PLoS ONE: Сравнительный анализ Протеомика рака желудка стволовых клеток

Абстрактные
<р> Раковые стволовые клетки (ЦОК) ответственны за прогрессирование рака, метастаз и рецидивов. На сегодняшний день, специфические маркеры ЦОК остаются нераскрытыми. Цель данного исследования состояла в том, чтобы идентифицировать новые биомаркеры желудка ЦОК для клинической диагностики с использованием технологии протеомики. CSC-подобные клетки, SP OCUM-12 /SP-клетки, OCUM-2MD3 /SP-клетки и их родительские OCUM-12 клеток и клеток OCUM-2MD3 были использованы в этом исследовании. Белковые лизаты из каждой клеточной линии анализировали с использованием QStar Elite жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрии, в сочетании с изобарических тегами для относительной и абсолютной технологии количественного. Кандидаты белки, обнаруженные с помощью технологии протеомики были подтверждены иммуногистохимического анализа 300 рака желудка. На основании результатов LC-MS /MS, восемь белков, в том числе RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, hspa4, ALDOA и KRT18, были повышающей регуляции в обоих OCUM-12 /SP клеток и OCUM-2MD3 /SP клетки по сравнению с их соответствующими исходными клетками. ОТ-ПЦР анализ показал, что уровень экспрессии RBBP6, hspa4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
и CK18
был высок в OCUM-12 /SP и OCUM-2MD3 /SP, в сравнении с контролем материнской OCUM-12 и OCUM-2MD3. Эти белки были связаны с продвинутой глубиной инвазии, узел метастаза лимфатический, отдаленными метастазами или продвинутой стадии клинических. выражение RBBP6, DCTPP1, hspa4 и ALDOA, в частности, были в значительной степени связано с плохим прогнозом в 300 больных раком желудка. RBBP6 была определена независимым прогностическим фактором. Подвижность-стимулирующий способность OCUM-12 /SP клеток и /SP клетки OCUM-2MD3 ингибируется RBBP6
миРНК. Эти данные могли бы предположить, что восемь белков, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, hspa4, ALDOA и KRT18, с использованием сравнительного анализа протеомики, были восприняты как потенциальные маркеры CSC рака желудка. Из восьми кандидатов белков, RBBP6 было предложено перспективным прогностическим биомаркером и терапевтической мишенью для рака желудка
<р> Образец цитирования:. Морисаки T, Yashiro M, Какехаши A, Инагаки A, Киношиты H, T Фукуока, и др и др. (2014) Сравнительный анализ протеомики рака желудка стволовых клеток. PLoS ONE 9 (11): e110736. DOI: 10.1371 /journal.pone.0110736
<р> Редактор: Анита Б. Hjelmeland, Университет штата Алабама в Бирмингеме, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 3 мая 2014 года; Принято: 16 сентября, 2014 года; Опубликовано: 7 ноября 2014
<р> Copyright: © 2014 Морисаки и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник приписывают наличие
<р> Data:. авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводы полностью доступны без ограничений. Все соответствующие данные находятся в его сопутствующую информацию, файлы и бумаги. Номера доступа к данным белка включены как UniProt /Swiss-Prot в таблице 2.
<р> Финансирование: Данное исследование частично финансируется KAKENHI (дотация для научных исследований, № 22390262, 23390329 и 26293307. ), Национальным научно-исследовательским и фонд развития рака Центр (23-а-9), а также по приоритету исследовательского фонда Osaka City University. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> Раковые стволовые клетки (ЦОК) определяются как уникальной субпопуляции в опухолях, которые обладают способностью инициировать рост опухоли и поддерживать самообновление [1]. Было высказано предположение, что они могут привести к гетерогенную линию раковых клеток, составляющих опухоль, а также играют важную роль в злокачественном прогрессированию рака, такие как отдаленными метастазами, рецидива и устойчивости к воздействию химиотерапевтических [2] - [4]. ОКК были первоначально определены в острый миелоидный лейкоз [5], но в последнее время, как сообщается, существуют в самых разнообразных видов рака, в том числе рака желудка [6]. Идентификация маркеров CSC может открыть новые терапевтические перспективы на основе селективно направленных на эту небольшую популяцию клеток [7], [8]. Недавно сообщалось, что ОКК, возможно, действительно выражают свои собственные уникальные маркеры, такие как альдегиддегидрогеназой 1 (ALDH1) [9], CD44 [10], [11], и CD133 [12]. Тем не менее, многие из опубликованных маркеров не являются уникальными для ЦОНов. Количественная экспрессия белка профилирование позволяет эффективно идентифицировать точные и воспроизводимые дифференциальных значений экспрессии для белков [13]. Изобарических метки для относительного и абсолютного количественному (iTRAQ) в сочетании с многомерным жидкостной хроматографии (LC) и тандемной масс-спектрометрии (LC-MS /MS) анализ становится мощным методологии в поиске опухолевых биомаркеров [14]. Ранее мы сообщали о том, что со стороны населения (SP) клетки способны самообновлению и производить не-SP клетки, и что раковые клетки в СП фракции обладают высоким потенциалом для туморогенности, отдаленных метастазов [3], и химиорезистентность [2]. Это говорит о том, что SP клетки рака желудка обладают клеточноподобного свойствами раковых стволовых. Таким образом, цель данного исследования состояла в том, чтобы обнаружить новый CSC маркер (ы) рака желудка путем сравнения протеомов среди родительских клеток и стволовых клеток, как клетки SP, которые, как известно, обладают богатым населением CSC [15].

материалы и методы

клеточные культуры

Два желудка клеточные линии рака, OCUM-2MD3 [16] и OCUM-12 [17], были использованы в данном исследовании. Эти клеточные линии были получены из рака желудка диффузного типа. Условия культивирования культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM; Nikken, Киото, Япония) с добавлением 10% прогретой инактивированной фетальной телячьей сыворотки (FCS; Life Technologies, Grand Island, NY), пенициллином и стрептомицином, и 0,5 мМ пирувата натрия, и инкубировали при 37 ° С. OCUM-12 /SP и OCUM-2MD3 линий /SP клеток были SP клетки, которые были оценены с помощью проточной цитометрии анализа с использованием Hoechst 33342 из их клеточных линий, родительских, OCUM-2MD3 и OCUM-12, соответственно. Сортировка проводили три раза, чтобы создать стабильную популяцию SP обогащенные клеток. После трехмесячного периода инкубации после сортировки, OCUM-12 SP клеток /(6,5%) и клетки /SP OCUM-2MD3 (12,2%) по-прежнему представляет собой высокий процент SP фракции, по сравнению с материнской OCUM-12 (3,2% ) и OCUM-2MD3 (6,3%) клеток (рис S1). Впоследствии эти SP обогащенные клетки со стабильной популяции были клеточные линии, используемые для анализа, как сообщалось ранее [18].

Человеческие ткани и образцы Информация для пациентов
<р> Образцы тканей были получены из 300 пациентов с диагнозом рака желудка разрешенных операций в Osaka City University. В таблице 1 приведены клинико-характеристики 300 больных раком желудка. Существовали 208 мужчины и 92 женщин, больных, с медианой возраста 64 лет (диапазон, 28-85 лет) во время операции. Диагнозы были подтверждены, по крайней мере, двух человек. Постановка была определена в соответствии с Японской классификации рака желудка (14 е издание) [19]. Это исследование было одобрено городским комитетом по этике Университета Осаки (Осака, Япония) по. Письменное информированное согласие от донора было получено для использования этого образца в исследовании.

Идентификация белков и Количественная по QStar Elite LC-MS /MS
<р> раковых клеток (60 мкг каждая) гомогенизировали а затем подвергали лизису с использованием либо 100 мкл Т-PER буфера для лизиса (Thermo Scientific) или 500 мкл 9 М мочевину, и 2% CHAPS буфера для лизиса с ингибитором протеазы. Затем клеточный лизат затем обрабатывают ультразвуком. После осаждения ацетона, концентрации белка определяли с помощью ВСА Protein Assay (Pierce, IL, США). Снижение, алкилирование, пищеварение, и последующее мечение пептида 50 мкг белка для каждого образца были выполнены с использованием набора AB Sciex iTRAQ Реагент Multi-Plex (AB SCIEX, Concord, ON, Canada) [20]. В iTRAQ меченные образцы наносили на катионообменную картридж ICAT (AB Sciex). Пептиды элюировали в виде шести фракций (1 мл раствора KCL 10, 50, 70, 100, 200 и 350 мм), а супернатант каждого выпаривают в вакуумной центрифуге. Образцы были затем обессоливают и концентрируют с помощью Sep-Pak Легкий С18 картриджи (Waters Corporation, Milford, MA), сгущенное в вакуумной центрифуге, ресуспендировали в 20 мкл 0,1% (об /об), муравьиной кислоты, а затем наносили на QStar Elite LC -MS /МС. Каждый образец был работать в течение 150 минут. Данные MS /MS был произведен обыск против швейцарского базы данных белка (HUMAN) с использованием программного обеспечения ProteinPilot (версия 2.0, AB Sciex) с трипсином установить в качестве пищеварительным ферментом и метиловым methanethiosulfinate в качестве модификации цистеина. Для того чтобы удалить избыточные попаданий и сравнительный количественный, результаты поиска, полученные дополнительно обработаны с помощью программного обеспечения ProteinPilot с использованием Paragon алгоритма. Это привело к минимальному набору оправданных идентифицированных белков. Все представленные данные были использованы с 95% доверительного отсечения предела. Относительное определение количества пептидов рассчитывали как отношение путем деления интенсивности репортер iTRAQ. Коэффициенты пептидов, которые поддерживают существование одного белка, были усреднены для относительного белка количественному. После этого анализ анализ ProteinPilot и изобретательности путь (IPA) (Изобретательность система, Mountain View, CA) были выполнены. После выполнения простого Т-теста на одном из расчетных усредненных коэффициентов белка против 1, чтобы оценить обоснованность изменений экспрессии белка, сообщалось р-значение. Белковые отношения с р-значение менее 0,05 считались достоверными. Следует знать, что у 90% экспериментальных прогонов iTRAQ сделанных ранее, стандартные отклонения белковых соотношений, которые вытекают из технических вариаций, как сообщалось, меньше, чем 0,3. Таким образом, выражение изменяется больше, чем в 1,2 раза или менее чем 0,8 раза нормированных уровней экспрессии считались вне диапазона технической изменчивости. Мы также провели немеченого анализ, и обнаружил присутствие белков только в пределах OCUM-12 /SP клеток и /SP клетки OCUM-2MD3, но не внутри родительских клеток [21]. Каждый образец был запущен в два раза. Применяемая LC-MS /MS исследование в сочетании с технологией iTRAQ были зарегистрированы в качестве надежного количественного метода для экспрессии белка, будучи еще более чувствительным, чем вестерн-блоттинга, который зависит от типа применяемых антител [22].

IPA и отбор кандидатов белки
<р> в базе данных АПИ в основном используется в области собственной онтологии, содержащий до 300,000 биологических статей, включая гены, белки, молекулярные и клеточные процессы. Поэтому МПА была использована для анализа белков молекулярного функций, локализации. Кроме того, была получена подробная информация относительно функций и клеточные местоположения идентифицированных белков. На основании результатов LC MS /MS и МПА анализы, белки, которые наблюдались быть чрезмерно выражены в SP линий клеток, по сравнению с их соответствующей частотой экспрессии в родительских клеточных линиях, были выбраны в качестве биомаркеров для SP клеток рака желудка. Идентификация сетей взаимодействующих белков, а также функциональные группы и пути был сгенерирован АПИ, и анализ зависит от ранее охарактеризованными ассоциаций.

Количественные в режиме реального времени с обратной транскрипцией полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР )
<р> желудочные раковые клетки культивировали. И Общую клеточную РНК экстрагировали с использованием RNeasy Mini Kit (Qiagen, Carlsbad, CA). кДНК получали из 2 мкг РНК с использованием случайных праймеров (Invitrogen). Для того, чтобы определить, кратные изменения в каждом гене RT-PCR проводили на ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), экспрессирующими анализов коммерчески доступных генов (Applied Biosystems) для RBBP6
( ретинобластома связывающий белок 6
; Hs00544663), hspa4
( теплового шока 70kDa белок 4
; Hs00382884), HSPA9
( теплового шока 70 кДа 9
; Hs00269818), GLG1
(Гольджи гликопротеин 1; Hs00939452), DCTPP1
( дЦТФ пирофосфатазы 1
; Hs00225433), VPS13A <бр> ( вакуольная белка сортировки 13 гомолога управлением
; Hs00362891), CK18 (кератин 18
; Hs028277483), ALDOA (альдолазу A
; Hs00605108), CD44
(Hs01075862), CD133
(Hs01009250) и NANOG
(Hs02387400). GAPDH (SIGMA), был использован в качестве внутреннего стандарта, чтобы нормализовать уровень мРНК. Значения порогового цикла (Ct) были использованы для расчета относительных коэффициентов экспрессии между контрольными и обработанными клетками.

Вестерн-блот анализ
<р> Уровень экспрессии RBBP6 и ALDOA в раковых клетках исследовали следующим образом. Клеточные лизаты были собраны после различных обработок. После того, как концентрация белка каждого образца устанавливали, электрофорез проводили с использованием 10% Трис /Gly гели (Life Technologies, Carlsbad, CA). Белковые полосы, полученные переносили на Immobilon-P Transfer мембрану (Amersham, Эйлсбери, Великобритания). Затем мембрану помещали в PBS-T растворе, содержащем анти-RBBP6 (WH0005930M1, Sigma-Aldrich, MO, USA), анти-ALDOA (HPA004177, ATLAS) и анти-бета-актина (1:300 разведение; Сигма Aldrich), и давали возможность взаимодействовать при комнатной температуре в течение 2-х часов. Уровни специфических белков в каждом лизате были обнаружены усиленной хемилюминесценции с использованием ECL плюс (Amersham), а затем с помощью авторадиографии.

Малые интерферирующие РНК Design
<р> Последовательности RBBP6
маленький мешая РНК (миРНК) сконструированы следующим образом: си RBBP6
смысл, 5'-GAAAGAAGAAUAUACUGAUtt-3 '; антисмысловая, 5'- AUCAGUAUAUUCUUCUUUCgt-3 ', и nontargeting миРНК (отрицательный-миРНК) был приобретен у фирмы Ambion (Life Technologies, Carlsbad, CA) .OCUM-12 /SP и /SP клеток OCUM-2MD3 готовили при 60% слияния в шесть также блюда. Смесь для трансфекции готовили добавлением 150 мкл Opti-MEM в том числе 9 мкл Липофектамин РНК Imax Regant (Life Technologies) в 150 мкл Opti-MEM в том числе 90 пмоль миРНК и инкубацией в течение 5 мин при комнатной температуре. И, наконец, указанное трансфекция смесь добавляли в готовое блюдо шестилуночные. Через двадцать четыре часа после трансфекции, RT-PCR проводили.

ранозаживляющие Анализ
<р> Раковые клетки культивировали в 96-луночных планшетах (Essen Instruments, Бирмингем, Великобритания). После того, как клетки достигли полуфинала слияния, рана была создана в монослое клеток с 96-хорошо WoundMaker (Essen Bioscience, Мичиган, США). Поцарапанные поля были взяты на фото каждые 3 часа и контролировали с Incucyte Live-Cell Imaging System и программного обеспечения (Essen Instruments). Степень клеточной миграции было проанализировано 24 часа после обработки раны в процентах от раневой слияния. Среднее из 4-х полей была рассчитана как значения выборки.

Invasion Анализ
<р> Мы использовали chemotaxicell камеры (Kubota, Осака, Япония) с порами мембранный фильтр с диаметром 12 мкм, покрытый 50- мкг Матригель (Collaborative Research Co., Bedford, MA). Камера (верхний компонент) помещали в культуральный планшет 24-луночный (нижняя компонента). Клетки рака желудка ресуспендировали до конечной концентрации 5 × 10 3 клеток /мл. Затем 500 мкл нижних компонентов. После инкубации в течение 48 ч, раковые клетки на верхней поверхности мембраны были удалены путем протирки и окрашивали гематоксилином. Раковые клетки, которые захватившие через фильтр с покрытием матригелем в нижнюю мембрану были вручную подсчитывают под микроскопом при увеличении х200. Шесть случайным образом выбранных полей подсчитывали для каждого анализа. Среднее из четырех полей была рассчитана как значения выборки. Для каждой группы, культура была сделана в трех экземплярах.

Проверка экспрессии белка с помощью иммуногистохимии
<р> Иммуногистохимическое проводили на фиксированных формалином, залитых парафином тканевых образцов, которые были депарафинировали в ксилоле и обезвоженная с помощью сортовой этанол. Срезы нагревают в течение 10 мин при 105 ° С в автоклаве в целевых Retrieval Solution (DAKO). Затем образцы инкубировали с 3% перекиси водорода, чтобы блокировать эндогенную активность пероксидазы. Следующие антитела были использованы в процессе иммуногистохимического: анти-RBBP6 (ретинобластома связывающего белка 6; WH0005930M1, 6:1000; Sigma-Aldrich), анти-GLG1 (Гольджи гликопротеин 1; HPA010815, 1:80; ATLAS), анти-VPS13A (вакуольная белка сортировки 13 гомолога A; NBP1-85642, 1:500; Novus Biologicals), анти-ALDOA (альдолазу A, фруктоза-бисфосфат; HPA004177, 1:400, ATLAS), анти-DCTPP1 (дЦТФ пирофосфатазы 1; HPA002832, 1:200; ATLAS), анти-HSPA9 (теплового шока 70 кДа белок 9; HPA000898, 1:200; ATLAS), анти-hspa4 (теплового шока 70kDa белок 4; HPA010023, 1:200; ATLAS), и анти-KRT18 (кератин 18; ab668, 1:500; Abcam). Образцы инкубировали с каждым антителом в течение ночи при приблизительно 4 ° C. После этого образцы инкубировали в присвоила иммуноглобулина G в течение 10 минут, после чего три промывок PBS. Все образцы затем обрабатывали с стрептавидин-пероксидаза реагента и инкубировали в PBS диаминобензидина и 1% перекиси водорода (об /об), а затем counterstaining гематоксилином Майера.

иммуногистохимическое оценка
<р> RBBP6, уровни экспрессии GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, hspa4, ALDOA и KRT18 оценивали как интенсивность окрашивания и доля окрашенных опухолевых клеток. Интенсивность окрашивания оценивали по шкале 0-3 (0 = нет, 1 = мягкий, 2 = умеренное, 3 = интенсивный). Окрашивание пропорции оценивались по шкале 0-4 (процент отличается с каждым антителом) на основе процентного содержания положительно окрашенных клеток. Таким образом, окончательный счет окрашивания, которая была рассчитана как кратное счет интенсивности окрашивания и счет окрашивания пропорции, было бы по шкале 0-12. Уровни экспрессии DCTPP1 считались положительными, когда он получил балл 3. Уровни экспрессии hspa4 считались положительными, когда он получил оценку 6. уровней экспрессии ALDOA, KRT18, VPS13A и GLG1 считались положительными, когда каждый получил оценку 8. RBBP6, оценка которых только оценка окрашивания доля была использована для расчета, считается положительным, когда он получил оценку 3. HSPA9, оценка которых только оценка интенсивности окрашивания была использована для расчета, считается положительным, если его получил оценку 3. Все оценки были сделаны двумя наблюдателями, которые не знали о клинических данных и результатах. Когда была найдена оценка противоречива между двумя независимыми наблюдателями, слайды были перепроверены и перепроверены после обсуждения.

Статистический анализ
<р> Программное обеспечение программы SPSS (SPSS Япония, Токио, Япония) был использован для анализ данных. Статистическая значимость ассоциаций между экспрессией белков и различных клинико-патологическими переменных, включая возраст, пол, макроскопического типа, дифференцировки опухоли, общее число резекцию лимфатических узлов, а также тип операции (D1 или D2 резекция) оценивали с использованием Фишера и Chi -squared тесты. Кривые выживаемости были рассчитаны со дня операции до момента смерти или до последнего последующего наблюдения с использованием метода Каплана-Мейера. Кроме того, любые различия между кривыми выживаемости оценивали с использованием лог-рангового теста. Многомерные анализы были выполнены в соответствии с Кокса регрессионной модели, чтобы определить связь между клинико-патологическими переменных и смертности. P-значения &л; 0,05 считалось статистически значимым

Результаты

The стволовости линий рака желудка клеток
<р> Процент SP клеток были выше в OCUM-12. /SP и OCUM-2MD3 /SP клеток, чем в их родительском OCUM-12 и клеток OCUM-2MD3 (рис S1). Рак стволовых клеток маркеры SP клеток, OCUM-12 /SP и OCUM-2MD3 /SP, такие как CD44, CD133 и NANOG, анализировали с помощью ОТ-ПЦР. Уровень экспрессии этих маркеров была значительно увеличена в обеих линиях SP клеток, по сравнению с их родительскими клеточными линиями (рис S2). Число сфероида колонии была значительно выше в обеих OCUM-12 /SP и OCUM-2MD3 /SP клеток, чем их родительских OCUM-12 и OCUM-2MD3 клеток (данные не показаны).

Обнаружение кандидатов белков

Мы исследовали, были ли дифференцированно или независимо друг от друга выражены белки в клетках SP, и сравнили полученные результаты с теми из своих родительских клеток с использованием QStar Elite LC-MS /MS. При анализе биологических процессов, а также с 95% доверительного отсечения предела и р &ЛТ; 0,05, мы определили, что белки действительно были дифференцированно выражены. Результаты Результаты этих исследований представлены на рисунке 1. Большинство белков сверхвыражен в цитоплазме опухолевых клеток (Фигура 1А). Величина Р, включенных в анализ изобретательности указано в таблице S1. Эти белки были определены, связаны с клеточными процессами, такими, как гибель клеток, обмена веществ, клеточной организации, метаболизм ДНК, деградацию белков, и обработки РНК (Фиг.1В). Верхние канонические пути, связанные с этими целями и идентифицированные IPA, приведены в таблице S2.
<Р> Когда по сравнению с соответствующими родительскими клетками, 40 белков были повышающей регуляции в OCUM-12 /SP, и 35 белков были вверх -regulated в OCUM-2MD3 /SP. Среди этих белков, восемь были повышающей регуляции в обоих OCUM-12 /SP-клеток и OCUM-2MD3 /SP клеток, в то время как такой связи не наблюдалось между их соответствующими исходными клетками (таблица 2 и рис 1C). Из этих восьми белков, три белка, RBBP6, GLG1, и VPS13A, были независимо друг от друга обнаружены в обоих линиях SP клеток, но не в их соответствующих родительских клеток. Пять белков, DCTPP1, HSPA9, hspa4, ALDOA и KRT18, были значительно сверхэкспрессии по меньшей мере, в 1,2 раза в обеих SP клетках по сравнению с соответствующими родительскими клетками.
<Р> Уровень экспрессии мРНК из них 8 молекул-кандидатов, RBBP6, hspa4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
и CK18
был увеличен в OCUM-12 /SP (9,15 раза, 9,36 раза, 4,14 раза, 7,80 раза, 2,08 раза, 1,46 раза, 3,44 раза, и 1,99 раза, соответственно) и OCUM-2MD3 /SP (6,15 раза, 1,71 раза, 2,33 раза, 2,30 раза, 2,03 раза, 1,32 раза, 1,35 раза, и 1,31 раза, соответственно) клеток, по сравнению с таковыми контроля родительского OCUM-12 и клеток OCUM-2MD3 (рис 1D). Вестерн-блот-анализ показал, что уровень экспрессии RBBP6 и ALDOA была высокой в ​​ЦУМ-12 /SP и OCUM-2MD3 /SP клеток, по сравнению с тем, что OCUM-12 и OCUM-2MD3 клеток (рис S3).
<Р> сеть представлена ​​на рисунке 1E был сгенерирован IPA, а анализ зависит от ранее охарактеризованными и сообщенных белковых взаимодействий. Таким образом, RBBP6, наблюдавшийся быть чрезмерно выраженное в CSC-как SP клетки, OCUM-12 /SP клетки и /SP клетки OCUM-2MD3, была непосредственно связана с hspa4 и Rb, и косвенно связаны с Hsp90 и TAGLN2. Hspa4, Hsp90 и TAGLN2 также были признаны повышающей регуляции в CSC-как SP клетки.

Влияние siRBBP6 трансфекции на миграцию и инвазивные способности клеток рака желудка
<р> Рисунок 2А показывает, что си RBBP6
трансфекцией значительно сниженный уровень экспрессии мРНК обоих SP клеточных линий (OCUM-12 /SP составила 12%, р &л; 0,01, OCUM-2MD3 /SP составил 2,5% р &л;. 0,01), в сравнении с что негативно-миРНК трансфекции. RBBP6
миРНК нокдауна значительно уменьшил инвазии (рис 2B) и миграционной активности (рис 2С) обоих SP клеток.

Иммуногистохимическое Оценка кандидатов белков и их ассоциация с клинико-патологическими Особенности
<р> RBBP6, DCTPP1 и HSPA9 наблюдались в первую очередь выражается в цитоплазме и ядрах клеток рака желудка. наблюдались GLG1, VPS13A, HSPA9, hspa4, ALDOA и KRT18 быть в первую очередь выражается в цитоплазме (рис 3А). В нормальных эпителиальных клетках, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1 и экспрессии HSPA9 были обнаружены некоторые клетки эпителиального железы. KRT18 выражались в большинстве эпителиальных клеток. Hspa4 и экспрессия ALDOA не был найден в нормальных клетках. BBP6, DCTPP1 и HSPA9 были выражены в цитоплазме и ядрах нормальных эпителиальных клеток. GLG1, VPS13A, HSPA9 и KRT18 наблюдались в цитоплазме эпителиальных клеток (фигура 3В).
<Р> Мы исследовали связь между уровнем экспрессии восьми кандидатов белков и клинико-патологическими особенностями. Число случаев для каждого балла за восемь мишеней было показано в таблице S3. Эти восемь белков были определены, связаны с потенциально злокачественными процессами, такими как отдаленными метастазами, лимфатический узел (LN) метастаз, глубина инвазии, или этап продвижения (таблица 3). Вычисленные значения р были следующими: RBBP6 было в значительной степени связано с глубиной инвазии (р &л; 0,001), Л. Н. метастаз (р &л; 0,001), отдаленными метастазами (р = 0,013) и клинической стадии (р &л; 0,001); GLG1 был в значительной степени связано только с отдаленными метастазами (р = 0,045). VPS13A был в значительной степени связано с глубиной инвазии (р = 0,005), Л.Н. метастаз (р &л; 0,001), и стадии развития (р = 0,005); DCTPP1 был в значительной степени связано с глубиной инвазии (р &л; 0,001), Л.Н. метастаз (р &л; 0,001), отдаленных метастазов (р &л; 0,001), и стадии развития (р &л; 0,001); HSPA9 был в значительной степени связано с глубиной инвазии (р &л; 0,001), Л.Н. метастаз (р &л; 0,001), и стадии развития (р &л; 0,001); Hspa4 был в значительной степени связано с глубиной инвазии (р &л; 0,001), Л.Н. метастаз (р &л; 0,001), отдаленных метастазов (р = 0,007), и стадии развития (р &л; 0,001); ALDOA был в значительной степени связано с глубиной инвазии (р = 0,034), Л. Н. метастаз (р = 0,004), и стадии развития (р = 0,029); и KRT18 был в значительной степени связано с глубиной инвазии (р = 0,001), Л. Н. метастаз (р = 0,001), отдаленных метастазов (р = 0,034), и стадии развития (р = 0,004).

Прогноз
<р> графики Каплана-Мейера предположил, что из восьми сверхэкспрессии белков, RBBP6, DCTPP1, hspa4 и ALDOA, были в значительной степени связано с плохой выживаемости у всех пациентов (рисунок 4). Совокупное пятилетняя общая выживаемость RBBP6-положительных случаев (61%) было значительно меньше (р = 0,002), чем у RBBP6-отрицательных случаев (78%). Кроме того, у больных на стадии III, общая выживаемость RBBP6-положительных случаев было значительно меньше (р = 0,034), чем у RBBP6-негативных случаев. Прогноз пациентов с DCTPP1-положительных опухолей (63%) была значительно беднее (р = 0,016), чем у DCTPP1-негативных опухолей (75%). Пятилетняя общая выживаемость hspa4-положительных случаев (66%) было значительно меньше (р = 0,047), чем у hspa4-отрицательных случаев (75%). Пятилетняя общая выживаемость ALDOA-позитивных опухолей, проявляющих сверхэкспрессии (61%) была значительно беднее (р = 0,043), чем у ALDOA-негативных опухолей (72%). В отличие от этого, не было обнаружено достоверных корреляций между другими белками и выживаемости пациентов. После однофакторного анализа, уровни экспрессии RBBP6, DCTPP1, hspa4 и ALDOA были в значительной степени связано с плохим прогнозом в 300 рака желудка пациентов (таблица 4). Кроме того, макроскопический тип (тип 4), гистологический тип (диффузная), Т категории (T2-4), инвазию сосудов, инфильтрация образец (INF b, c), перитонеальный метастаз, и Л.Н. метастазирования определяли в значительной степени связаны с Неблагоприятный прогноз. Многофакторный анализ проводили с использованием модели пропорциональных рисков Кокса для всех значимых переменных в одномерном анализе. После завершения анализа, выражение RBBP6 (р = 0,023), борманновской типа 4 (р &л; 0,001), брюшина положительный (р = 0,001), Л. Н. метастаз (р = 0,003) и печеночных метастаз (р = 0,001) были подтверждены в качестве независимых факторов коррелирует с выживанием (таблица 3). Из восьми белков, экспрессия RBBP6 была независимым прогностическим фактором.

Обсуждение
<р> Желудочный рака приводит к неблагоприятным прогнозом из-за частых метастатических процессов, таких как Л.Н. метастазирования и перитонеального метастазирования [23]. ОКК были предложены как имеющие важную роль в злокачественном потенциале раковых клеток, в том числе и отдаленными метастазами и химиотерапевтических средств [4]. С тех пор мы обнаружили, что SP клетки, полученные из желудка субъектов рака обладают этими свойствами CSC [3]. Мы подтвердили, что СП клетки, используемые в этом исследовании маркеров экспресс-кандидат рак желудка стволовых клеток, включая CD44 [24], CD133 [25], и NANOG [26] (рис S2). Сфероида образование колоний активность этих клеток SP была выше, чем у родительских клеток [18]. Кроме того, эти CSC-подобные клетки SP отображать химическую устойчивость к противоопухолевым препаратам [2]. Эти результаты подтвердили, что OCUM-12 /SP клетки и /SP клетки OCUM-2MD3 могут представлять клеточноподобного свойства раковых стволовых. Так как специфические маркеры для желудка ЦОК не были опубликованы как еще, выяснение конкретных путей и механизмов, лежащих в основе действия ЦОК сигнализации может улучшить прогноз рака желудка. В этом исследовании, восемь кандидатов ОКК маркеры были идентифицированы с помощью протеомных методов с использованием LC-MS /MS в сочетании с технологией iTRAQ. Три белки, RBBP6, GLG1 и VPS13A, были обнаружены только в линиях SP клеток, но не в их родительским клеточных линий. Кроме того, пять белков, HSPA9, ALDOA, DCTPP1, hspa4, и KRT18, были чрезмерно выражены в обеих линиях SP клеток по отношению к их соответствующим родительским клеточных линий. ОТ-ПЦР анализ также показал, что уровень экспрессии RBBP6, hspa4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
и CK18
был высок в OCUM-12 /SP и OCUM- 2MD3 /SP, в сравнении с контролем материнской OCUM-12 и OCUM-2MD3. Эти белки были предположительно новые биомаркеры для желудка ЦОНов. Эта гипотеза была проверена с помощью иммуногистохимического анализа 300 случаев рака желудка.
<Р> RBBP6 является ядерный белок, который является как известно, связаны и потенциально связанных с р53, и ретинобластома связывания Q белка 1 (RBQ-1) [ ,,,0],27]. RBBP6 взаимодействует с белками-супрессоры опухолей р53 и Rb, и играет определенную роль в индукции апоптоза, а также регуляции клеточного цикла [28], [29]. RBBP6 связывается с белками p53 дикого типа, но не мутанты p53 [30]. Кроме того, было установлено, способствует связыванию MDM2 [31] Н. убиквитинлигаза Е3, который нацелен на р53 [32], и помешать его способности трансактивации генов-мишеней [33]. Повышающая регуляция RBBP6 была сильно коррелируют с опухолевой прогрессии при раке пищевода и рака шейки матки [32]. В этом исследовании, экспрессия RBBP6 была связана с категорией рака 'T' с относительно глубины инвазии, отдаленными метастазами, узел метастаза лимфатический и клинической стадии. Кроме того, экспрессия RBBP6 была в значительной степени связано с плохой выживаемости у пациентов на всех этапах, особенно на этапе III, что приводит к выводу, что RBBP6 был независимым фактором для выживания. Мы выполнили RBBP6
миРНК нокдаун RBBP6
гена с использованием OCUM-12 /SP клетки и /SP клетки OCUM-2MD3 в данном исследовании.

• PLoS ONE: Photoimmunotherapy рака желудка карциноматоз брюшины в Mouse Model
• PLoS Genetics: Мутации в зародышевой линии MAP3K6 связаны с наследственная Желудочный Cancer