ako UniProt /Swiss-Prot v tabuľke 2.

Financovanie: Táto štúdia je čiastočne financovaná KAKENHI (Grant-in-Aid pre vedecký výskum, Nos 22390262, 23390329 a 26293307. ), National Cancer Center pre výskum a vývoj fondu (23-a-9) a podľa priority výskumnom fonde Osaka City University. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Rakovina kmeňové bunky (CSCS) sú definované ako jedinečné subpopulácie u nádorov, ktoré majú schopnosť iniciovať rast nádoru a udržanie samoobnovy [1]. Bolo navrhnuté, že môžu spôsobiť, že heterogénne línie nádorových buniek, ktoré tvoria nádor a tiež hrajú dôležitú úlohu v malígne progresii karcinómu, ako je vzdialené metastázy, opakovanie a chemorezistence [2] - [4]. CSCS boli pôvodne identifikované v akútnou myeloidnou [5], leukémie, ale v poslednej dobe boli popísané existovať v celom rade druhov rakoviny, vrátane rakoviny žalúdka [6]. Identifikácia CSC markerov môže otvoriť nový terapeutický pohľad na základe selektívneho zacielenie tohto malú populáciu buniek, [7], [8]. Nedávno bolo oznámené, že SKSK prípadne sa vyjadriť svoje vlastné jedinečné značky, ako je napríklad aldehyddehydrogenázy 1 (ALDH1) [9], CD44 [10], [11], a CD133 [12]. Avšak, mnoho z publikovaných markery nie sú špecifické pre CSCS. Kvantitatívne vyjadrenie proteín profiling umožňuje efektívne identifikáciu presných a opakovateľných diferenciálnych expresných hodnôt pre proteíny [13]. Izobarickom tagy pre relatívnej a absolútnej kvantifikácie (iTRAQ) v kombinácii s multidimenzionálne kvapalinová chromatografia (LC) a tandemovou hmotnostnej spektrometrie (LC-MS /MS) Analýza sa objavuje ako silný metodiky pri hľadaní nádorových biomarkerov [14]. Sme už skôr oznámil, že bočné populácie (SP), bunky sú schopné samoobnovení a produkovať non-SP buniek, a že nádorové bunky v SP frakcie majú vysoký potenciál pre vyvolanie nádorového bujnenia, vzdialených metastáz [3], a chemorezistence [2]. To naznačuje, že SP bunky karcinómu žalúdka majú nádorových kmeňových buniek podobné vlastnosti. Preto je cieľom tejto štúdie bolo zistiť nový CSC značku (y), rakoviny žalúdka porovnaním proteomů medzi rodičovských buniek a kmeňových SP bunky buniek podobné, ktoré sú známe, že majú bohatú CSC populáciu [15].

materiály a metódy

bunkových kultúrach

Dve žalúdočné rakovina bunkové línie, OCUM-2MD3 [16] a OCUM-12 [17], boli použité v tejto štúdii. Tieto bunkové línie boli získané z difúznej typu rakoviny žalúdka. Stav Kultúra bola kultivovaná v Dulbeccova modifikovanom Eagle médiu (DMEM; Nikken, Kyoto, Japonsko) s 10% tepelne inaktivovaného fetálneho teľacieho séra (FCS; Life Technologies, Grand Island, NY), penicilínu a streptomycínu a 0,5 mM pyruvátu sodného, a inkubované pri 37 ° C. OCUM-12 /SP a OCUM-2MD3 /SP bunkové línie boli SP bunky, ktoré boli hodnotené analýzou prietokovej cytometrie za použitia Hoechst 33342 z ich rodičovských bunkových línií, OCUM-2MD3 a OCUM-12, v tomto poradí. Triedenie sa vykonáva trikrát vytvoriť stabilnú populáciu buniek SP-obohatené. Po trojmesačnej doby inkubácie po triedení, OCUM-12 /SP bunky (6,5%) a OCUM-2MD3 /SP bunky (12,2%) stále predstavujú vysoké percento frakcie SP, v porovnaní s rodičom OCUM-12 (3,2% ) a OCUM-2MD3 (6,3%) buniek (Obr S1). Následne budú tieto SP obohatený bunky so stabilnou populácii boli bunkové línie použité pre analýzu, ako bolo oznámené predtým [18].

tkanivového Vzorky a informácie pre pacienta

Tkanivové vzorky boli získané od firmy 300 pacientov s diagnózou rakovina žalúdka povolené operácie v Osaka City University. Tabuľka 1 ukazuje klinické jednotky charakteristiky pacientov s rakovinou žalúdka 300. Bolo 208 mužských a 92 ženských pacientov s priemerným vekom 64 rokov (rozmedzie 28-85 rokov) v čase prevádzky. Tieto diagnózy boli potvrdené najmenej dvoch osôb. Staging bola stanovená v súlade s japonskou klasifikácie karcinómu žalúdka (14 ^{th edition) [19]. Táto štúdia bola schválená Osaka City University etickou komisiou (Osaka, Japonsko). Písomný informovaný súhlas od darcu bol získaný za použitia tejto vzorky v oblasti výskumu.}

Protein Identifikácia a kvantifikácia podľa QSTAR Elite LC-MS /MS

rakovinové bunky (60 ug každého) sa homogenizujú a potom sa lyžovali za použitia buď 100 ul T-PER lyzačného pufra (Thermo Scientific), alebo 500 ul 9 M močoviny, a 2% CHAPS lyzačného pufru s inhibítorom proteázy. Následne sa bunkový lyzát sa potom spracuje pomocou ultrazvuku. Po vyzrážaní acetónom, koncentrácia proteínov bola meraná pomocou testu BCA Protein (Pierce, IL, USA). Redukcia, alkylácia, trávenie a následný peptid označovanie 50 ug proteínu pre každej vzorky sa vykonali za použitia AB Sciex iTRAQ Reagent Multi-Plex Kit (AB SCIEX, Concord, ON, Kanada) [20]. Tieto iTRAQ značené vzorky boli nanesená na patrónu pre výmenu katiónov ICAT (AB Sciex). Peptidy boli eluované za šesť frakcií (1 ml roztoku KCl 10, 50, 70, 100, 200 a 350 mm), a supernatant z každej sa odparí vo vákuovej odstredivke. Vzorky potom boli odsolenej a koncentruje za použitia Sep-Pak Light C18 kaziet (Waters Corporation, Milford, MA) a odparí sa vo vákuovej odstredivke, resuspendované v 20 ul 0,1% (v /v) kyseliny mravčej, a následne sa použije na QSTAR elitnej LC -MS /MS. Každá vzorka bol vykonávaný po dobu 150 minút. Údaje MS /MS sa hľadala voči švajčiarskemu Protein databázy (ľudský) za použitia ProteinPilot softvéru (verzia 2.0, AB Sciex) s trypsínom nastavený ako tráviace enzýmy a metyl methanethiosulfinate ako modifikácia cysteín. Za účelom odstránenia nadbytočných hity a porovnávacej kvantifikácia, výsledky vyhľadávania k dispozícii, boli ďalej spracované pomocou softvéru ProteinPilot pomocou Paragon algoritmus. To malo za následok minimálne sadou oprávnených identifikovaných proteínov. Všetky predložené údaje boli použité s cut-off limitom 95% spoľahlivosti. Relatívna kvantifikácia peptidov bola vypočítaná ako pomer delením iTRAQ intenzitu reportér. Pomery peptidov, ktoré podporujú existenciu jedného proteínu boli spriemerované pre relatívnu kvantifikáciu proteínu. Potom bola vykonaná analýza ProteinPilot a vynaliezavosť cesta analýza (IPA) (vynaliezavosť System, Mountain View, CA). Po vykonaní jednoduchý t-testu na jednom z vypočítaných priemerných pomerov proteínov proti 1 na posúdenie platnosti zmien expresie proteínu, bol zaznamenaný p-hodnota. Proteín pomery s p-hodnoty menšie ako 0,05 boli považované za spoľahlivé. Malo by byť známe, že v 90% iTRAQ experimentálnych pokusov vykonaných skôr, štandardnej odchýlky pomeru bielkovín, ktoré vychádzajú z technických variantov, bolo hlásené, že je nižšia ako 0,3. Z tohto dôvodu, výraz sa zmení viac ako 1,2-krát menej ako 0,8 násobne normalizovaných hladín expresie boli považované za mimo rozsahu technického variability. Tiež sme vykonali neznačkovanej analýzu a detekovať prítomnosť bielkovín iba v rámci OCUM-12 /SP buniek a /SP buniek OCUM-2MD3, ale nie v materských buniek [21]. Každá vzorka bol spustený dvakrát. Nanesený LC-MS /MS vyšetrenie v kombinácii s technológiou iTRAQ boli hlásené ako spoľahlivý kvantitatívne metódy pre expresiu proteínu, je ešte citlivejšia ako western blot, ktorá závisí od typu použitých protilátok [22].

IPA a výber kandidátov proteínov

databázy IPA sa používa predovšetkým v oblasti vlastného ontológie, ktorý obsahuje až 300.000 biologických predmetov, vrátane génov, proteínov, molekulárnych a bunkových procesov. Z tohto dôvodu, IPA bol použitý pre analýzu proteínov molekulárnej funkcie, lokalizácia. Okrem toho bolo získať podrobné informácie týkajúce sa funkcie a bunkovej umiestnenie identifikovaných proteínov. Na základe výsledkov LC MS /MS na základe a IPA analýzy proteínov, ktoré boli pozorované byť nadmerne exprimované v SP bunkových línií, v porovnaní s ich príslušnou frekvenciu expresie v rodičovských bunkových línií, boli vybrané ako kandidátskej biomarkerov pre SP bunky rakoviny žalúdka. Identifikácia sietí interagujúcich proteínov, rovnako ako funkčné skupiny a cesty bol vytvorený IPA, a analýza závisí na predtým charakterizovaných združenia.

Kvantitatívne v reálnom čase reverznej transkripcie-polymerázovej reťazovej reakcie (RT-PCR )

žalúdočné rakovinové bunky boli kultivované. A celková bunková RNA bola extrahovaná RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Carlsbad, CA). cDNA bola pripravená z 2 ug RNA s použitím náhodných primerov (Invitrogen). Na stanovenie ohybovej zmeny v každom génu, RT-PCR bola vykonaná na ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), za použitia komerčne dostupného testu génovej expresie (Applied Biosystems) za RBBP6
( retinoblastóm viažuci proteín 6
, Hs00544663), HSPA4
( tepelného šoku 70 kDa proteín 4
, Hs00382884), HSPA9
( tepelného šoku 70 kDa proteín 9
, Hs00269818), GLG1
(Golgi glykoproteínu 1, Hs00939452), DCTPP1
( dCTP pyrofosfatáza 1
, Hs00225433), VPS13A
( vakuolárna proteín triedenie 13 homológov systémom
; Hs00362891), CK18 (keratín 18
, Hs028277483), Aldo (aldolázy A
; Hs00605108), CD44
(Hs01075862), CD133
(Hs01009250) a nanog
(Hs02387400). GAPDH (Sigma) bol použitý ako vnútorný štandard pre normalizáciu hladiny mRNA. Tieto prahové hodnoty cyklu (Ct) hodnoty boli použité pre výpočet relatívnej expresie pomery medzi kontrolnou a liečenou buniek.

Western blot analýza

Úroveň expresie RBBP6 a Aldo v rakovinových bunkách bola skúmaná nasledujúcim spôsobom. Fragmenty buniek boli odobraté po rôznych spôsobov liečby. Potom, čo sa koncentrácia proteínu v každej vzorke bola upravená, elektroforéza sa vykonáva za použitia 10% Tris /Gly gély (Life Technologies, Carlsbad, CA). Proteínové pásy, získanými sa prenesie na Immobilon-P membránu prevodu (Amersham, Aylesbury, UK). Potom bola membrána umiestnená do PBS-T roztoku obsahujúcom anti-RBBP6 (WH0005930M1, Sigma-Aldrich, MO, USA), anti-Aldo (HPA004177, ATLAS), a anti-beta-aktínu (1: 300 riedenie; Sigma Aldrich), a nechá sa reagovať pri teplote miestnosti po dobu 2 hodín. Súčasne boli zistené hladiny špecifických proteínov v každom lyzátu zvýšenú chemiluminiscencie za použitia ECL Plus (Amersham) s následnou autorádiografiou.

Sirna dizajnu

Sekvencia RBBP6
malá interferujúce RNA (siRNA), majú nasledujúcu štruktúru: si RBBP6
zmysel, 5'-GAAAGAAGAAUAUACUGAUtt-3 '; antisencie, 5'AUCAGUAUAUUCUUCUUUCgt-3 ', a nontargeting siRNA (negatívny-siRNA) bol získaný od firmy Ambion (Life Technologies, Carlsbad, CA) .OCUM-12 /SP a /SP buniek OCUM-2MD3 boli pripravené pri 60% zhlukovania v šiestich-jamkové misky. Transfekční zmes bola pripravená pridaním 150 ul Opti-MEM, vrátane 9 ul Lipofectamine RNA Imax Regant (Life Technologies) na 150 ul Opti-MEM, vrátane 90 pmol siRNA a inkubáciou po dobu 5 minút pri teplote miestnosti. Vďaka vyššie transfekční zmesi sa pridá k pripravenej šiestich jamkami misky. Dvadsaťštyri hodín po transfekciu bola vykonaná RT-PCR.

hojenie rán Assay

Rakovinové bunky boli kultivované v 96-jamkových doštičkách (Essen nástroje, Birmingham, UK). Potom, čo bunky dosiahli semi-zhlukovania rana bola vytvorená v bunkovej monovrstvě s 96 jamkami podľa WoundMaker (Essen Bioscience, MI, USA). Poškriabané poľa bola prijatá na snímke každé 3 hodiny a bol sledovaný s Incucyte Live-Cell Imaging System a softvéru (Essen Instruments). Stupeň bunkovej migrácie bola analyzovaná 24 hodín po ošetrení rany ako percento z rany sútoku. Stredná hodnota 4 poľa bola vypočítaná ako hodnota vzorky.

Invasion Assay

sme použili chemotaxicell komory (Kubota, Osaka, Japonsko) s 12-um pórov membránový filter potiahnutý 50- ug Matrigel (Collaborative Research Co., Bedford, MA). Komora (horná súčasť) sa umiestni do kultivačnej misku 24-jamkové (nižšia zložka). Žalúdočné rakovinové bunky sa resuspendujú na konečnú koncentráciu 5 x 10 ^{3 buniek /ml. Ďalšie, 500 ul nižšia komponenty. Po inkubácii po dobu 48 hodín, rakovinové bunky na hornom povrchu membrány sa odstránia otrením a zafarbené hematoxylínom. Rakovinové bunky, ktoré napadli cez filter potiahnutý Matrigelu do spodnej membrány boli ručne počítané pod mikroskopom pri zväčšení 200 x. Šiestich náhodne vybratých polí boli počítané pre každú skúšku. Stredná hodnota zo štyroch oblastí bolo vypočítané ako hodnota vzorky. Pre každú skupinu sa kultúra bola vykonaná trikrát.}

Validation of Protein Expression imunohistochemicky

Imunohistochémia bola vykonaná na formalínom fixovaných, parafínových tkanivových vzoriek, ktoré boli zbavené parafínu v xyléne a dehydratovaný pomocou etanolové. Rezy boli zahrievané počas 10 minút pri teplote 105 ° C v autokláve v Target Retrieval Solution (DAKO). Vzorky boli následne inkubovali s 3% peroxidu vodíka k zablokovaniu endogénnej peroxidázy. Tieto protilátky boli použité imunohistochemické procesu: anti-RBBP6 (retinoblastóm viažuci proteín 6; WH0005930M1, 6: 1000; Sigma-Aldrich), anti-GLG1 (Golgi glykoproteínu 1, HPA010815, 1:80; ATLAS), anti-VPS13A (vakuolárna proteín triedenie 13 homológnej A; NBP1-85642, 1: 500; Novus Biologicals), anti-Aldo (aldolázy A, fruktóza-bisfosfát; HPA004177, 1: 400; ATLAS), anti-DCTPP1 (dCTP pyrofosfatáza 1; HPA002832, 1: 200, ATLAS), anti-HSPA9 (tepelného šoku 70 kDa proteín 9; HPA000898, 1: 200, ATLAS), anti-HSPA4 (tepelného šoku 70 kDa proteín 4; HPA010023, 1: 200, ATLAS), a anti-KRT18 (keratín 18; ab668, 1: 500; abca). Vzorky boli inkubované s každou protilátku cez noc pri teplote približne 4 ° C. Potom boli vzorky inkubované v privlastnené imunoglobulínu G po dobu 10 minút s následným trojnásobným premytím PBS. Všetky vzorky boli potom zmieša s streptavidin-peroxidáza činidla, a inkubované v PBS Diaminobenzidine a 1% peroxidu vodíka (objem /objem) a potom kontrastným Mayerovým hematoxylínom.

Imunohistochemické Vyhodnotenie

RBBP6, hladiny expresie GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, Aldo a KRT18 boli hodnotené ako čo do intenzity farbenia a podielu sfarbených nádorových buniek. Intenzita sfarbenia bola hodnotená na stupnici 0-3 (0 = žiadna, 1 = mierne, 2 = stredný, 3 = intenzívny). Farbenie podiely boli hodnotené na stupnici 0-4 (percento bolo inak s každou protilátku) na základe percenta pozitívne zafarbených buniek. Preto konečné farbenie skóre, vypočítaná ako násobok skóre intenzity farbenia a farbenie podielu skóre, by sa na stupnici od 0-12. Hladiny expresie DCTPP1 boli považované za pozitívne, ak sa dostal skóre 3. úrovne expresie HSPA4 bol považovaný za pozitívny, keď sa dostal skóre 6. úrovne expresie Aldo, KRT18, VPS13A a GLG1 bol považovaný za pozitívny, ak každý prijatý skóre 8. RBBP6, vyhodnotenie ktorých iba farbenie podiel skóre bol použitý pre výpočet, bol považovaný za pozitívny, keď sa dostal skóre 3. HSPA9, vyhodnotenie z ktorých iba skóre intenzita farbenia bol použitý pre výpočet, bol považovaný za pozitívny, pokiaľ ju dostal skóre 3. Všetky hodnotenia boli vyrobené dvoma pozorovateľmi, ktorí boli vedomí klinických dát a výsledkov. Kedy bola nájdená protirečivý hodnotenie medzi dvoma nezávislými pozorovateľmi, bola sklíčka prekontrolovaná a prehodnotiť po diskusii.

Štatistická analýza

software SPSS (SPSS Japan, Tokyo, Japonsko) bola použitá pre analýza dát. Štatistická významnosť asociácie medzi expresiu proteínov a rôznych klinicko-premenných, vrátane veku, pohlavia, makroskopické typu nádoru diferenciácie, celkový počet resekované lymfatických uzlín, a typu chirurgického zákroku (D1 alebo D2 gastrektómii) bola hodnotená s použitím Fisherovho a Chi -squared testy. Krivky prežitia boli vypočítané z deň operácie do okamihu smrti alebo na posledný follow-up pozorovanie s použitím Kaplan-Meierovej metódy. Navyše všetky rozdiely medzi krivkou prežívanie boli hodnotené pomocou log-rank testu. Mnohorozmerných analýzy boli vykonané v súlade s Cox regresného modelu pre stanovenie asociácie medzi klinicko-premenných a úmrtnosti. P-hodnoty menšie ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú

Výsledky

The stemness bunkových línií karcinómu žalúdka

Percentá SP buniek boli vyššie v OCUM-12. /SP a OCUM-2MD3 /SP bunkách než v ich materskej OCUM-12 a OCUM-2MD3 buniek (obr S1). Rakoviny kmeňových buniek markery SP buniek, OCUM-12 /SP a OCUM-2MD3 /SP, ako je napríklad CD44, CD133, a nanog, boli analyzované pomocou RT-PCR. Hladina expresie týchto markerov bola významne zvýšená v oboch bunkových líniách SP, v porovnaní s ich materskými bunkových líniách (Obr S2). Počet spheroid kolónie bola významne vyššia v oboch OCUM-12 /SP a OCUM-2MD3 /SP buniek než ich materskými OCUM-12 a OCUM-2MD3 bunkách (dáta nie sú ukázaná).

Detekcia kandidátskych proteínov

skúmali sme, či proteíny boli rozdielne alebo nezávisle vyjadrený v SP bunkách, a v porovnaní naše poznatky k tým ich materských buniek pomocou QSTAR Elite LC-MS /MS. Pri analýze biologické procesy, a s 95% spoľahlivosti cut-off limitom a p menšie ako 0,05, sme zistili, že proteíny boli skutočne rozdielne exprimované. Výsledky týchto zistení sú uvedené na obrázku 1. Väčšina proteínov boli nadmerne exprimované v cytoplazme nádorových buniek (obrázok 1A). Hodnota P zahrnuté do analýzy invencie je uvedené v tabuľke S1. Tieto proteíny boli stanovené za súvisiace s bunkových procesov, ako sú napríklad bunkovej smrti, metabolizmus, bunkovú organizáciu, metabolizmus DNA, proteínovej degradácie, a spracovanie RNA (Obrázok 1B). Horná kanonické cesty spojené s týmito cieľmi a zistené IPA sú uvedené v tabuľke S2.

V porovnaní s ich zodpovedajúce parentálnej bunky, proteíny boli 40 up-regulované v OCUM-12 /SP, a 35 boli proteíny hore -regulated v OCUM-2MD3 /SP. Medzi týmito proteíny, bolo osem up-regulované v oboch OCUM-12 /SP buniek a OCUM-2MD3 /SP bunky, zatiaľ čo žiadna takáto asociácia bola pozorovaná medzi ich zodpovedajúcimi rodičovských buniek (tabuľka 2 a obrázok 1C). Z týchto ôsmich proteínov, tri proteíny, RBBP6, GLG1 a VPS13A, bola nezávisle na sebe detekované v oboch bunkových líniách SP, ale nie v ich zodpovedajúcich rodičovských buniek. Päť proteínov, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, Aldo a KRT18, boli výrazne nadmerne exprimované aspoň 1,2-násobne v oboch SP bunkách v porovnaní s ich zodpovedajúce materských buniek.

mRNA úroveň expresie z nich 8 kandidátske molekuly, RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, Aldo, GLG1 stroje a CK18
bola zvýšená v OCUM-12 /SP (9,15 násobné, 9,36 násobný, 4,14 násobne, 7,80 násobne, 2,08 násobne, 1,46 násobne, 3,44 násobne a 1,99 násobne, v uvedenom poradí) a OCUM-2MD3 /SP (6,15 násobne, 1,71 násobne, 2,33 násobne, 2,30 násobne, 2,03 násobne, 1,32 násobne, 1,35 násobne a 1,31 krát, v tomto poradí), bunky, v porovnaní s tými kontrolou materskej OCUM-12 a OCUM-2MD3 bunkách (Obrázok 1D). Western blot analýza ukázala, že hladina expresie RBBP6 a Aldo bola vysoká v CUM-12 /SP a OCUM-2MD3 /SP buniek, v porovnaní s tým, že OCUM-12 a OCUM-2MD3 bunkách (obr S3).

sieť prezentované na obrázku 1E bol vytvorený IPA, a analýza závisí na predtým označené a hlásené proteínových interakcií. Tak, RBBP6, čo bolo pozorované, že je nadmerne exprimovaný v CSC-SP, ako sú bunky, OCUM-12 /SP bunky a /SP bunky OCUM-2MD3, priamo súvisí so HSPA4 a Rb, a nepriamo spojené s Hsp90 a TAGLN2. Sa tiež zistilo HSPA4, Hsp90 a TAGLN2 byť up-regulovaný v CSC-like SP buniek.

Vplyv siRBBP6 transfekcia o migrácii a invazívne schopnosťou nádorových buniek žalúdka

Obrázok 2A ukazuje, že si RBBP6
transfekciu významne znížili expresiu mRNA úrovne oboch SP bunkových línií (OCUM-12 /SP 12%, p < 0,01, OCUM-2MD3 /SP je 2,5%, p. < 0,01), v porovnaní s to s negatívnym siRNA transfekcia. RBBP6
siRNA Knockdown významne znížila invázii (2b) a migračné aktivitu (Obrázok 2C) oboch SP buniek.

imunohistochemické Posúdenie kandidátskych proteínov a ich asociácie s klinicko-funkcie

RBBP6, DCTPP1 a HSPA9 bolo pozorované, ktoré majú byť v prvom rade vyjadrený v cytoplazme a jadrách buniek karcinómu žalúdka. GLG1, VPS13A, HSPA9, HSPA4, Aldo a KRT18 bolo pozorované, ktoré majú byť v prvom rade vyjadrený v cytoplazme (obrázok 3A). V normálnych epitelových buniek, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1 a expresných HSPA9 boli nájdené niektoré bunky v epitelu žľazy. KRT18 boli vyjadrené vo väčšine epitelových bunkách. HSPA4 a expresia Aldo nebol nájdený v normálnych bunkách. BBP6, DCTPP1 a HSPA9 boli vyjadrené v cytoplazme a jadre normálnych epitelových buniek. GLG1, VPS13A, HSPA9 a KRT18 boli pozorované v cytoplazme epiteliálnych buniek (obrázok 3B).

Skúmali sme vzťah medzi úrovňou expresie ôsmimi kandidátnych proteínov a klinicko-funkcií. Počet prípadov ku každému skóre ôsmich cieľov bolo uvedené v tabuľke S3. Týchto osem proteíny boli určené, že sú spojené s potenciálne malígnych procesov, ako je vzdialené metastázy, lymfatické uzliny (LN), metastáz, hĺbky invázie, alebo fáza smerovaného (tabuľka 3). Vypočítané hodnoty p boli nasledujúce: RBBP6 boli významne spojené s hĺbkou invázie (p 0,001), LN metastáz (p 0,001), vzdialených metastáz (p = 0,013), a klinické fáze (p 0,001); GLG1 bola významne spojená s iba vzdialených metastáz (p = 0,045). VPS13A bola významne spojená s hĺbkou invázie (p = 0,005), LN metastáz (p < 0,001) a javiskové povýšenie (p = 0,005); DCTPP1 bola významne spojená s hĺbkou invázie (p < 0,001), LN metastáz (p < 0,001), vzdialených metastáz (p < 0,001) a javiskové povýšenie (p < 0,001); HSPA9 bola významne spojená s hĺbkou invázie (p < 0,001), LN metastáz (p < 0,001) a javiskové povýšenie (p < 0,001); HSPA4 bola významne spojená s hĺbkou invázie (p < 0,001), LN metastáz (p < 0,001), vzdialených metastáz (p = 0,007) a javiskové povýšenie (p < 0,001); Aldo bola významne spojená s hĺbkou invázie (p = 0,034), LN metastáz (p = 0,004) a javiskové povýšenie (p = 0,029); a KRT18 bola významne spojená s hĺbkou invázie (p = 0,001), LN metastáz (p = 0,001), vzdialených metastáz (p = 0,034) a javiskové povýšenie (p = 0,004).

Prognóza

Kaplan-Meierova krivka naznačujú, že z ôsmich nadmerne exprimovaných proteínov, RBBP6, DCTPP1, HSPA4 a Aldo, boli významne spojené so zlou prežitia u všetkých pacientov (obrázok 4). Kumulatívne päťročné celková miera prežitia RBBP6-pozitívnych prípadov (61%) bola významne nižšia (p = 0,002) ako u RBBP6 negatívnych prípadoch (78%). Okrem toho, u pacientov vo fáze III, celková miera prežitia RBBP6-pozitívnych prípadov bola významne nižšia (p = 0,034) ako u RBBP6-negatívnych prípadov. Prognóza pacientov s DCTPP1 pozitívnych nádorov (63%) bola významne horšia (p = 0,016) ako u DCTPP1-negatívne nádory (75%). Päťročný celková miera prežitia HSPA4-pozitívnych prípadov (66%) bola významne nižšia (p = 0,047), než u HSPA4 negatívnych prípadoch (75%). Päťročné celková miera prežitia Aldo-pozitívnych nádorov vykazujúcich zvýšenú expresiou (61%) bola významne horšia (p = 0,043) ako u Aldo-negatívne nádory (72%). Na rozdiel od toho neboli pozorované žiadne významné korelácie medzi inými proteínmi a prežitie pacienta. V nadväznosti na jednorozmerné analýze, hladiny expresie RBBP6, DCTPP1, HSPA4 a Aldo boli významne spojené so zlou prognózou u pacientov s rakovinou žalúdka 300 (tabuľka 4). Okrem toho, makroskopické typu (typ 4), histologický typ (difúzna), kategória T (T2-4), inváziu ciev, infiltrácie vzor (INF b, c), peritoneálnej metastázy, a LN metastázy boli stanovené byť výrazne spojené so chudobné prognóza. Viacrozmerná analýza bola vykonaná pomocou Cox modelu proporčne rizík pre všetky významné premenné v jednorozmerné analýze. Po dokončení analýzy, RBBP6 výrazu (p = 0,023), typu Borrmann 4 (p 0,001), pobrušnice pozitívne (p = 0,001), LN metastáz (p = 0,003), a pečeňové metastázy (p = 0,001) boli potvrdené ako nezávislé faktory koreluje s prežitím (tabuľka 3). Z ôsmich proteínov, RBBP6 výraz bol nezávislý prognostický faktor.

Diskusia

žalúdočné rakovina výsledky v zlou prognózou kvôli častým metastatické procesy, ako je LN metastázy a peritoneálnej metastáz [23]. CSCS bola navrhnutá tak, že má dôležitú úlohu v malígny potenciálu rakovinových buniek vrátane vzdialených metastáz a chemorezistence [4]. pretože sme zistili, že SP bunky získané od subjektov s karcinómom žalúdka, majú tieto vlastnosti CSC [3]. Potvrdili sme, že SP bunky využité v rámci tejto štúdie expresných kandidát rakovina žalúdka kmeňových buniek markermi vrátane CD44 [24], CD133 [25], a nanog [26] (obr S2). Spheroid tvorba kolónií aktivita týchto buniek SP bola vyššia ako z materských buniek [18]. Aj tieto CSC-SP, ako bunky zobrazenie chemorezistenci do liečiv proti rakovine [2]. Tieto nálezy potvrdili, že OCUM-12 /SP bunky a /SP bunky OCUM-2MD3 môžu predstavovať nádorové kmeňová bunka podobné vlastnosti. Vzhľadom k tomu, špecifické markery pre žalúdočné CSCS neboli zverejnené ako napriek tomu, objasnenie špecifických signálnych dráh a mechanizmy, ktoré sú základom akcie CSCS by mohlo zlepšiť prognózu rakoviny žalúdka. V tejto štúdii, osem kandidátske SKSK markery boli identifikované pomocou proteomických techník za použitia LC-MS /MS spolu s technológiou iTRAQ. Tri proteíny, RBBP6, GLG1 a VPS13A, boli zistené iba v bunkových líniách SP, ale nie v ich materskej bunkovej línie. Navyše, päť proteínov, HSPA9, Aldo, DCTPP1, HSPA4 a KRT18, boli nadmerne exprimované v oboch bunkových líniách SP vo vzťahu k ich materskej bunkovej línie. RT-PCR analýza tiež ukázala, že hladina expresie RBBP6 GLG1
, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, Aldo, a CK18
bola vysoká v OCUM-12 /SP a OCUM- 2MD3 /SP, v porovnaní s kontrolou materskej OCUM-12 a OCUM-2MD3. Tieto proteíny boli podozrenie, že nové biomarkery pre žalúdočné CSCS. Táto hypotéza bola testovaná pomocou imunohistochemické analýzy 300 prípadov rakoviny žalúdka.

RBBP6 je jadrový proteín, ktorý je známe, že sú spojené, a potenciálne súvisiace s p53, a retinoblastóm väzba Q proteín 1 (RBQ-1) [ ,,,0],27]. RBBP6 interaguje s nádorového supresor proteínov p53 a Rb, a hrá úlohu v indukcii apoptózy, ako aj reguláciu bunkového cyklu [28], [29]. RBBP6 sa viaže na proteíny p53 divokého typu, ale nie na p53 mutantov [30]. Bolo tiež preukázané, že podporuje väzbu MDM2 [31], E3 ubiquitin ligázu, ktoré sa zameriava na p53 [32], a zasahovať do schopnosti transaktivovat cieľových génov [33]. Up-regulácia RBBP6 bola silne koreluje s progresiou nádoru u rakoviny pažeráka a rakoviny krčka maternice [32]. V tejto štúdii RBBP6 expresie bola spojená s rakovinou kategórie "T" s ohľadom na hĺbku invázie, vzdialené metastázy, lymfatických uzlín a klinickej fáze. Okrem toho, RBBP6 expresia bola významne spojené so zlou prežitia u pacientov vo všetkých fázach, a to najmä vo fáze III, čo vedie k záveru, že RBBP6 bol nezávislý faktor pre prežitie. Vykonali sme RBBP6
siRNA vyraďujúce RBBP6
génu pomocou OCUM-12 /SP bunky a /SP bunky OCUM-2MD3 v tejto štúdii.

• Ploche ONE: Photoimmunotherapy na žalúdočné rakovinu peritoneálnej karcinosou na myšom modeli
• Ploche Genetics: Zárodočné Mutácie v MAP3K6 sú spojené s familiárnej rakoviny žalúdka